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一種具有抗低氧應激功能的復方制劑.pdf

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一種 具有 低氧 應激 功能 復方 制劑
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申請專利號:

CN201310477123.X

申請日:

20131012

公開號:

CN103565873B

公開日:

20160309

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/28,A61P39/00,A61K31/352,A61K31/375,A61K31/201,A61K31/404 主分類號: A61K36/28,A61P39/00,A61K31/352,A61K31/375,A61K31/201,A61K31/404
申請人: 中國人民解放軍蘭州軍區疾病預防控制中心
發明人: 徐文
地址: 730020 甘肅省蘭州市東崗東路509號
優先權: CN201310477123A
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法律狀態
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CN201310477123.X

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法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種具有抗低氧應激功能的復方制劑,主要用于防治缺氧性損傷引起的各種病理或生理狀態,屬于醫藥領域。本發明具有抗低氧應激功能的復方制劑,是以纈草提取物、木犀草素、洋甘菊花提取物、共軛亞油酸、人參提取物為原料藥,以藥劑學的常規輔料和工藝制備成的內服制劑。動物實驗表明,本發明抗低氧復方制劑具有能夠很好的抗低氧作用,能有效改善因外界環境氧含量降低而引起的各種缺氧病理狀態。本發明制劑經在急進高原的軍人、駐高原部隊、赴高原旅游和工作人員近300人使用,現場試驗數據表明其可以有效提高人體在低氧環境下的腦力勞動能力及體力耐力。

權利要求書

1.一種具有抗低氧應激功能的復方制劑,是以纈草提取物、木犀草素、洋甘菊花提取物、共軛亞油酸、人參提取物、B族維生素、維生素C、鈣鎂鋅,n-3多不飽和脂肪酸,γ-氨基丁酸,5-羥色胺為原料藥,以藥劑學的常規輔料和工藝制備成的內服制劑;所述各原料藥按以下重量份進行配比:共軛亞油酸2~10份,纈草提取物2~10份,木犀草素2~10份,洋甘菊花提取物1~10份,人參提取物1~10份,B族維生素10~100份,維生素C20~200份,鈣鎂鋅5~50份,n-3多不飽和脂肪酸10~100份,γ-氨基丁酸5~50份,5-羥色胺5~50份。

說明書

技術領域

本發明屬于醫藥領域,涉及一種具有抗低氧應激功能的復方制劑,主要用于防治缺氧性損傷引起的各種病理和生理狀態。

背景技術

氧是人體生理代謝的基本元素,空氣中的氧經過呼吸進入血液,與紅細胞的血紅蛋白結合,再經血液循環到全身組織。海拔3000米以上的高原地區,由于空氣的氧分壓低,呼吸進入人體的氧也相應減少,進入動脈血液的氧也減少,不能完全滿足機體的需要,造成機體缺氧。機體缺氧程度不同,所產生的反應也不同。進入較低高原時,由于缺氧程度較輕,機體所受影響僅是因氧氣供應不足而引起的代謝增強及功能代償。當缺氧較重時,一些缺氧敏感的器官則可能出現損害。缺氧的典型癥狀為:頭昏、頭痛、惡心、嘔吐、心慌、氣促、煩燥、食欲減退、乏力、失眠或嗜睡等。

低氧應激,是指在低氧尤其是急性低氧環境下,由于機體代謝失調,能量供給障礙等對腦、體功能產生顯著影響,機體將出現頭痛、頭暈、嗜睡、神經精神行為異常外,體力活動能力和作業能力明顯降低,記憶、推理能力以及警覺性顯著下降。由于腦組織具有耗氧量大、代謝率高、氧和ATP儲備少,對低氧耐受性差的特點,是機體對低氧敏感的組織。低氧引起細胞損傷的主要機理包括染色體斷裂、轉座、倒置,還有DNA單鏈或雙鏈斷裂或修復中堿基錯配。低氧還可以通過過氧化間接損傷DNA。研究如何預防和保護低氧引起的損傷就顯得非常重要。

發明內容

本發明的目的提供一種具有抗低氧應激功能的復方制劑,主要用于防治缺氧性損傷而引起的各種病理和生理狀態。

本發明具有抗低氧應激功能的復方制劑,是以纈草提取物、木犀草素、洋甘菊花提取物、共軛亞油酸、人參提取物為原料藥,以藥劑學的常規輔料和工藝制備成的內服制劑。

本發明組方中的纈草提取物(ValerianRootExtract),是由棕褐色粉末敗醬科纈草屬植物纈草的干燥根及根莖提取而得,具有鎮靜、催眠、解痙、鎮痛作用,主要用于安神,理氣,止痛等。木犀草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物,存在于多種植物中。具有多種藥理活性,如消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等,臨床主要用于止咳、祛痰、消炎、治療心血管疾病。洋甘菊花提取物,是由洋甘菊花提取而得,德國洋甘菊具有消炎,抗痙攣,抗腹脹和舒緩的作用。人參提取物為五加科植物人參PanaxginsengCAMey.的干燥根莖葉提取物。類白色精細粉末。人參皂甙總含量一般在80-90%之間。實驗結果表明,人參皂甙可以明顯抑制腦和肝中過氧化脂質形成,減少大腦皮層和肝中脂褐素的含量,同時也能增加超氧化物歧化酶和過氧化氫酶在血液中的含量,具有抗氧化作用。此外,人參皂甙中的部分單體皂甙如rb1、rb2、rd、rc、re、rg1、rg2、rh1等可不同程度地減少體內自由基含量。天然的共軛亞油酸(CLA)主要存在于反芻類動物的肉類及乳汁中,很多的研究證實,雙鍵位置在9、11位的順-9位,反-11位(cis-9,trans-11)CLA和雙鍵位置在10、12位的反-10位,順-12位(trans-10,cis-12)。CLA是具有共軛不飽和雙鍵的脂肪酸,是必需脂肪酸亞油酸的異構體,它作為天然的抗氧化劑具有多種重要的生理學功能,如抑制腫瘤的形成、調節脂肪代謝、抗動脈粥樣硬化、改善免疫功能、降低膽固醇、促進生長等多種生物活性。

本發明的復方制劑,是將纈草提取物、木犀草素、洋甘菊花提取物、共軛亞油酸、人參提取物進行有機組合,使各組分的抗氧化功能產生協同和疊加,有效增強了其抗氧化、代謝作用,改善了氧和能量供給性能,從而能夠調節機體因外界環境氧含量降低而引起的各種病理和生理狀態,因此可用于保護和修護低氧應激引起的各種損傷,維護機體正常的生理機能,提高腦力勞動的能力和體力耐力。

經過大量的動物實驗和臨床試驗,確定本發明的各原料藥按以下重量份進行配比,對于低氧應激引起的各種損傷均具有很好的防治作用:

共軛亞油酸2~10份,纈草提取物2~10份,木犀草素2~10份,洋甘菊花提取物1~10份,人參提取物1~10份,5-羥色胺5~50份,對氨基苯甲酸2~10份。

B族維生素是推動體內代謝,把糖、脂肪、蛋白質等轉化成熱量時不可缺少的物質。如果缺少維生素B,則細胞功能馬上降低,引起代謝障礙,這時人體會出現怠滯和食欲不振。為了進一步加強對各種低氧應激損傷的防治效果,原料藥中還加入B族維生素10~100份。維生素B包括維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、煙酸、泛酸、葉酸等。

微量元素為生物體所必需的一些元素,如鐵、硅、鋅、鈣等,是一些重要酶的活性成分,在生命活動過程中的作用十分重要。本發明在組方中加入5~50份微量元素,如鈣,鎂,鋅等,這些微量元素主要來源于碳酸鈣、乳鈣,硫酸鎂,硫酸鋅、葡萄糖酸鋅等化合物。

維生素C具有促進氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代謝,延長肌體壽命,增強肌體對外界環境的抗應激能力和免疫力;還具有改善鐵、鈣和葉酸的利用,改善脂肪和類脂特別是膽固醇的代謝,預防心血管病等功能。本發明在組方中還可以加入20~200份維生素C。

實驗表明,5-羥色胺、γ-氨基丁酸能夠有效改善機體長程學習記憶能力,因此發明的組方中可加入γ-氨基丁酸5~50份,5-羥色胺5~50份。

n-3多不飽和脂肪酸的作用是促進人體視網膜、大腦和神經系統的正常運轉;防治通過各種途徑炎癥的發生,降低糖尿病患者血清LDL-C和TG水平,抑制體外培養的乳腺、前列腺和結腸癌細胞增生,促進細胞凋亡。實驗表明,多不飽和脂肪酸對LPS所致大鼠多巴能神經元損傷具有一定保護作用。本發明的組方中還加入10~100份n-3多不飽和脂肪酸。

下面通過動物實驗和臨床試驗對本發明復方制劑的抗低氧應激功能機理和防治效果進行具體說明。

一、抗低氧復方制劑(AHCI)對低氧損傷大鼠自由基清除活性的影響研究

1材料與方法

1.1材料與試劑

昆明種小鼠,雄性,體重為25±2g,購于第四軍醫大學大學實驗動物中心。SDS、BSA、GSHSigma公司;四乙氧基丙烷(TEP)、考馬斯亮藍G250Fluka公司;DTNB、NBT南京卓爾生化有限公司;總抗氧化能力(TAOC)試劑盒南京建成生物工程研究所;D-半乳糖、硫代巴比妥酸(TBA)為國產分析純及生化試劑。

1.2超氧自由基和羥自由基清除作用的測定

超氧自由基和羥自由基清除作用分別采用NBT光化還原法和鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定。

1.3H2O2誘導小鼠紅細胞氧化溶血作用測定

將小鼠摘眼球取血,加入抗凝劑,離心得紅細胞,冷生理鹽水洗3次,制成0.5%紅細胞懸浮液。各組取紅細胞懸浮液1mL,多糖組加SRP溶液0.2mL,模型組加0.2mL生理鹽水,兩組分別加0.2mLH2O2(終濃度為10mmol/L),同時以不加H2O2的為對照組。各組用生理鹽水補足相同體積,于37℃反應1h,用生理鹽水稀釋6倍,3000rap離心5min,取上清液于415nm處測定吸光度。

1.4小鼠肝組織丙二醛(MDA)生成作用的測定

取小鼠肝組織稱重后,在冰浴中用生理鹽水制成1%懸浮液,1000×g離心去除雜質得勻漿液。實驗分為對照組組和低氧誘導氧化組。AHCI實驗組,以上各組均以生理鹽水補足至相同體積后于37℃緩慢振蕩保溫1.5h,加入0.5mL28%的TCA溶液及0.38mL2%的TBA溶液混勻,在沸水浴中反應20min,冷卻后離心,在532mm波長處測定吸光度。

1.5小鼠肝線粒體腫脹程度的測定

取小鼠肝臟加入預冷的線粒體分離介質,制成10%肝勻漿,3000×g離心10min后保留上清液,于15000×g離心15min,收集沉淀的線粒體(以上操作在冰浴中進行)。將線粒體用生理鹽水充分懸浮后配制成520mm波長處吸光度(A520nm)為0.5~0.6的懸浮液。進行如下實驗:對照組、低氧模型組和AHCI組都加入2.5mL懸浮液以生理鹽水補足至3mL。于37℃保溫,緩慢振蕩,分別于0、10、20、30、60min取出測定A520nm,以零時的吸光度為100%,計算各組的相對吸光度。

2實驗結果:抗低氧復方制劑(AHCI)在體外清除超氧自由基IC50為247.3μg/mL,在554.9μg/mL濃度時對羥自由基清除率為57.38%,在136.2μg/mL時對紅細胞氧化溶血抑制率為43.8%,在700μg/mL時抑制線粒體腫脹程度與對照組相同,在687μg/mL時在自氧化和誘導氧化條件下,肝勻漿MDA生成的抑制分別為36.0%和47.9%(見表1、2)。由此說明,本發明的抗低氧復方制劑(AHCI)能有效地清除體外超氧自由基。

二、抗低氧復方制劑(AHCI)對D-半乳糖氧化損傷小鼠的抗氧化作用

1材料與方法

1.1材料與試劑:昆明種小鼠,雄性,體重為25±2g,購于第四軍醫大學大學實驗動物中心。SDS、BSA、GSHSigma公司;四乙氧基丙烷(TEP)、考馬斯亮藍G250Fluka公司;DTNB、NBT南京卓爾生化有限公司;總抗氧化能力(TAOC)試劑盒南京建成生物工程研究所;D-半乳糖、硫代巴比妥酸(TBA)為國產分析純及生化試劑。

1.2動物模型:小鼠正常飼養3d后隨機分為對照組(A)、模型組(B)和AHCI低劑量組(100mg/kg·d)、中劑量組(300mg/kg·d)、高劑量組(600mg/kg·d),每組各12只。3個劑量組經口灌胃給予AHCI,A組和B組給予同體積蒸餾水,在給予受試樣品的同時,除A組外,各組每天頸背部皮下注射D-半乳糖(600mg/kg·d),連續造模60d,A組頸背部皮下注射等量的生理鹽水。動物飼養期間飼喂全價顆粒飼料,不限制攝食飲水,定期尾靜脈取血測定血液抗氧化指標,實驗結束時動物禁食12h后摘眼球放血處死動物,收集血液和主要臟器組織,分析抗氧化有關指標。

1.3血液及組織樣品的制備:取20μl血液于1mL生理鹽水中混勻,3000×g離心3min,棄上清液,加蒸餾水0.2mL充分溶血,加入95%乙醇0.1mL,振蕩30s,加入三氯甲烷0.1mL,再振蕩30s,6000×g離心5min,上清液用于SOD活性測定。組織樣品稱重后剪碎,加入預冷的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8),于冰浴中進行超聲波破碎(400W,20s×3)制成10%組織勻漿。組織勻漿于4℃下10000×g離心10min,一部分上清液用于測定MDA含量和TAOC,另一部分上清液加飽和硫酸銨溶液至25%飽和度,同樣條件下離心,上清液用于測定SOD、GPx活性。

1.4超氧化物歧化酶(SOD)活性測定:按Stewert等的方法測定SOD活性。MnSOD活性測定按王曉煒等方法進行。Cu,ZnSOD活性以總SOD活性與MnSOD活性之差表示。

1.5谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性測定:采用DTNB法測定GPx活性。

1.6MDA含量的測定:以TEP為標準,測定2%溶血液、血清及組織中的MDA含量。

1.7TAOC測定:按試劑盒說明書的方法進行。

1.8蛋白質含量測定:蛋白質含量測定采用Bradford以BSA為標準蛋白。

1.9實驗數據處理與分析:實驗數據用SPSS10.0統計軟件進行統計學分析,數據用x±s表示,組間差異顯著性采用t檢驗。

2實驗結果

在動物實驗中,AHCI對小鼠體重變化無顯著影響,能使降低的血紅蛋白(Hb)含量和肝指數恢復到正常水平。給予AHCI(200mg/kg)在20、45、60d時能提高血液SOD活性,在45、60d時能降低血液MDA含量,與模型組比差異有顯著性;在小鼠血清抗氧化指標中,模型組MDA含量升高,谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和總抗氧化能力(TAOC)水平降低,與對照組比差異有顯著性,給予AHCI后MDA含量顯著降低,GPx活性和TAOC顯著提高。與模型組比,AHCI組的肝抗氧化酶(總SOD、MnSOD、CuZnSOD及GPx)活性及TAOC顯著提高,MDA含量顯著下降,差異有顯著性。AHCI對D-半乳糖所致氧化損傷小鼠血液和肝臟有顯著的改善作用(見表3)。因此,本發明抗低氧復方制劑(AHCI)具有很好的抗氧化作用。

三、抗低氧復方制劑AHCI對低氧PTSD-SPS大鼠行為學影響的研究

1材料和方法

1.1實驗動物分組:健康成年雄性SD大鼠40只,體質量(65±10)g,清潔級,購自第四軍醫大學實驗動物中心。大鼠在光/暗周期為12h/12h、自然光照條件下飼養適應1w,隨機分為四組,正常對照組,PTSD-SPS模型組,添加抗低氧復方制劑飼料PTSD-SPS模型組每組10只。對照組及SPS模型組以常規飼料喂養,另外兩組(分別用于EPM實驗檢測和OF實驗檢測)采用添加抗低氧復方制劑的飼料喂飼一個月后開始造模。

1.2行為學檢測

1.2.1高架十字迷宮(Elevatedplusmaze,EPM):該裝置由兩條相對開放臂(長×寬:50cm×10cm)和兩條相對的閉合臂(長×寬×高:50cm×10cm×40cm),由中央區(10cm×10cm)聯結,閉合臂由高40cm涂黑木板圍成。迷宮整體固定于金屬支架上,使迷宮底板調節到距實驗室地面50cm。測試時室內為暗光,室溫22℃~25℃,保持安靜。將在開闊的場地中適應10min后的大鼠面對閉合臂放置在EPM的中央區,隨后記錄大鼠5min的活動情況。測試時實驗人員距離EPM至少1m。中間用濕布擦拭迷宮,清除排泄物,繼續用干布擦凈后再進行下一只大鼠的測試。整個實驗過程用紅外裝置實施自動追蹤,電腦相關軟件自動記錄進入開放臂的次數(Openarmen-try,OE)、進入開放臂的時間(Openarmtime,OT)、進入封閉臂次數(Closearmentry,CE)、進入封閉臂的時間(Closearmtime,CT),評判者由非實驗人員完成以保證結果客觀。小鼠運動活力(OE+CE)=進入開放臂次數(OE)+進入封閉臂次數(CE);進入開放臂次數比例(OE%)=OE(/OE+CE)×100%;開放臂停留時間比例(OT%)=OT(/OT+CT)×100%。

1.2.2曠場實驗(Open-fieldTest,OF):曠場實驗箱長寬高(100cm×100cm×50cm),內壁為黑色,底面劃分為25個等邊方格,沿四壁為外周格,其余為中央格。將大鼠放置在中央格,用攝像系統記錄大鼠5min內的活動情況。每次實驗后均清掃曠場,噴灑酒精去除氣味后進行下一只測定。觀察指標為中央格停留時間、穿越格數(三爪以上跨人鄰格)、后肢直立次數(兩前肢離箱底1cm以上)、理毛次數及糞便粒數。評判者由非實驗人員完成以保證結果客觀。

1.3動物模型:采用2005年在日本文部省召開的“基礎和臨床的研究進展”會議中確定的關于PTSD模型-SPS(Single-ProlongedStress,SPS)刺激后無干擾喂養的方法。SPS模型的具體建立方法:大鼠禁錮2h,然后立即強迫其游泳(水深40cm,水溫25℃)20min;經過15min的自然恢復,密閉容器內乙醚麻醉至意識喪失,置于鼠籠中,不經任何打擾持續至蘇醒。對照組動物無干擾常規飼料喂養,直至取材。

統計學處理應用SPSS13.0統計分析軟件對數據進行統計分析,數據以均值±標準差(x±s)表示,進行t檢驗,P<0.05為具有統計學差異。

2實驗結果

2.1ω-3PUFAs對模型組大鼠高架十字迷宮行為的影響:與對照組相比,SPS模型組大鼠OE+CE、OE%、OT%明顯減少(P<0.05),模型組大鼠表現出焦慮/抑郁情緒行為;與SPS模型組相比,60%ω-3PUFAs組大鼠OE+CE(9.65±1.46)次、OE%(33.26%)、OT%(29.28%)明顯增加(P<0.05),具有顯著統計學意義(見表4),而其與對照組相比沒有顯著性差異。

2.2抗低氧復方制劑對模型組大鼠曠場行為的影響:與對照組相比,SPS模型組大鼠中央格停留時間明顯縮短(5.56±0.21)s,(P<0.05),穿格次數明顯的減少(30.23±5.96)次,(P<0.05),具有顯著的統計學意義,SPS模型大鼠在中央格內的停留時間縮短,穿行格數減少,表明大鼠探究行為減少,可能處于;與SPS模型組相比,抗低氧復方制劑組大鼠的中央格停留時間明顯延長(P<0.05),穿格次數明顯增加(P<0.05),其與對照組比較沒有顯著性差異。各組大鼠直立次數、理毛次數及排便量之間沒有顯著性差異(表5)。

EPM為國際上公認的測試動物焦慮行為裝置,其利用動物對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態;并可作為評價抗焦慮藥物和治療手段的一種焦慮模型。近年來有文獻報道PTSD可伴隨焦慮癥、抑郁癥的發生,患者表現出焦慮/抑郁行為。經本次實驗EPM測試發現,SPS模型組大鼠較少進入并停留于開放臂中,傾向于探究閉合臂,且在閉合臂的停留時間延長。另外,我們觀察到大鼠在閉合臂內行動緩慢甚至靜止不動或者排便等,SPS大鼠表現出更多與焦慮相關的行為,提示可能處于焦慮狀態。OF可反映大鼠探究活動及情緒反應。在曠場行為實驗中,中央格代表的中心區域對動物來說具有一定的新奇性同時是潛在的威脅情境,而周邊格代表的外周區則相對安全,應激大鼠在中央格內的停留時間的長短及穿行格數次數多少,表明大鼠探究行為及情緒的變化。SPS模型大鼠穿越格子數及在中央格停留時間均顯著減少,表明大鼠焦慮/抑郁反應增強,探究活動下降,更好的模擬了臨床上PTSD焦慮/抑郁患者逃避、探索行為能力下降的表現。PTSD是指由于異常威脅性或災難性心理創傷導致延遲出現和長期持續的精神障礙。它是應激疾病中最為典型的一種,屬于嚴重創傷應激急性期。總的來說它是一種創傷后心理失衡狀態,其臨床表現以再度體驗創傷特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為。目前,苯二氮卓類抗抑郁藥、抗焦慮藥等用于PTSD治療,短期雖有一定的療效,但長期藥物治療帶來的巨額醫療費及藥物副作用、藥物耐受不可避免,并且其預防復發的作用尚未明確。高原低氧環境應激可出現焦慮癥、抑郁癥的發生,本次實驗中,抗低氧復方制劑能明顯增加SPS模型組大鼠進入開放臂的次數與時間,與文獻實驗結果保持一致,并且延長大鼠在中央格停留時間和穿格次數,表明抗低氧復方制劑可降低SPS大鼠焦慮/抑郁水平,阻止其進入焦慮/抑郁狀態,有助于保護SPS大鼠情緒行為學的變化,提示抗低氧復方制劑對PTSD-SPS行為學變化可能有一定的防護作用。

四、抗低氧復方制劑對低氧PTSD-SPS大鼠空間學習記憶和海馬神經元溶酶體損傷的防護作用研究

1材料和方法

1.1實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠48只,體質量(60±10)g,清潔級,購自第四軍醫大學實驗動物中心。動物在光/暗周期為12h/12h、自然光照條件下飼養適應5天。大鼠被隨機分為四組,正常對照組,PTSD-SPS模型組,抗低氧復方制劑+PTSD-SPS模型組,60%ω-3PUFAs+PTSD-SPS模型組,每組12只。對照組及SPS模型組以基礎飼料喂養,抗低氧復方制劑組飼料中添加在基礎飼料中(60g/kg),各組按配置好的飼料喂飼一個月后開始造模。

1.2實驗器材及材料

1.2.1Morris水迷宮:水迷宮為一直徑160cm、高50cm的圓形水池,水池內壁被漆為黑色,池內水深23cm,水溫保持在(21±2)℃,房間內光照恒定,無光線直射在水池內。池壁上以四個等距離點將水池分為四個象限,在靶象限內距離池壁35cm處放有一個直徑為12cm、高21cm的圓形黑色站臺,站臺位于水面下2cm。池壁內貼有不同形狀及顏色的標記物。迷宮上方安置連接顯示系統的攝像機,同步記錄大鼠運動軌跡。采用上海吉量軟件科技有限公司研制開發的Morris水迷宮視頻分析系統進行信息處理,該系統能動態記錄大鼠在水迷宮中游泳的錄像資料,設定分析參數,進行在線或離線數據分析,并提供大鼠上臺潛伏期、靶象限活動時間百分比、穿臺次數、游泳速度、游泳路程等指標。

1.2實驗方法

1.2.1PTSD-SPS動物模型的制備:大鼠禁錮2h,然后立即強迫其游泳(水深40cm,水溫25℃)20min;經過15min的恢復,密閉容器內乙醚麻醉至意識喪失,在籠中不經任何打擾持續至蘇醒。對照組動物無干擾喂養,常規飼養直至取材。

1.3.2定位航行實驗:實驗前將大鼠置于站臺上適應20s,隨后將大鼠隨機從不同象限(靶象限除外)面壁置入池內,大鼠登上站臺10s后終止記錄,最長記錄時間為60s,若大鼠在60s內不能上臺,引導其登上站臺適應10s,然后將大鼠拭干放入鼠籠。如此將大鼠置入游泳池,每天同一時間訓練一次,定位航行訓練需要5天完成。測量平均逃避潛伏期,以此評判大鼠的空間學習能力。

1.3.3空間探索實驗:定位航行訓練結束后撤除水面下的站臺,于實驗第6天將大鼠隨機從不同象限(靶象限除外)面壁置入池內,記錄大鼠在60s內的游泳軌跡并進行分析,最后將大鼠拭干放入鼠籠。觀察第6天大鼠在靶象限活動時間的比率和穿臺次數,以此評判大鼠的空間記憶能力。

1.3.4海馬神經元電鏡觀察:造模后1天,大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉,打開胸腔,用0.9%的生理鹽水200mL沖血,4%多聚甲醛灌注固定,斷頭后取出海馬,在不同部位,切取約1mm×1mm×1mm的海馬組織10塊,固定于4%戊二醛溶液內,之后每組10塊組織中隨機選出3塊組織,常規鍔酸固定,逐級酒精脫水,E-pon812包埋,半薄切片定位,最后制成超微切片。經醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色后,在JEM-100CX2型透射鏡下拍照。統計學處理應用SPSS13.0統計分析軟件對數據進行統計分析,數據以均值±標準差(x±s)表示,進行t檢驗,P<0.05為具有統計學差異。

2實驗結果

2.1抗低氧復方制劑對造模后大鼠學習記憶的影響

2.1.1抗低氧復方制劑對造模后大鼠空間學習的影響:通過定位航行實驗比較各組逃避潛伏期時間。與對照組相比,SPS模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(表6,P<0.05),喂飼ω-3PUFAs的SPS組大鼠的逃避潛伏期沒有明顯的變化,無統計學差異;與SPS模型組相比,60%ω-3PUFAs組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短,在第四天和第五天分別達到18.22±5.07,19.13±4.26(Table1,P<0.05),具有顯著統計學意義。

2.1.2抗低氧復方制劑I對造模后大鼠空間記憶的影響:通過空間探索實驗的兩個指標靶象限活動時間百分比及靶象限穿臺次數評價大鼠空間記憶能力。本次實驗中,低氧SPS模型組大鼠靶象限活動時間百分比及穿臺次數較對照組減少,分別為10.01%±3.03%及(1.05±0.13)次;喂飼抗低氧復方制劑SPS模型組大鼠靶象限活動時間百分比及穿臺次數較SPS模型組明顯增加分別達到25.56%±2.13%及2.36±0.34)次,P<0.05,具有統計學意義。

2.2抗低氧復方制劑對海馬神經元超微結構的影響

與正常對照組相比,SPS模型組大鼠海馬神經元中溶酶體明顯增多在實驗的過程中,同時觀察到線粒體腫脹及神經元細胞突起改變;與SPS模型組相比,喂飼抗低氧復方制劑的SPS模型組大鼠海馬神經元溶酶體的數量明顯減少,與對照組相比其數量沒有顯著差異。

本實驗結果顯示,SPS模型組大鼠逃避潛伏期延長,提示其空間學習和記憶的獲得與鞏固過程受到影響,空間學習記憶能力下降;靶象限活動時間百分比及穿臺次數的下降進一步提示SPS模型組大鼠空間記憶保持能力下降。PTSD可致海馬神經元形態改變,加速部分海馬神經元細胞的死亡,進而影響認知和學習過程,損害海馬依賴性的記憶,有研究表明,應激可引起海馬神經元胞凋亡,與其細胞的溶酶體的表達和變化有關。本實驗中SPS模型組大鼠海馬組織細胞溶酶體明顯增多,實驗中同時發現線粒體腫脹,神經元突起改變。推測本研究中SPS模型大鼠的海馬神經元有一定的損傷,海馬神經元超微結構的改變可能是導致其損傷的原因之一。抗低氧復方制劑對外傷性腦損傷導致的學習記憶能力起到保護作用。這其中的機制可能在于抗低氧復方制劑有神經遞質如5-羥色胺的功能。5-羥色胺是一個關鍵的神經發育信號,如果其活性受損,會引起神經元組織持久損傷。5-羥色胺可促進神經向外生長,并抑制凋亡。本實驗結果顯SPS模型組大鼠比對照組大鼠空間學習記憶能力明顯下降,其海馬神經元中溶酶體數量明顯增加;添加抗低氧復方制劑的SPS模型組大鼠學習記憶能力與對照組無顯著差異,并且海馬神經元中溶酶體數量沒有明顯的變化,提示抗低氧復方制劑可能通過預防海馬神經元超微結構的損傷而對低氧SPS大鼠的空間學習記憶能力下降起到一定的防護作用,而抗低氧復方制劑對低氧PTSD可能有一定的防護作用。

綜上所述,本發明抗低氧復方制劑(AHCI)能有效地清除低氧損傷大鼠體外超氧自由基;對D-半乳糖所致氧化損傷小鼠血液和肝臟有顯著的改善作用,具有很好的抗氧化作用,能有效改善因外界環境氧含量降低而引起的各種缺氧病理生理狀態,可用于保護和修護低氧應激引起的各種損傷,維護機體正常的生理機能,提高腦力勞動的能力和體力耐力。本發明制劑經在急進高原的軍人、駐高原部隊、赴高原旅游和工作人員近300人使用,現場試驗數據表明其可以有效提高人體在低氧環境下的腦力勞動能力及體力耐力。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明復方制劑的制備及用法、用量進行詳細說明。

實施例1、片劑復方制劑的制備

活性組方:以重量份計

共軛亞油酸10份,纈草提取物10份,木犀草素10份,洋甘菊花提取物10份,人參提取物10份,膽堿5份,泛酸10份,葉酸10份,生物素5份,煙酰胺5份,維生素B110份,維生素B25份,維生素B65份,維生素C20份,鈣10份,鎂5份,鋅10份,n-3多不飽和脂肪酸80份,γ-氨基丁酸50份,5-羥色胺50份。

工藝:按藥劑學的常規輔料和工藝制備成片劑。每片400mg。

用法用量:每日2~3次,每次3~4片。

實施例2、軟膠囊劑復方制劑的制備

活性組方:以重量份計

共軛亞油酸10份,纈草提取物5份,木犀草素5份,洋甘菊花提取物5份,人參提取物3份,膽堿5份,泛酸10份,葉酸10份,生物素5份,煙酰胺5份,維生素B110份,維生素B25份,維生素B65份,維生素C20份,鈣10份,鎂5份,鋅10份,n-3多不飽和脂肪酸50份,γ-氨基丁酸20份,5-羥色胺20份。

工藝:按藥劑學的常規輔料和工藝制備成軟膠囊劑。每粒400mg。

用法用量:每日2~3次,每次3~4粒。

實施例3、顆粒劑復方制劑的制備

活性組方:以重量份計

共軛亞油酸2份,纈草提取物2份,木犀草素2份,洋甘菊花提取物1份,人參提取物1份,膽堿2份,泛酸5份,葉酸10份,生物素2份,維生素B15份,維生素B25份,維生素B65份,維生素C20份,鈣5份,鎂2份,鋅5份,n-3多不飽和脂肪酸20份,γ-氨基丁酸10份,5-羥色胺10份。

工藝:按藥劑學的常規輔料和工藝制備成顆粒劑。

用法用量:每日2~3次,每次10g。

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