鬼佬大哥大
  • / 19
  • 下載費用:30 金幣  

氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的應用.pdf

關 鍵 詞:
氫氣 飽和 生理鹽水 制備 防治 主動脈瘤 藥物 中的 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201210284612.9

申請日:

20120805

公開號:

CN103565822A

公開日:

20140212

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K33/00,A61K9/08,A61P9/14,A61P29/00,A61P39/06 主分類號: A61K33/00,A61K9/08,A61P9/14,A61P29/00,A61P39/06
申請人: 熊江
發明人: 熊江
地址: 100853 北京市海淀區復興路28號解放軍總醫院血管外科
優先權: CN201210284612A
專利代理機構: 代理人:
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201210284612.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的應用。動物實驗表明,腹腔注射氫氣飽和生理鹽水,不僅能改善炎癥細胞浸潤,減少炎癥介質釋放,還能減輕組織過氧化,增強抗氧化酶活性,進而減少血管壁蛋白水解酶的表達,抑制血管彈性纖維的降解,從而減輕血管損傷,抑制血管擴張,減小血管的最大外徑。氫氣生理鹽水制備過程簡單、使用方便、價格低廉、無毒副作用,從動物實驗的結果來看具有良好的防治優勢,所以,本發明開發了氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的新用途。

權利要求書

1.氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的應用。2.如權利要求1所述的應用,其特征在于,所述藥物制成注射劑或口服液劑。3.如權利要求1所述的應用,其特征在于,所述藥物有效劑量為5ml/kg/d。

說明書

技術領域

本發明涉及氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的應用。

背景技術

腹主動脈瘤(abdominal?aortic?aneurysms,AAA)實際上是一種因動脈血管壁退化變性而導致的動脈擴張性疾病,而非通常意義上的“腫瘤”,然而它對人體健康的威脅卻絕不亞于任何一種惡性腫瘤。近年來,全球腹主動脈瘤的發病率正在迅速攀升。在美國,腹主動脈瘤的發病率比30年前上升了7倍,達2%~7%,每年約有15000人因此而死亡,占疾病死因的第11位;在歐洲,自然人群腹主動脈瘤發病率為4.5%~5.9%,遠超過一般惡性腫瘤的發病率;在我國,隨著人口老齡化社會趨勢的到來和現代醫學診斷技術的進步,腹主動脈瘤的發病率已經達到2%,在過去的30年中增長了近3倍。腹主動脈瘤一旦發生其結果是逐漸增大并最終破裂,直徑超過5cm的腹主動脈瘤,年破裂率超過60%,在得到診斷的癥狀性腹主動脈瘤中,2年內自然破裂率達到50%,90%以上的破裂者發生猝死。

由于該病有很高的發病率和致死率,根據美國心臟病學會/美國心臟學會(ACC/AHA)臨床治療指南,腹主動脈瘤體直徑在5.0-5.5cm以上應予外科手術或血管腔內支架修復。相比之下,直徑<5.0cm的小腹主動脈瘤多呈緩慢擴張的趨勢,破裂的危險性小,而且早期行開腹或腔內修復對改善生存率并無益處,對于此類患者目前推薦的處理方法是定期影像學檢查監測瘤體直徑,一旦瘤體直徑達到5.0-5.5cm或瘤體擴張率>5mm/6月,才會實施選擇性修復術。顯然,這種建立在“觀察等待”基礎上的療法是不夠的。因此,明確腹主動脈瘤的發病機制并尋找一種更為積極的方法來穩定或延緩腹主動脈瘤的進展是當前血管性疾病研究的熱點與焦點。

在腹主動脈瘤發病機制研究中公認的相關病理過程包括:①主動脈壁慢性炎癥浸潤,伴隨新生血管生成和促炎因子表達;②瘤體組織過量表達基質金屬蛋白酶;③基質結構蛋白大量減少,主要是彈力蛋白和膠原蛋白;④血管中膜平滑肌細胞凋亡,使得結締組織修復能力下降。基于炎癥與氧化應激作用于腹主動脈瘤上述病理變化過程的證據,靶向炎癥反應和氧化應激效應中某些分子靶點的藥物治療策略已被認為是控制其進展的潛在途徑,而且有些藥物已經經過動物實驗的驗證,有的已進入臨床試驗階段。如大環內酯類和四環素類抗生素主要通過抑制包括白細胞粘附分子和趨化因子在內等炎癥介質表達,減少組織中以巨噬細胞為主的炎癥細胞浸潤來抑制腹主動脈瘤的發展;非甾體抗炎藥可抑制前列腺素E2的增加和環氧合酶的活性增強,從而抑制巨噬細胞活化,阻止腹主動脈瘤的形成發展;抗氧化劑可阻止自由基的產生或滅活自由基,消除自由基引起的血管壁損傷,進而減緩腹主動脈瘤的發展。上述藥物已經顯示出抑制腹主動脈瘤進展的潛在作用,但在其發揮治療作用的同時,不可避免的帶來一定副作用,因而人們一直致力于研究開發更有效更安全的防治腹主動脈瘤的藥物。

2007年,日本學者率先在《NAT?MED》報道,大鼠呼吸2%的氫氣能夠顯著改善腦缺血再灌注損傷,經過體外試驗證明,氫氣在溶液中可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子,而后兩者是導致細胞氧化損傷的最主要介質,目前體內尚未找到內源性特異性清除途徑。因此認為,氫氣治療腦缺血再灌注的基礎是選擇性抗氧化作用。于是,氫氣的治療效應迅速引起廣泛關注,并掀起了研究氫氣治療疾病的熱潮。隨后研究發現,氫氣對炎癥性疾病也具有治療作用,其作用機制是下調炎癥介質表達,抑制炎癥細胞浸潤活化,從而減輕炎癥損傷,改善預后。鑒于炎癥和氧化應激是腹主動脈瘤形成的重要啟動和促進因素以及氫氣的抗炎、抗氧化作用,我們猜測氫氣具有防治腹主動脈瘤的潛在功能。而且與傳統藥物相比,氫氣應用于醫藥技術領域有非常鮮明的優勢:首先,氫氣還原性弱,只與活性強和毒性強的自由基反應,而對其它具有重要生物學功能、毒性和活性較低的自由基影響不大,此即氫氣的選擇性抗氧化作用。其次,氫氣是一種小分子,可以非常容易地擴散到其它藥物難以到達的器官、細胞和細胞器,甚至在血運重建前到達組織損傷部位,發揮生物學效應。再次,人和動物胃腸道內正常菌群每天都在產生氫氣,可以被機體吸收代謝,而通過呼吸或飲用或注射攝取的外源性氫氣,其組織相容性好,安全,副作用少,即使過量,也能通過呼吸排出體外,沒有殘留。最后,氫氣資源豐富、制備方便、價格低廉、無毒環保。氫氣的這些優點為氫氣的科學研究和臨床應用奠定了堅實的基礎,故本研究我們選用腹主動脈瘤模型動物研究了氫氣對腹主動脈瘤的保護作用及可能的機制。

目前用于腹主動脈瘤機制研究的模型多為中外膜損傷模型,如基因缺陷誘導法、彈力酶灌注法、氯化鈣孵育法等。基因缺陷誘導法對動物的飼養、繁殖條件要求嚴格,且來源有限,對開展實驗研究有一定限制。彈力酶灌注法和氯化鈣孵育法相對簡便、快速、穩定,現已被廣泛應用。在氯化鈣模型,造成血管損傷的始動因素是高濃度的鈣離子,高濃度鈣離子可以導致血管局部細胞應激反應和壞死,壞死的細胞釋放大量內源性物質,導致持續性的炎癥反應,動脈擴張從炎癥應答就開始。而彈力蛋白酶模型依賴的是一個初始的灌注壓介導的機械性損傷,繼發炎性損傷,這個模型模擬了動脈瘤的生長而不是初始。由于我們研究的是氫氣對腹主動脈瘤發生發展的影響,故血管旁孵育高濃度氯化鈣誘發的腹主動脈瘤模型是本研究最好的模式生物。

中國專利公開號CN101347451A公開了一種含氫注射液。該發明已被證明可用于治療心、腦、腎等組織器官缺血再灌注損傷(中國專利公開號CN101347451A)和高脂血癥疾病(中國專利公開號CN102210701A)。但是關于氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的應用目前還未見相關報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足,提供一種氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的新用途。

為實現上述目的,本發明采取的技術方案是:

氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的應用。

所述藥物需將氫氣加壓助溶于無菌生理鹽水達到飽和水平,分裝制成注射劑或口服液劑等常規劑型(具體實施步驟參見具體實施方式三)。所用氫氣飽和生理鹽水均為1周內配置,維持氫氣濃度不低于0.6mM。

根據實驗大鼠有效劑量推算,所述氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的有效劑量約為5ml/kg/d。

選取體重200~220g的SD雄性大鼠作為實驗對象,按體重隨機分成四組,室溫22~26℃下飼養,自由進食進水,12小時光照/黑暗,每天按測得體重給藥。其中,模型組大鼠經腹主動脈旁孵育0.5mol/L?CaCl2后,持續4周腹腔注射生理鹽水(5ml/kg/d)。氫氣預防組經腹主動脈旁孵育0.5mol/L?CaCl2后,持續4周腹腔注射氫氣飽和生理鹽水(5ml/kg/d)。氫氣治療組在給予0.5mol/L?CaCl2建模后,先腹腔注射生理鹽水2周,再腹腔注射氫氣飽和生理鹽水2周。另一組大鼠,腹腔注射生理鹽水4周,作為陰性對照組。

需要說明的是:將氯化鈣局部應用于大鼠腎下腹主動脈,2周后有顯著的動脈擴張,4周后動脈瘤開始回縮,所以上述的治療時間點和處死時間點分別選在造模后2周和4周。

應用對照金屬桿(直徑0.81mm)平行放置于血管旁,作為參照,進行拍照,使用Image-ProPlus?6.0專業分析軟件測量腎下腹主動脈直徑,由至少2名合格但并不知曉實驗分組的工作人員獨立完成測量,至少取20個不同的橫截面進行測量,最后求得最大直徑進行統計學分析,以實驗前后腹主動脈最大直徑增加大于50%為診斷腹主動脈瘤的標準。利用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察血管結構、血管損傷程度、炎癥細胞浸潤程度。利用醛品紅法(彈力纖維的特殊染色方法)觀察彈力纖維的破壞和降解。利用酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒分別檢測瘤壁組織中白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度。利用分光光度法檢測瘤壁組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。利用基質金屬蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)免疫組化染色定性觀察瘤壁表達,利用實時定量PCR(Real-time?PCR)法檢測瘤壁組織MMP-2mRNA、MMP-9mRNA、趨化素樣因子-1(CKLF-1)mRNA的表達水平。

結論:

(1)腹腔注射氫氣飽和生理鹽水能抑制血管擴張,減小腹主動脈瘤的最大直徑。

(2)腹腔注射氫氣飽和生理鹽水能減少血管壁蛋白水解酶的表達,抑制血管彈力纖維的降解。

(3)腹腔注射氫氣飽和生理鹽水能改善炎癥細胞浸潤,減少炎癥介質釋放,減輕炎癥損傷。

(4)腹腔注射氫氣飽和生理鹽水能減輕組織過氧化,增強抗氧化酶活性,減輕氧化應激。

本發明有益效果主要體現在:提供了氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的新應用。氫氣,能有效預防腹主動脈瘤的發生,延緩腹主動脈瘤的進展,同時又具有抗炎、抗氧化的功效,是一種應用前景廣闊的防治藥物。

附圖說明

圖1為代表性的血管大體圖顯示氯化鈣孵育后4周,腹主動脈形成明顯的動脈瘤,而氫氣飽和生理鹽水預防性地給藥減少動脈瘤的形成,治療性給藥抑制動脈瘤的進行性發展。

圖2為對血管最大直徑進行定量學分析顯示,在血管旁孵育高濃度氯化鈣,在4周可以形成明顯的腹主動脈瘤,證明建模成功;在血管旁孵育氯化鈣的同時給予氫氣飽和生理鹽水進行預防性給藥,能夠明顯抑制血管擴張,減少動脈瘤的形成;而在2周后,給予氫氣飽和生理鹽水治療,也能夠減小血管的最大直徑,抑制動脈瘤的進行性發展;數據表示為*P<0.05,**P<0.01。

圖3為氯化鈣損傷后4周不同處理組腹主動脈瘤特征性的組織病理學分析,血管橫切面做HE染色顯示,氫氣飽和生理鹽水能夠抑制炎性細胞浸潤,減輕血管的損傷,保護血管結構的相對完整。

圖4為醛品紅(彈力纖維的特殊染色方法)染色顯示氫氣飽和生理鹽水能夠減少彈力纖維的破壞和降解。

圖5為免疫組化染色顯示在氯化鈣損傷后4周,氫氣飽和生理鹽水能夠抑制血管組織局部MMP-2的表達。

圖6為對動脈組織中基質金屬蛋白酶MMP-2mRNA進行定量學分析顯示,氫氣飽和生理鹽水能夠抑制血管組織MMP-2mRNA的表達;數據表示為*P<0.05,**P<0.01。

圖7為免疫組化染色顯示在氯化鈣損傷后4周,氫氣飽和生理鹽水能夠抑制血管組織局部MMP-9的表達。

圖8為對動脈組織中基質金屬蛋白酶MMP-9mRNA進行定量學分析顯示,氫氣飽和生理鹽水能夠抑制血管組織MMP-9mRNA的表達;數據表示為*P<0.05,**P<0.01。

圖9為對動脈組織中IL-1β進行定量學分析顯示,氫氣飽和生理鹽水能夠減少血管組織IL-1β含量;數據表示為*P<0.05,**P<0.01。

圖10為對動脈組織中TNF-α進行定量學分析顯示,氫氣飽和生理鹽水能夠減少血管組織TNF-α含量;數據表示為*P<0.05,**P<0.01。

圖11為對動脈組織中CKLF-1mRNA進行定量學分析顯示,氫氣飽和生理鹽水能夠抑制預防組血管組織CKLF-1mRNA的表達,不影響治療組的表達;數據表示為*P<0.05,**P<0.01。

圖12為對動脈組織中MDA進行定量學分析顯示,氫氣飽和生理鹽水能夠減少血管組織MDA含量;數據表示為*P<0.05,**P<0.01。

圖13為對動脈組織中SOD進行定量學分析顯示,氫氣飽和生理鹽水能夠增加治療組血管組織SOD含量,不影響預防組含量;數據表示為*P<0.05,**P<0.01。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護范圍并不僅限于此:

實施例1:

(一)實驗分組

選取體重200~220g的SD雄性大鼠40只(軍事醫學科學院動物中心)作為實驗對象,按體重隨機分成四組,每組10只,室溫22~26℃下飼養,自由進食進水,12小時光照/黑暗,每天按測得體重給藥。其中,模型組大鼠經腹主動脈旁孵育0.5mol/L?CaCl2(國藥集團化學試劑北京有限公司)后,持續4周腹腔注射生理鹽水(5ml/kg/d)。氫氣預防組經腹主動脈旁孵育0.5mol/L?CaCl2后,持續4周腹腔注射氫氣飽和生理鹽水(5ml/kg/d)。氫氣治療組在給予0.5mol/L?CaCl2建模后,先腹腔注射生理鹽水(5ml/kg/d)2周,再腹腔注射氫氣飽和生理鹽水(5ml/kg/d)2周。另一組大鼠,腹腔注射生理鹽水(5ml/kg/d)4周,作為陰性對照組。

(二)模型建立

大鼠腹主動脈瘤模型制備采用經典的腹主動脈旁孵育0.5mol/L?CaCl2方法。200~220g雄性SD大鼠,戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑北京有限公司)麻醉(300mg/kg,腹腔注射)后,仰臥位固定。碘伏消毒,取腹部正中切口,上至界劍突下1cm,向下延續長5cm,逐層剪開皮膚、皮下組織、腹膜,暴露腹腔臟器。探查腹腔內臟器無異常。將腸管輕柔向右推出腹腔,置于生理鹽水潤濕的紗布塊上,其上覆蓋生理鹽水濕潤紗布。觀察腹膜后血管形態有無異常。以鹽水棉簽鈍性分離腹主動脈前壁及側壁結締組織,顯露腎下至髂動脈分叉的腹主動脈,期間注意保護輸尿管。將浸泡于0.5mol/L?CaCl2溶液的棉花塊放置于游離的腹主動脈上方,15min后移除棉花塊。用消毒紗布小心吸干腹腔殘留的CaCl2溶液,并用無菌生理鹽水沖洗周圍的組織,以減少其對周圍組織的損傷。仔細檢查并止血,觀察腸管顏色正常后將其復位,逐層關腹。4周實驗結束后,大鼠再次麻醉開腹,分離取出腹主動脈組織,部分浸泡于含10%福爾馬林的溶液中,組織固定。其余-80℃冰凍保存。

(三)氫氣飽和生理鹽水的制備

在0.5MPa壓力下加壓暴露4小時,將純氫氣溶解在無菌生理鹽水中至飽和狀態,分裝到排除氣體的醫用密封軟包裝袋中,常壓4℃保存備用。

(四)腹主動脈直徑的定量檢測

實驗前(第一次開腹)和實驗終點(二次開腹)時應用對照會屬桿(直徑0.81mm)平行放置于血管旁,作為參照,進行拍照,使用Image-Pro?Plus?6.0專業分析軟件測量腎下腹主動脈直徑,由至少2名合格但并不知曉實驗分組的工作人員獨立完成測量,至少取20個不同的橫截面進行測量,最后求得最大直徑。以實驗前后腹主動脈最大直徑增加大于50%為診斷腹主動脈瘤的標準。根據第二次開腹測量結果,比較四組間大鼠腹主動脈最大直徑。

(五)組織染色

福爾馬林固定完全的動脈組織標本制成常規石蠟切片,厚約5μm,分別行常規HE染色;用醛品紅染液行彈力纖維的特殊染色,其中彈力纖維染成紫色;MMP-2及MMP-9免疫組織化學染色(兔源MMP-2多克隆抗體、鼠源MMP-9單克隆抗體,規格:1.0mg/ml,英國Abcam公司),以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照,DAB顯色,陽性表現為細胞質、細胞膜或細胞核上有棕褐色顆粒樣沉淀。在100倍和400倍顯微鏡下觀察兩組血管結構、血管損傷程度、炎癥細胞浸潤程度,彈力纖維的破壞和降解,血管壁MMP-2、MMP-9表達情況等。

(六)組織蛋白定量檢測

取腹主動脈組織,用冰冷的生理鹽水漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,放入已洗干凈的組織勻漿器中,然后按體積重量比為1∶9的比例量取預冷的生理鹽水,移入組織勻漿器中,充分研磨,使組織勻漿化,然后將勻漿轉移到5ml的離心管中,4℃下4000rpm/min離心10min,將離心好的勻漿留上清棄下面沉淀,即得到10%腹主動脈組織勻漿。以酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(MultiSciences公司)定量檢測腹主動脈組織上清液中的IL-1β和TNF-α的含量。以分光光度法,參照(南京建成生物工程研究所)試劑盒的使用說明,檢測腹主動脈組織上清液中的MDA、SOD含量。

(七)實時熒光定量PCR檢測

1.設計引物序列

見第9頁(末頁)

2.實驗步驟

取腹主動脈組織提取總RNA,提取采用Trizol試劑,按試劑盒(Qiagen,德國)說明進行。在實時檢測擴增儀上擴增并檢測熒光。反應體系見下表

內參照GAPDH的反應體系相同。反應條件:95℃預變性2min,以95℃20s變性,59℃25s復性,72℃30s延伸,同時檢測熒光進行45個循環。以各組2-ΔΔCT為MMP-2、MMP-9、CKLF-1基因的相對量。

(八)統計學分析

實驗結果用均值±標準差表示,使用chiss專業統計軟件,對預防以及治療不同實驗處理組采用單因素方差分析,當方差分析結果為多組間差異具有統計學意義時,再用SNK-q檢驗進行多重比較。P<0.05認為有統計學差異。

(九)實驗結果見圖1~圖13

(十)實驗結論:

(1)腹腔注射氫氣飽和生理鹽水能抑制血管擴張,減小腹主動脈瘤的最大直徑(預防組從3.35mm降到2.22mm,治療組從3.35mm降到2.64mm)。

(2)腹腔注射氫氣飽和生理鹽水能減少血管壁蛋白水解酶的表達(MMP-2mRNA:預防組從11.79降到2.40,治療組從11.79降到6.02;MMP-9mRNA:預防組從6.74降到2.88,治療組從6.74降到4.52),抑制血管彈力纖維的降解。

(3)腹腔注射氫氣飽和生理鹽水能改善炎癥細胞浸潤,減少炎癥介質釋放(IL-1β:預防組從164.83pg/ml降到81.22pg/ml,治療組從164.83pg/ml降到113.79pg/ml;TNF-α:預防組從359.61pg/ml降到109.07pg/ml,治療組從359.61pg/ml降到245.43pg/ml;CKLF-1mRNA:預防組從4.56降到2.34,治療組表達不受影響),減輕炎癥損傷。

(4)腹腔注射氫氣飽和生理鹽水能減輕組織過氧化(MDA:預防組從4.95U/mg降到1.36U/mg,治療組從4.95U/mg降到2.93U/mg),增強抗氧化酶活性(SOD:治療組從71.56U/ml升到84.94,預防組不受影響),減輕氧化應激。

設計引物序列

GAPDH?575bp

上游:5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′

下游:5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′

MMP-2?217bp

上游:5′-GCTGATACTGACACTGGTACTG-3′

下游:5′-CAATCTTTTCTGGGAGCTC-3′

MMP-9?280bp

上游:5′-AAGGATGGTCTACTGGCAC-3′

下游:5′-AGAGATTCTCACTGGGGC-3′

CKLF-1?85bp

上游:5′-CGCACGCGCGTCTGGACTTA-3′

下游:5′-TGCTCTCCAGGACTCGCGCA-3′

關于本文
本文標題:氫氣飽和生理鹽水在制備防治腹主動脈瘤藥物中的應用.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6944064.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大