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蘆平曲韋的用途.pdf

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蘆平曲韋 用途
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摘要
申請專利號:

CN201210269570.1

申請日:

20120731

公開號:

CN103565803A

公開日:

20140212

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/422,A61P31/14 主分類號: A61K31/422,A61P31/14
申請人: 上海市公共衛生臨床中心
發明人: 袁正宏,張小楠,胡蕓文,宋志剛
地址: 201508 上海市金山區漕廊路2901號
優先權: CN201210269570A
專利代理機構: 上海專利商標事務所有限公司 代理人: 張睿
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210269570.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了蘆平曲韋的用途。即蘆平曲韋在制備治療由腸道病毒-71型引起的疾病的藥物中的用途。

權利要求書

1.一種蘆平曲韋在制備治療由腸道病毒-71型(enterovirus?71)和/或柯薩奇病毒引起的疾病的藥物中的用途。2.如權利要求1所述的用途,其特征在于,所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒-10型或柯薩奇病毒-16型。3.如權利要求2所述的用途,其特征在于,所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒-16型。4.如權利要求1所述的用途,其特征在于,所述疾病包括手足口病。5.如權利要求1所述的用途,其特征在于,所述藥物制劑是固體制劑或液體制劑。6.如權利要求5所述的用途,其特征在于,所述固態制劑包括片劑、丸劑、膠囊、散劑、顆粒劑;所述的液體制劑包括乳濁劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑、滴劑。7.如權利要求5所述的用途,其特征在于,所述制劑包括口服制劑、靜脈注射制劑、肌肉注射制劑。8.如權利要求1所述的用途,其特征在于,所述藥物含有對腸道病毒-71型和/或柯薩奇病毒有抑制作用的活性成分和藥學上可接受的載體。9.如權利要求8所述的用途,其特征在于,所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒-10型或柯薩奇病毒-16型。10.如權利要求9所述的用途,其特征在于,所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒-16型。

說明書

技術領域

本發明涉及醫藥領域,尤其涉及一種蘆平曲韋的用途。

背景技術

腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科,它是導致近年來手足口病(HFMD)流行的主要病原。大多數EV71的感染是自限性的,只會引發輕微的癥狀如兒童麻疹。然而,在近幾次大爆發中,一些伴有神經系統病癥的嚴重病例頻繁出現,這些癥狀會快速惡化成心肺功能衰竭。

自從1969年美國加利福尼亞首次報道EV71感染以來,EV71在美國、歐洲、澳大利亞、日本、巴西及馬來西亞出現了小范圍暴發并被確認。1998年在中國臺灣出現了一次EV71大爆發,導致129,106例手足口病及405例嚴重病例,因此喚起了公眾對手足口病的警惕意識。值得注意的是,2008年3月至5月間發生在中國安徽省的一次EV71流行導致了超過20人的死亡。

考慮到EV71感染相關的嚴重臨床表現,迫切需要開發有效的抗病毒方法從而防止EV71感染引起的發病和死亡。目前,在臨床上沒有可用于嚴重EV71感染的直接抗病毒藥物。發熱、腦炎以及無菌性腦膜炎等癥狀都是通過支持性的藥物及靜脈中免疫球蛋白予以緩解。盡管廣譜抗病毒藥物利巴韋林被報道能夠降低鼠齡12-14天ICR小鼠感染EV71后的死亡率,但所使用的劑量(100mg/kg)接近被報道的成年小鼠LD50值(220mg/kg/d)且遠遠高于臨床推薦的劑量范圍(成年感染丙型肝炎病毒使用劑量10-16mg/kg/d)。由于95%的EV71感染發生于4歲以下兒童,因此使用高劑量的利巴韋林可能帶來嚴重的安全問題。其他一些在研究中有前景的化合物包括病毒衣殼結合分子如BPROZ系列,蛋白2C抑制劑(腺苷地爾等),蛋白3A抑制劑(恩韋肟等),3D抑制劑(DTrip-22和Aurintricarbosylic?acid)以及其他一些天然產物(拉烏爾酸和熊果酸等)。然而,這些化合物均未在動物模型及臨床試驗中進行全面檢測從而建立其效能及安全譜。

蘆平曲韋(AG7088)最初是由Agouron?Pharmaceuticals公司開發的,它是一種不可逆的HRV3C抑制劑。然而蘆平曲韋對EV71在動物體內是否有作用卻不得而知。換言之,迄今尚未找到在體內對EV71引起的疾病有效用的物質。

因此,本領域迫切需要提供一種針對EV71引起的疾病,在動物體內能夠有效,即能夠真正治療這類疾病的物質。

發明內容

本發明旨在提供一種蘆平曲韋的新用途。

本發明提供了一種蘆平曲韋在制備治療由腸道病毒-71型(enterovirus?71)和/或柯薩奇病毒引起的疾病的藥物中的用途。

在另一優選例中,所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒-10型或柯薩奇病毒-16型;更佳地,所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒-16型。

在另一優選例中,所述疾病是手足口病。

在另一優選例中,所述藥物制劑是固體制劑或液體制劑;更佳地,所述固態制劑包括片劑、丸劑、膠囊、散劑、顆粒劑;所述的液體制劑包括乳濁劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑、滴劑。

在另一優選例中,所述制劑包括口服制劑、靜脈注射制劑、肌肉注射制劑。

在另一優選例中,所述藥物含有對腸道病毒-71型和/或柯薩奇病毒有抑制作用的活性成分和藥學上可接受的載體;較佳地,所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒-10型或柯薩奇病毒-16型;更佳地,所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒-16型。

據此,本發明提供了一種針對EV71和/或柯薩奇病毒引起的疾病,在動物體內能夠有效,即能夠真正治療這類疾病的物質。

附圖說明

圖1顯示了蘆平曲韋體外活性;其中,

(A)-(B)是蘆平曲韋對EV71(A)及CA16、CA10(B)引起的細胞病變效應的劑量反應曲線,(C)是EV71抗原的免疫熒光,(D)是RTCA分析蘆平曲韋或利巴韋林對抗EV71誘導的細胞病變效應的能力。圖2顯示了體內蘆平曲韋的抗病毒活性;其中,。

(A)是Kaplan-Meier曲線,(B)是臨床評分,C為感染后第六天拍攝的感染小鼠存在的明顯的肢體癱瘓癥狀(黑色箭頭處),D為感染后第六天取不同組別小鼠的腸、肺、四肢肌肉、腦干及心肌(N=4-6)組織行實時定量RT-PCR檢測EV71?RNA及細胞內β-actin含量,病毒載量表示為:–(CtEV71-Ctactin)+10。

圖3顯示了各組織的組織學及免疫組織化學分析,其中,

感染六天后取骨骼肌(A-F),肺(G-L)及腸(M-O)標本并行H&E染色(A-C,G-I)及免疫組化分析(D-F,J-O)。G-I圖為每組(N=6)代表圖片(200×放大,其他為400×)。

具體實施方式

發明人通過動物模型,發現了蘆平曲韋對于感染了EV71的動物的治療功效。在此基礎上,完成了本發明。

定義

如本文所用,“蘆平曲韋(Rupintrivir)”,又稱AG-7088,是指結構如式Ⅰ所示的化合物,其CAS登記號為223537-30-2,分子式為C31H39FN4O7:

如本文所用,術語“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構成”、和“由……構成”。

如本文所用,術語“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。

如本文所用,術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體,包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分,且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington’s?Pharmaceutical?Sciences(Mack?Pub.Co.,N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體,如水、鹽水、甘油和乙醇。另外,這些載體中還可能存在輔助性的物質,如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質等。

如本文所用,術語“藥物”或“藥物組合物”可以互換使用,都是指通過施用于動物體,減輕、改善或消除動物體疾病狀況的物質,其中含有對減輕、改善或消除動物體疾病有直接作用的活性成分和藥學上可接受的載體。

用途

本發明將含有蘆平曲韋的藥物組合物用于治療腸道病毒-71型感染引起的疾病。所述組合物中的活性成分含有蘆平曲韋,還可以含有其它具有抗病毒作用的輔助活性成分,也可以將治療有效量的蘆平曲韋同具有抗病毒作用的藥物聯合使用,以減少這些藥物的用量和消抵病毒對這些藥物的耐藥性。

所述的藥物組合物中還可以含有藥學上或食品學上可接受的載體賦形劑或稀釋劑。這類載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、水、甘油、乙醇、及其組合。

本發明的經口給藥的固體藥物組合物可采用片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、滴劑等形式。這些固體組合物中混合了一種或一種以上的活性物質和至少一種惰性稀釋劑,例如,乳糖、甘露醇糖、葡萄糖、羥丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯皖酮、瓊脂、果膠、硅鋁酸鎂、鋁酸鎂。還可按照常用方法使組合物中含有除了惰性劑之外的添加劑,例如,乳糖穩定劑、谷氨酸或天冬酸等助溶劑。如是片劑或丸劑,還可根據需要,在其外部包裹上蔗糖、明膠、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素或胃溶性、腸溶性薄膜。

經口給藥的液體藥物組合物包括藥劑上允許的乳濁劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑等,通常使用的惰性稀釋劑包括精制水、乙醇。該組合物中除了惰性稀釋劑之外,還包括濕潤劑、懸浮劑、等助劑,甜味劑、矯味劑、芳香劑和防腐劑。

非經口給藥的注射劑包括無菌水性或非水性溶液劑、懸浮劑和乳濁劑。水性溶液劑和懸浮劑中包含注射用蒸餾水及生理鹽水。非水性溶液劑和懸浮劑中包含丙二醇、聚乙二醇、可可脂、橄欖油、蓖麻油、等植物油。這些組合物中還可包含等滲劑、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、穩定劑、助溶劑。

使用方法

在本發明中,對蘆平曲韋的劑量沒有特殊的限制,可用任何合適的劑量。載體的類型以及數量也可以很不相同,這取決于溫血動物或人的種類、體重、和待治療的疾病的損害程度等。一般,合適的含量是蘆平曲韋占藥物組合物總重量的0.01%-99%,較佳地0.1%-99%。作為藥物治療時,蘆平曲韋的有效劑量范圍通常為0.01-800毫克/千克/天或更高,較佳的為0.1-500毫克/千克/天,更佳的為0.5-200毫克/千克/天。

劑量單元包括一種蘆平曲韋化合物,或者該蘆平曲韋化合物與其他抗病毒治療劑所形成的混合物。劑量單元還可含有稀釋劑、填充劑、載體等。劑量單元是固體或凝膠形式,如丸劑、片劑、膠囊等,或者是液體形式,它們適合口服給藥、局部給藥或腸胃給藥、或者靜脈內給藥、皮下給藥、肌肉給藥。

配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥,其中包括:肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、口服、或局部給藥。此外,蘆平曲韋還可以與其他治療病毒感染的治療劑一起使用。

本發明提到的上述特征,或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用,說明書中所揭示的各個特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明,所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

本發明的主要優點在于:

1、首次證明蘆平曲韋抗EV71的體內活性。

2、蘆平曲韋抗EV71的使用量范圍安全。

3、蘆平曲韋能高效阻隔耐藥病毒的出現。

下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則所有的百分數、比率、比例、或份數按重量計。

本發明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的,例如是指在100毫升的溶液中溶質的重量。

除非另行定義,文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外,任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1

實施例中使用的病毒,藥物,細胞和小鼠來源:

人橫紋肌肉瘤(RD)細胞培養于含10%胎牛血清的MEM培養基(含谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素(GIBCO?BRL))。

蘆平曲韋購于Santa?Cruz(SC-208317)。

腸道病毒71型株SHAPHC695F/SH/CHN/10(695F)是2010年從上海市公共衛生臨床中心一位一歲10個月的患兒口腔分離得到的。

柯薩奇病毒16(CA16,strain?860F)和10(CA10,strain?798F)同樣從病人的口腔中分離得到。

無特定病原ICR小鼠(Charles?River實驗室)飼養于上海市公共衛生臨床中心動物中心。動物的照料遵循上海市公共衛生臨床中心動物中心相關規定。

實施例中各試驗方法:

RD細胞中EV71的感染

96孔板中的RD細胞以0.1MOI濃度分別感染EV71,CA16?or?CA10。感染細胞在含不同濃度DMSO(Dimethyl?sulfoxide,二甲基亞砜)或蘆平曲韋(Santa?Cruz)的培養基中培養3天。利用CCK8試劑盒(CCK-8,Dojindo,Japan)檢測細胞活力并繪制劑量依賴反應曲線。

參見圖1,其中(A)-(B)蘆平曲韋對EV71(A)及CA16、CA10(B)引起的細胞病變效應的劑量反應曲線。在蘆平曲韋(8-500nM)存在時,用EV71或CA16(MOI=0.1)感染RD細胞并培養三天。CCK8檢測獲得OD值,以蘆平曲韋濃度的對數作為橫坐標繪制曲線。EC50值依照材料與方法中所述方法檢測。(C)EV71抗原的免疫熒光。RD細胞感染EV71(MOI=0.01)并用DMSO或蘆平曲韋(30nM)處理4天。行免疫熒光并用Zeiss?Axiovert熒光顯微鏡觀察。(D)RTCA分析蘆平曲韋或利巴韋林對抗EV71誘導的細胞病變效應的能力。鋪于E-平板的RD細胞感染100PFU?EV71病毒并用蘆平曲韋(30nM)或利巴韋林(100μM)處理,RTCA檢測8天。利用細胞指數(CI)與時間(hours)繪圖。

免疫熒光

96孔板中的RD細胞感染EV71(100pfu)并用DMSO或蘆平曲韋處理(30nM)。感染后4天,PBS洗細胞,加入3.7%多聚甲醛固定,0.1%?TritonX-100進行穿透。利用含5%胎牛血清的PBS封閉后,利用EV71感染痊愈者的抗血清(1:200稀釋)進行一抗孵育,室溫2小時,隨后孵育二抗(羊抗人IgG-FITC,Sigma?1:500稀釋)。洗細胞后用Zeiss?Axiovert倒置顯微鏡進行觀察。為了確保結果的特異性,未感染的RD細胞同時染色作為陰性對照。

實時細胞分析(RTCA)

采用實時細胞分析(RTCA)系統。此系統能通過細胞培養板底部的微電子生物傳感器檢測電極阻抗以監測細胞的生長。RTCA系統能夠直接監測細胞生長過程而不需要參入標記。RD細胞按每孔1.0×104鋪于96孔E-平板中并感染1000pfu的695F病毒。24小時后,更換培養基并將蘆平曲韋(30nM)和利巴韋林(100μM)加入相應孔中。細胞培養并觀察8天。生長狀況以生長指數描繪并與E-平板底部的電子細胞傳感器檢測數據共同顯示細胞的狀態。

小鼠中EV71感染

用106PFU的EV71(695F株)注射鼠齡2天的幼鼠(2.0-2.3g),隨后腹腔注射5-15μl80μM或800μM溶解于DMSO的蘆平曲韋。13只按0.1mg/kg劑量注射,另13只按1mg/kg劑量注射,對照組(N=14)注射相同體積的DMSO。連續10天每天注射藥物。每天觀察感染小鼠的發病和死亡的征兆。對小鼠的患病程度進行評分(0,健康;1,行動緩慢;2,后肢乏力;3,單肢癱瘓;4,雙肢癱瘓;5,死亡)為了更好的展示存活小鼠的恢復情況,死亡小鼠只在第一次發現時被記入平均分一次。

參見圖2,鼠齡2天的ICR小鼠腹腔接種EV71并用DMSO(N=13)和蘆平曲韋(0.1mg/kg,N=13,1mg/kg,N=14)處理,結果顯示為Kaplan-Meier曲線(A)以及臨床評分(B)。死亡小鼠只在第一次發現時被記入平均分一次。C圖為感染后第六天拍攝,圖片顯示DMSO組感染小鼠存在明顯的肢體癱瘓癥狀(黑色箭頭處)。D圖為感染后第六天取不同組別(A,DMSO組;B,蘆平曲韋0.1mg/kg組;C,蘆平曲韋1mg/kg組)小鼠的腸、肺、四肢肌肉、腦干及心肌(N=4-6)組織行實時定量RT-PCR檢測EV71?RNA及細胞內β-actin含量。病毒載量表示為:–(CtEV71-Ctactin)+10。

組織學及免疫組織化學分析

各種小鼠組織進行常規蘇木精-伊紅染色。3.7%甲醛固定,石蠟包埋4um切片。對于EV71抗原的免疫組化,骨骼肌,肺和腸組織包埋于OCT化合物并于液氮中冷凍。利用Leica?CM1800恒冷切片機獲得頸部薄層切片于多聚賴氨酸包被的玻片上并進一步用3.7%多聚甲醛固定。用含1.5%馬血清的PBS進行封閉,隨后用抗EV71?VP1的單克隆抗體進行一抗孵育(Millipore,MAB979,1:500稀釋),4℃過夜。這些玻片持續用生物素化的抗鼠抗體進行孵育,抗體中補充Vectastain?ABC-peroxidase試劑盒(Vector?laboratories)中Vector?M.O.M試劑和ABC試劑。玻片加入DAB底物并用Mayer’s蘇木精復染。在平行實驗中設置了嚴格的對照(未感染EV71的各相應組織切片)以確保結果的特異性。

病毒RNA的實時定量逆轉錄PCR

源于不同處理組小鼠的肌肉,腸道,心臟,肺及腦干在感染后第六天獲得。利用1mm的玻璃珠(Biospec?Products)在含2%胎牛血清的培養基中將組織研磨成大小均勻的微粒。利用QIAamp?QIAXtractor?Virus?reagent(Qiagen,950207)抽提RNA。使用一步法逆轉錄PCR試劑盒(one?step?Prime?Script?RT-PCR?kit,Takara,Dalian,DRR064A)及實時定量PCR的方法擴增VP1片段。小鼠的beta-actin作為內參對照也同時被擴增。病毒載量被表示為:-(CtEV71-Ctactin)+10

數據統計

數據以平均數±標準差表示。利用Mantel-Cox?test對生存率進行比較。

在Graphpad?Prims軟件中利用非線性回歸(變量斜率)分析對EC50值進

行估計。One-Way?ANOVA?test用于比較兩組或多組間病毒RNA含量差異。

Mann-Whitney?U?test用于比較兩組間病毒RNA含量的差異。

實施例中各試驗的結果

細胞系中蘆平曲韋能有效清除EV71的復制

首先在細胞培養模型中評估了蘆平曲韋的抗病毒活性。以能導致大量細胞病變效應的0.1MOI?EV71病毒695F株感染細胞,接種后加入蘆平曲韋(8nM?to?0.5uM)并在感染后72小時內觀察CPE。蘆平曲韋在相對較低的濃度即能完全抵抗EV71誘導的細胞死亡(EC50=14nM?95%CI?12.16-16.33nM,圖1A)。CA16和CA10是兩種廣泛流通的能引起HFMD的病毒,也評估了蘆平曲韋抵抗CA16和CA10的活性。蘆平曲韋同樣能抑制CA16和CA10的增殖,EC50分別為15nM和17nM(圖1B)。此外還檢測了在蘆平曲韋(30nM)存在時,以0.01MOI?EV71感染的RD細胞中EV71?VP1蛋白的表達。免疫熒光結果顯示在EV71接種后48小時病毒大量復制,然而當加入蘆平曲韋(30nM)后基本觀察不到明顯的信號。我們還進一步利用RTCA系統評估了蘆平曲韋的效能。如圖1D所示,經30nM蘆平曲韋處理的RD細胞(藍色)的生長狀況與未感染細胞(綠色)的生長狀況相當,然而100μM的利巴韋林(粉紅)處理只能部分挽救EV71誘導的細胞病變效應(紅色)。

幼鼠模型中蘆平曲韋能有效挽救EV71引起的癱瘓和死亡

接著在幼鼠模型中檢測了蘆平曲韋的抗病毒效能。腹腔注射EV71病毒695F株(10E6PFU/鼠)后,連續10天每天注射蘆平曲韋(0.1mg/kg或1mg/kg),對照組以相同體積注射DMSO。在此模型中,若不用藥物處理,則在感染后第四天能觀察到大部分幼鼠出現后肢乏力的癥狀。隨后幾天,感染小鼠的狀況進一步惡化為后肢或前肢癱瘓(單肢或雙肢,圖2C,上圖,箭頭處)并在感染后6-10天達到頂峰(圖2B)。然而,兩種劑量的蘆平曲韋均能顯著減輕這些癥狀(圖2C下圖),其臨床打分顯著低于DMSO組(圖2B,p<0.01?Wilcoxon?rank?test)。對于感染小鼠的死亡率,0.1mg/kg劑量注射蘆平曲韋足以幾乎完全(90.9%存活,圖2A)保護小鼠免受病毒感染導致的死亡,然而DMSO組在觀察的最后只有38.5%的存活(p=0.0063?Mantel-Cox?test)。1mg/kg劑量注射蘆平曲韋并沒有進一步提高整體存活率(83.3%與38.5%DMSO組,p=0.012)。進一步分析感染后第六天不同組織中病毒RNA的含量。感染后第六天在所選取的組織中骨骼肌內病毒載量最高(DMSO組骨骼肌內病毒RNA是其他組織中的2000-4000倍)。與觀察的癥狀一致,蘆平曲韋給藥后病毒RNA含量在各組織中均有顯著下降:腸,p<0.0001;肺,p<0.01;肌肉,p<0.05;腦干,p<0.01;心肌,p<0.0001(One-Way?ANOVA)。此外,1mg/kg劑量的蘆平曲韋比0.1mg/kg劑量的蘆平曲韋顯著增強了其抑制EV71?RNA的效應(圖2D,腸、肺及心肌,p<0.01;腦干,p<0.05,Mann-Whitney?U?test)。肌肉中病毒RNA的減少雖很明顯但沒有其他組織中顯著,尤其在DMSO組和0.1mg/kg劑量給藥組之間沒有顯著性差異。然而,免疫熒光結果表明病毒VP1蛋白的表達受到顯著抑制。

組織學觀察

檢測了感染小鼠各組織的組織學表現。當感染小鼠發病時,心臟和脊髓沒有明顯的損傷和/或炎癥(數據未顯示)。相比之下,四肢肌肉則出現了伴有炎癥浸潤的壞死性肌炎(圖3B)。盡管一些輕微的損傷仍能被觀察到,0.1mg/kg蘆平曲韋處理顯著增強了四肢肌肉結構的完整性(圖3C)。VP1的免疫組化染色證實了RT-PCR的結果,在DMSO組強烈而廣泛的信號表明骨骼肌中病毒蛋白最為活躍(圖3E400×,黑色箭頭處),而對照組中則無此現象(圖3D400×)。肌肉中VP1的表達受到蘆平曲韋(0.1mg/kg)的顯著抑制(圖3F?200×和圖3I400×)。DMSO處理小鼠的肺部中度炎癥浸潤及肺泡隔稠化的癥狀在用蘆平曲韋(0.1mg/kg)處理后得到緩解。另外,肺泡(圖3K)和腸粘液及基底膜(圖3N,黑色箭頭處)中EV71?VP1的染色顯著但更為微弱。綜上結果表明蘆平曲韋處理顯著減少各組織中病毒抗原的表達(圖3L,O)。

采用低劑量(0.1mg/kg)時,蘆平曲韋即能幾乎完全抵抗EV71感染引起的小鼠死亡,這一結果完全證明了蘆平曲韋的體內抗病毒功效。由于EV71感染的兒童比成人對藥物毒性更敏感使得蘆平曲韋這一特性更可取。免疫組化和實時定量PCR分析表明EV71感染在骨骼肌最為活躍,其會發生嚴重的壞死性肌炎。蘆平曲韋用藥能強烈地抑制病毒復制并改善肌肉組織性及肢體活動性。即使在0.1mg/kg組,病毒抗原表達也受到強烈抑制。

直接靶向病毒酶的抗病毒藥物常常產生耐藥性。事實上,蘆平曲韋在HRV2和14中耐藥的體外選擇已被報道。單氨基酸突變只會導致敏感性的中等程度下降而顯著的耐藥表型往往需要三個以上關鍵氨基酸殘基的突變。發明人嘗試估計EV71的耐藥突變,然而蘆平曲韋濃度逐漸上升的12個連續梯度篩選均未產生有活性的突變病毒株。此結果表明蘆平曲韋能高效阻隔耐藥病毒的出現,這又體現出其另一臨床優勢。

實施例2

制備含蘆平曲韋凍干粉劑

??配方 ??含量(g) ??蘆平曲韋 ??25 ??甘露醇 ??125

??注射用水 ??2500 ??制成蘆平曲韋凍干粉劑 ??0.025/瓶X1000瓶

按照處方量精密稱取原料,將處方量甘露醇投入,加入約處方總量80%的注射用水攪拌至溶解完全,得到澄清溶液,加入0.1%(g/ml)的針用活性炭,攪拌均勻,靜置約10分鐘,經0.45μm微孔濾膜過濾,補加注射用水至全量。再經0.22μm微孔濾膜過濾,測定pH值和含量,合格后,定量灌裝,冷凍干燥,充氮,壓塞,壓鋁蓋,貼簽,包裝,抽檢合格,即得成品。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已,并非用以限定本發明的實質技術內容范圍,本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中,任何他人完成的技術實體或方法,若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同,也或是一種等效的變更,均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。

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