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雙酮類化合物FLBG1108或者其藥用鹽在制備抗癌藥物中的應用.pdf

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酮類 化合物 FLBG1108 或者 藥用 制備 抗癌 藥物 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310093728.9

申請日:

20111028

公開號:

CN103263409B

公開日:

20140716

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/352,A61P35/00 主分類號: A61K31/352,A61P35/00
申請人: 深圳市仙湖植物園管理處
發明人: 馮世秀,陳濤
地址: 518004 廣東省深圳市羅湖區蓮塘仙湖路160號
優先權: CN201310093728A
專利代理機構: 廣州科粵專利商標代理有限公司 代理人: 劉明星
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310093728.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108或者其藥用鹽在制備抗癌藥物中的應用。本發明通過實驗發現,雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108對人非小細胞肺癌H520、A549、H549、1299,人乳腺癌細胞MCF7,人前列腺癌細胞PC3、LNcaP、DU145,人腸癌細胞SW480、HT-2P的增殖有明顯的抑制作用,可選擇性的抑制人肺癌細胞H520的增殖,并呈現出較好的時間和濃度依賴性,作用48h的IC50值為2.90μM,此濃度對正常的腎表皮細胞不表現細胞毒作用。進一步發現,雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108能夠有效的誘導肺癌細胞H520的凋亡,阻止癌細胞增殖,而且不表現出毒性,且能夠特異性的將肺癌細胞H520的細胞周期阻斷在S期,抑制了癌細胞的增殖。因此可以開發成為具有抗癌作用,尤其是抗肺癌作用的新型候選藥物。

權利要求書

1.式(I)所示的雙酮類化合物或者其藥用鹽在制備抗癌藥物中的應用,該雙酮類化合物抑制人乳腺癌細胞MCF7、人前列腺癌細胞LNcaP、DU145、人腸癌細胞SW480或HT-2P的增殖

說明書

本發明專利申請是專利申請號:201110333543.1,發明名稱為:雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108或者其藥用鹽在制備抗癌藥物中的應用的分案申請,其申請日為:2011年10月28日。?

技術領域:

本發明屬于藥物化合物領域,具體涉及一種天然植物來源的雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108或者其藥用鹽在制備抗癌藥物,尤其是在制備抗肺癌藥物中的應用。?

背景技術:

近年來,癌癥已逐步上升成為威脅人類生命的第二大疾病。在諸多癌癥中,肺癌的發病率一直居高不下,并呈逐年上升的趨勢。目前臨床上用于治療肺癌的多為廣譜抗癌藥物,大多屬于細胞毒素類藥物,像通過影響癌細胞DNA結構與功能的環磷酰胺、順鉑、絲裂霉素、鬼臼毒素衍生物等;通過干擾癌細胞RNA的轉錄過程和阻止RNA合成的蒽環類藥物,如多柔比星;還有通過抑制癌細胞蛋白質的合成與功能的植物源抗癌藥物,如長春堿和紫杉醇等。然而,在這眾多的抗癌藥物中,具有選擇性的抗癌藥物卻十分罕見。而且,目前使用的廣譜抗癌藥物具有不同程度的毒、副作用,在化療的過程中造成病人身體虛弱、脫發、嘔吐、腸胃不適,以及神經系統疾病等。?

植物源藥物以其復雜多樣的結構,表現出奇特的生物活性,在臨床使用中具有出類拔萃的表現。從天然植物中尋求具有較好生物活性的天然產物已經是生物學界以及藥物研發企業所公認的事實。全世界的科學家都在不同程度的從植物中尋求針對各類疾病的特效植物藥,也有許多意外的發現和收獲。此類藥物對人體毒性較低,結構奇特,是合成化學中很難實現?的。因此,從這些天然產物中篩選抗癌藥物具有廣闊的空間,也有很大的可行性。?

Xanthone類化合物是一類十分廣泛存在于自然界的化合物,以藤黃屬植物較為突出,此類化合物大多具有很好的抗氧化作用,尤其以富含xanthone的水果之后“山竺”著稱。研究標明,xanthone類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒等生物活性,部分化合物被開發為降壓藥,抗血栓等藥物。目前已經成功研究出來的抗癌天然xanthone類藥物有Gambogic?acid,以及抗白血病的藥物Psorospermin,以xanthone母核為基礎,合成和衍生出來的藥物還包括Thioxanthones,Epoxyxanthones,Acylxanthones,Bisxahnthones,Bisfuranoxanthones,Extended?xanthones,Oxygenated?xanthones,Imidazolyxanthones等。?

雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108,其結構如式(I)所示,是從藥用植物嶺南山竹子(Garcinia?oblongifolia?Champ)樹皮的90%乙醇提取物中分離得到的,分子量為652,純度≥97%。其化學結構采用核磁共振(1H?NMR,13C?NMR,HSQC,HMBC,NOESY)、高分辨質譜(HRESI-MS)等現代波譜技術進行鑒定,并與現有文獻報道的化合物Griffipavixanthone的圖譜數據進行對比確認。嶺南山竹子樹皮采自廣東省肇慶市鼎湖山,由深圳市中科院仙湖植物園陳濤教授鑒定,樣品保存于仙湖植物園標本館(N.2008100801)。參考文獻:Yuan-Jian?Xu,Shu-Geng?Cao,Xiao-Hua?Wu,Yee-Hing?Lai,B.H.K.Tan,J.T.Pereira,S.H.Goh,Ganapathi?Venkatraman,Leslie?J.Harrison,and?Keng-Yeow?Sim.Griffipavixanthone,a?novel?cytotoxic?bixanthone?from?garcinia?griffithii?and?G.pavifolia.Tetrahedron?letters,1998,39:9103-9106。?

式(I)?

發明內容:

本發明的第一個目的是提供如式(I)所示的雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108或者其藥用鹽在制備抗癌藥物中的應用。?

本發明通過體外抗腫瘤活性篩選,證明雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108對人非小細胞肺癌H520、A549、H549、1299,人乳腺癌細胞MCF7,人前列腺癌細胞PC3、LNcaP、DU145,人腸癌細胞SW480、HT-2P的增殖有明顯的抑制作用。對人肺癌細胞H520,人前列腺癌細胞DU145和LNCaP,人腸癌細胞SW480和HT-29,人乳腺癌細胞MCF-7有較好的抑制作用,其半數抑制濃度(IC50值)在2.9~6.7μM之間,而對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用不明顯。雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108可選擇性的抑制人肺癌細胞H520的增殖,并呈現出較好的時間和濃度依賴性,作用48h的IC50值為2.90μM,此濃度對正常的腎表皮細胞不表現細胞毒作用。進一步通過雙染法檢測凋亡,實驗結果證明,在給藥濃度分別為3.125,6.25,12.5μM時,FLBG-1108能夠有效的誘導肺癌細胞H520的凋亡,阻止癌細胞增殖,而且不表現出毒性。同時,細胞周期實驗結果表明,FLBG-1108能夠特異性的將肺癌細胞H520的細胞周期阻斷在S期,抑制了癌細胞的增殖。由上述結果表明,雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108具有選擇性抑制肺癌細胞增殖的作用,且這種作用是通?過誘導凋亡和阻斷細胞周期來實現的,具有選擇性強,抗癌作用明確,毒副作用小的特性,可以開發成為具有抗肺癌作用的新型候選藥物。?

因此本發明的雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108或者其藥用鹽可應用于制備抗癌藥物,尤其是抗肺癌藥物。?

本發明的第二個目的是提供一種抗癌藥物,其含有有效量的作為活性成分的雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108或者其藥用鹽。該抗癌藥物可以為純化合物FLBG-1108或者其藥用鹽,或者為化合物FLBG-1108或者其藥用鹽,和藥學上可接受的載體或其它藥理學活性化合物組成的藥物組合物。?

所述的抗癌藥物可制成藥學可接受的劑型,如片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、溶液劑、混懸劑或乳劑。?

本發明的雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108能抑制多種癌細胞的增殖,特別是具有選擇性抑制肺癌細胞增殖的作用,且這種作用是通過誘導凋亡和阻斷細胞周期來實現的,具有選擇性強,抗癌作用明確,毒副作用小的特性,可以開發成為具有抗癌作用,尤其是抗肺癌作用的新型候選藥物。?

附圖說明

圖1是FLBG-1108體外抑制腫瘤細胞及正常腎表皮細胞增殖實驗結果;?

圖2是FLBG-1108抑制肺癌細胞H520增殖的時間和濃度曲線圖;?

圖3是FLBG-1108誘導肺癌細胞H520凋亡圖;?

圖4是FLBG-1108控制肺癌細胞H520的細胞周期在S期。?

具體實施方式:

為進一步闡明本發明的價值和意義,以下結合實施例對本發明做進一步的說明,但并非對本發明的限制。?

一、雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108的制備?

嶺南山竹子(Garcinia?oblongifolia?Champ)的樹皮(4kg)于60°C烘箱中烘干后粉碎,用20L體積分數為90%的乙醇水溶液在常溫下浸提2次,每次48小時,合并乙醇提取液并減壓濃縮得總粗提浸膏300g。所得浸膏用1000mL水溶解使成懸浮液,再依次用等體積的石油醚和乙酸乙酯分別萃取4次。合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮后得乙酸乙酯部110g。乙酸乙酯萃取部經常壓硅膠(200-300目)柱色譜層析,以氯仿-甲醇為洗脫劑,從體積比95:5到60:40進行梯度洗脫,用薄層層析檢測合并相同組分,所用展開劑依次為體積比氯仿-丙酮3:1,以及氯仿-甲醇10:1,氯仿-甲醇-水100:11:1,和氯仿-甲醇-水100:23:3。用薄層層析檢測合并相同組分,所得組分依次可用氯仿-丙酮體積比為3:1,以及氯仿-甲醇體積比為10:1,氯仿-甲醇-水體積比為100:11:1,氯仿-甲醇-水100:23:3展開,分為四個個組分。在薄層層析中能用氯仿-甲醇-水體積比為100:23:3:溶液系統展開的組分,經反相硅膠(75μ)柱層析,75%的甲醇-水洗脫,得白色粉末狀化合物1(65mg),該化合物經結構分析鑒定,其光譜學數據如下:分子式為C36H28O12,ESIMS:m/z653[M+H]+,675[M+Na]+,651[M–H]–。1HNMR(400MHz)和13CNMR(100MHz)數據見表1,與參考文獻Yuan-Jian??Xu,Shu-Geng?Cao,Xiao-Hua?Wu,Yee-Hing?Lai,B.H.K.Tan,J.T.Pereira,S.H.Goh,Ganapathi?Venkatraman,Leslie?J.Harrison,and?Keng-Yeow?Sim.Griffipavixanthone,a?novel?cytotoxic?bixanthone?from?garcinia?griffithii?and?G.pavifolia.Tetrahedron?letters,1998,39:9103-9106的數據一致,由此鑒定其結構如式(Ⅰ)所示,即為雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108(griffipavixanthone)。?

式(Ⅰ)?

表1.FLBG-1108的1H和13C?NMR數據?

二、雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108的活性?

實施例1:?

雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108的抗腫瘤活性?

本發明采用體外細胞毒實驗,通過檢測離體培養人癌細胞中在不同濃度的FLBG-1108作用48h后的存活率,來測定化合物FLBG-1108的抗腫瘤活性。?

選取的腫瘤細胞株有:人非小細胞肺癌H520、A549、H549、1299,人肝癌細胞HepG2,人乳腺癌細胞MCF7,人前列腺癌細胞PC3、LNcaP、DU145,人腸癌細胞SW480、HT-2P。采用MTT法(參考文獻Mosmann?T.Rapid?colorimetric?assay?for?cellular?growth?and?survival-application?to?proliferation?and?cytotoxicity?assays.J?Immunol?Methods,1983,65(1-2),55-63.)來測定每種腫瘤細胞的存活率(或死亡率)為50%時的半抑制濃度IC50。正常細胞選用人腎表皮細胞HKC-8作對照。?

在590nm下,用酶標儀測定各孔的OD值。?

腫瘤細胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD值/細胞對照組OD值)]×100%?

以抑制率為縱坐標,藥物濃度的對數lgC為橫坐標作圖,計算IC50值。?

FLBG-1108對各腫瘤細胞株的半數抑制濃度(IC50,μM)如表2所示。表2數據顯示,?本發明的雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108對所測定的10種人癌細胞株的增殖有明顯的抑制作用,對人肺癌細胞H520,人前列腺癌細胞DU145和LNCaP,人腸癌細胞SW480和HT-29,人乳腺癌細胞MCF-7有較好的抑制作用,其半數抑制濃度(IC50值)在2.9~6.7μM之間,而對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用不明顯。選用人正常腎表皮細胞測定FLBG-1108對正常細胞的細胞毒作用,結果表明該化合物對正常細胞的細胞毒性較弱(IC50=18.1μM),在對癌細胞有效抑制濃度下對正常細胞不表現出細胞毒作用,證明該化合物是安全、低毒的。MTT抗癌活性結果表明,FLBG-1108對人肺癌細胞H520增殖的抑制活性最強,其IC50值為2.9μM。?

表2:FLBG-1108的體外細胞毒活性實驗結果(IC50μM)?

注:-表示IC50>25μM;--表示無法測定結果,促進癌細胞生長。?

實施例2?

雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108的選擇性抑癌作用?

測試方法(MTT)與實施例1相似,采用同樣的人癌細胞株和正常腎表皮細胞,FLBG-1108的給藥濃度設定為3.125,6.25,12.5μM三個濃度梯度,與各種細胞混合培養48h后測定細胞的存活率。?

進一步采用三個濃度梯度(3.125,6.25,12.5μM)測定FLBG-1108對各種癌細胞的選擇性抑制作用,結果如圖1所示。雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108對于測定的人肺癌細胞H520,H549,1299,A549的增殖均表現抑制作用,但對人肺癌細胞H520表現出明顯的選擇性抑制作用,在三種作用濃度下,其抑制率隨著作用濃度的增加而逐漸增強,其抑制程度明顯強于對其它癌細胞的作用。?

實施例3?

雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108抑制肺癌細胞H520生長的劑量-效應關系?

方法與實施例1相似,主要采用人肺癌細胞株H520測定,給藥濃度設定為0.34,0.78,1.56,3.12,6.25,12.5,25.0μM七個濃度梯度,藥物與癌細胞H520混合培養24h,48h,72h后分別測定癌細胞的存活率。?

FLBG-1108的抑制肺癌細胞H520生長的劑量-效應關系如圖2所示,結果表明雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108對肺癌細胞H520作用24h時,抑制活性較弱,而在作用48h和72h小時后其抑制活性明顯增強,呈現出很好的濃度和時間依賴效應。尤其是作用48h和72h后,對肺癌細胞H520增殖的抑制有很好的線性關系。?

實施例4?

雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108誘導肺癌細胞H520凋亡?

采用Annexin?V-PE/7AAD雙染法測定FLBG-1108誘導肺癌細胞H520凋亡。具體方法是:將生長狀況良好的H520細胞接種至6孔板中(25cm2),細胞培養過夜后,棄培養液,加入含不同濃度(3.12,6.25,12.5μM)FLBG-1108的培養液繼續在培養箱中培養24h。然后加入0.25%的胰酶消化液消化細胞,收集所有細胞及培養液,4°C,1000rpm離心5分鐘,棄上清,細胞沉淀重懸于400μL緩沖液(Binding?Buffer)中(含Annexin?V-PE和7-AAD),避光染色15min,然后采用流式細胞儀測定(FACS?cytometry)。?

注解:Annexin?V-PE是用來檢測細胞的早期凋亡的。處于早期凋亡的細胞被PE染色,進入流式細胞儀后,染色的細胞出現在圖像中的第四(Q4)和第二(Q2)象限。7-AAD是用來檢測細胞的晚期凋亡和死細胞。處于晚期凋亡或已經死亡的細胞被7-AAD染色,進入流式細胞儀后,染色的細胞出現在圖像中得第一(Q1)和第二(Q2)象限。流式細胞儀圖像的各個象限顯示的數字是處于這個象限的細胞數占所有細胞的百分數(%)。?

Annexin?V-PE/7AAD雙染檢測凋亡實驗結果如圖3所示,結果證明,雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108能夠有效的誘導肺癌細胞H520凋亡,在三個作用濃度下,早期凋亡細胞比率從對照組(未加藥)的4.1%上升至11.9%,增加了近三倍;晚期凋亡的細胞數從1.3%增加到4.0%,上升比率也近三倍。而死亡細胞數據并無明顯的變化,5.5%~5.0%。由此證明了FLBG-1108能夠有效的誘導肺癌細胞H520的凋亡,最終抑制癌細胞增殖,毒性很小。?

實施例5?

雙酮(bixanthone)類化合物FLBG-1108阻斷肺癌細胞H520細胞周期?

采用PI/7AAD雙染法測定FLBG-1108對肺癌細胞H520細胞周期的影響。具體方法是:將生長狀況良好的H520細胞接種至6孔板中(25cm2),細胞培養過夜后,棄培養液,加入含不同濃度(3.12,6.25,12.5μM)FLBG-1108的培養液繼續在培養箱中培養24h。0.25%的胰酶消化液消化細胞,收集所有細胞及培養液,4°C,1000rpm離心5分鐘,棄上清,細胞沉淀重懸于70%的冰乙醇500μL中,固定細胞過夜。離心4°C,1000rpm,棄乙醇液,以終濃度為80μg/ml的RNAse在37°C下消化細胞30min,再加入終濃度為40μg/mL的PI(propidium?iodide),4°C避光染色30min,最后采用流式細胞儀(FACS?cytometry)測定處于各個細胞周期的細胞數。?

注解:RNAse:是一種蛋白酶,主要用于降解RNA,避免PI在染色DNA時同時也染色RNA,造成實驗結果的干擾。PI:是一種染色劑,能夠與細胞的DNA結合在一起。流式細胞儀通過檢測細胞的DNA含量來區分細胞所處的細胞周期。?

細胞周期實驗結果如圖4所示,在三種作用濃度下,FLBG-1108能夠有效的將肺癌細胞H520的細胞周期阻斷在S期。隨著給藥濃度的增加,S期的細胞數比率從20.0%增加到27.2%,而相對應的G2/M期的細胞數則從12.0%下降至9.9%,表明細胞周期明顯的停滯在S期。這也是目前臨床抗癌藥物中所沒有的特性,在眾多抗癌藥物中屬于重大發現。?

以上實施例僅用于說明本發明的技術方案,而非對本發明保護范圍進行限制。?

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本文標題:雙酮類化合物FLBG1108或者其藥用鹽在制備抗癌藥物中的應用.pdf
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