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一種杉木愈傷組織培養方法.pdf

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一種 杉木 組織培養 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310195125.X

申請日:

20130523

公開號:

CN103229722A

公開日:

20130807

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 廣西壯族自治區林業科學研究院
發明人: 黃開勇,陳琴,郝海坤,藍肖,戴俊,唐慶蘭,張照遠
地址: 530002 廣西壯族自治區南寧市邕武路23號
優先權: CN201310195125A
專利代理機構: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 代理人: 鄒超賢
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310195125.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種杉木愈傷組織培養方法,篩選出顆粒飽滿,無病蟲害的杉木種子作為外植體,通過無菌培養后獲得無菌實生苗,剪取無菌實生小苗的葉片、莖段或根系,接種于誘導培養基中誘導愈傷組織發生,最后將誘導形成的愈傷組織轉入增殖培養基中進行增殖。本發明簡單易行,能夠有效縮短愈傷組織誘導和增殖的時間,提高杉木愈傷組織誘導率,為杉木產業的發展提供大量顏色好、結構致密的優質愈傷組織材料,具有較好的經濟效益。

權利要求書

1.一種杉木愈傷組織培養方法,其特征在于:選取杉木種子作為外植體,培養出實生小苗,誘導實生苗的愈傷組織發生后進行增殖,具體操作步驟如下:(1)無菌實生苗的獲取:篩選出顆粒飽滿,無病蟲害的杉木種子作為外植體,通過無菌培養獲得無菌實生苗;(2)愈傷組織誘導:剪取苗齡為1~10天無菌實生苗的葉片、莖段或根系,接種于誘導培養基中誘導愈傷組織發生;(3)愈傷組織增殖:將步驟(2)中誘導形成的愈傷組織轉入增殖培養基中進行增殖。2.根據權利要求1所述的杉木愈傷組織培養方法,其特征在于:所述的無菌實生苗的培養方法是將杉木種子置于三角瓶內,加入濃度為1~5%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗10~15?min后,置于流水下沖洗1~2h,然后用無菌水清洗2~3次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌9~12min,無菌水清洗8~10次后,將種子接種于1/2MS~MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。3.根據權利要求1所述的杉木愈傷組織培養方法,其特征在于:所述的誘導培養基主要由:1/2MS~MS?+?1.0~2.0?mg/L?2,4-D?+?0.5~1.5mg/L?KT?+?100~150?mg/L維生素C?+?0.75%瓊脂?+?3.0%蔗糖組成。4.根據權利要求1所述的杉木愈傷組織培養方法,其特征在于:所述的愈傷組織增殖方法是取出誘導而得的愈傷組織團,切成小塊后轉入增殖培養基中進行增殖培養。5.根據權利要求1或4所述的杉木愈傷組織培養方法,其特征在于:所述的增殖培養基主要由:1/2MS~MS?+?1.0~2.0mg/LKT?+?0.5~1.5mg/LIBA?+?100~150?mg/L維生素C?+?0.75%瓊脂?+?3.0%蔗糖組成。

說明書

技術領域

本發明涉及一種愈傷組織培養方法,尤其涉及一種杉木愈傷組織培養方法。

背景技術

植物愈傷組織培養是植物組織培養過程中的一個重要階段,愈傷組織不僅可以誘導完整植株的形成,還可用于種質資源的保存,同時也是懸浮培養的細胞和原生質體的來源。杉木(Cunninghamia?lanceolata)為我國特有的針葉用材樹種,其材質好,生長快,產量高,是我國南方的主要造林樹種。杉木組織培養主要是通過腋芽誘導或愈傷組織誘導途徑進行,而愈傷組織誘導是杉木組織培養過程中的一個重要環節,高誘導率和高質量的愈傷組織培養是后期愈傷組織分化的重要基礎。我國杉木組織培養開始于20世紀50年代,現有技術中,采用腋芽誘導途徑進行杉木組織培養快速繁殖的研究較多,而利用外植體誘導愈傷組織發生,再通過愈傷組織誘導不定芽發生進而獲得杉木完整植株的研究相對較少。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足,提供一種簡單易行,能夠縮短愈傷組織誘導和增殖的時間,提高愈傷組織誘導率的杉木愈傷組織培養方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的:

一種杉木愈傷組織培養方法,其特征在于:選取杉木種子作為外植體,培養出實生小苗,誘導實生苗的愈傷組織發生后進行增殖,具體操作步驟如下:

(1)無菌實生苗的獲取:篩選出顆粒飽滿,無病蟲害的杉木種子作為外植體,通過無菌培養獲得無菌實生苗;

(2)愈傷組織誘導:剪取苗齡為1~10天無菌實生苗的葉片、莖段或根系,接種于誘導培養基中誘導愈傷組織發生;

(3)愈傷組織增殖:將步驟(2)中誘導形成的愈傷組織轉入增殖培養基中進行增殖。

以上所述的無菌實生苗的培養方法是將杉木種子置于三角瓶內,加入濃度為1~5%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗10~15?min后,置于流水下沖洗1~2h,然后用無菌水清洗2~3次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌9~12min,無菌水清洗8~10次后,將種子接種于1/2MS~MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。

以上所述的誘導培養基主要由:1/2MS~MS?+?1.0~2.0?mg/L?2,4-D?+?0.5~1.5mg/L?KT?+?100~150?mg/L維生素C?+?0.75%瓊脂?+?3.0%蔗糖組成。

以上所述的愈傷組織增殖方法是取出誘導而得的愈傷組織團,切成小塊后轉入增殖培養基中進行增殖培養。

以上所述的增殖培養基主要由:1/2MS~MS?+?1.0~2.0mg/LKT?+?0.5~1.5mg/LIBA?+?100~150?mg/L維生素C?+?0.75%瓊脂?+?3.0%蔗糖組成。

本發明的優點及積極效果有:

1、本發明通過優良種子無菌培養獲取無菌實生苗,在無菌材料獲取方面僅對種子進行了消毒處理,避免了直接對幼苗等幼嫩材料進行消毒處理造成的損傷。

2、本發明采用苗齡為1~10天的杉木實生幼苗為材料,其組織幼嫩,細胞分生能力強,各組織或器官均能較好地誘導愈傷組織形成。

3、本發明采用激素2,4-D?和KT結合進行愈傷組織誘導,可獲得較高的誘導效率。

4、本發明采用KT和IBA作為增殖激素,其增殖速率快,愈傷組織質地緊實,較好地滿足了后續愈傷組織分化的要求。

5、本發明在愈傷組織誘導和增殖培養基中加入一定量的維生素C,可大大降低愈傷組織的褐化程度。

附圖說明

圖1為本發明的杉木無菌實生苗效果圖;

圖2為本發明的杉木葉片誘導愈傷組織發生效果圖;

圖3為本發明的杉木愈傷組織增殖效果圖。?

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進一步說明。

實施例1:

一種杉木愈傷組織培養方法,選取顆粒飽滿、無病蟲害的杉木種子作為外植體置于三角瓶內,加入濃度為1%~2%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗10?min后,置于流水下沖洗1h,然后用無菌水清洗2次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌9min,無菌水清洗8次后,將種子接種于1/2MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。待種子萌發后,剪取苗齡為1天的杉木實生苗的葉片,接種于由1/2MS+1.0?mg/L?2,4-D+0.5mg/L?KT+100?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的誘導培養基中進行誘導培養。第2天葉片開始卷曲,第3天葉片傷口處或葉邊緣長愈傷組織,愈傷組織的顏色最初為嫩黃色,隨著愈傷組織增多其顏色逐漸變成棕黃色,無褐變,20天后,愈傷組織誘導率為100%。取出誘導而得的愈傷組織,切成小塊,接種于由1/2MS+1.00mg/L?KT+0.5mg/L?IBA+100mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的增殖培養基中,愈傷組織生長迅速,顏色由棕黃色轉變為翠綠色,質地緊實,少數愈傷組織底部輕微褐變,月增殖倍數為5.48。

實施例2:

一種杉木愈傷組織培養方法,選取顆粒飽滿、無病蟲害的杉木種子作為外植體置于三角瓶內,加入濃度為1%~2%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗15?min后,置于流水下沖洗1.5h,然后用無菌水清洗3次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌10min,無菌水清洗8次后,將種子接種于3/4MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。待種子萌發后,剪取苗齡為5天的杉木實生苗的葉片,接種于由1/2MS+2.0?mg/L?2,4-D+0.5mg/L?KT+130?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的誘導培養基中進行誘導培養。第3天葉片開始卷曲,第5天葉片傷口處或葉邊緣長愈傷組織,愈傷組織的顏色最初為嫩黃色,隨著愈傷組織增多其顏色逐漸變成棕黃色,無褐變,20天后,愈傷組織誘導率為100%。取出誘導而得的愈傷組織,切成小塊,接種于由1/2MS+2.0mg/L?KT+0.5mg/L?IBA+130?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的增殖培養基中,愈傷組織生長迅速,顏色由棕黃色轉變為翠綠色,質地緊實,無褐變,月增殖倍數為5.97。

實施例3:

一種杉木愈傷組織培養方法,選取顆粒飽滿、無病蟲害的杉木種子作為外植體置于三角瓶內,加入濃度為2%~3%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗12min后,置于流水下沖洗2h,然后用無菌水清洗2次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌10min,無菌水清洗9次后,將種子接種于MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。待種子萌發后,剪取苗齡為8天的杉木實生苗的葉片,接種于由1/2MS+2.0?mg/L?2,4-D+1.0mg/L?KT+150?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的誘導培養基中進行誘導培養。第3天葉片開始卷曲,第10天葉片傷口處或葉邊緣長愈傷組織,愈傷組織的顏色最初為嫩黃色,隨著愈傷組織增多其顏色逐漸變成棕黃色,無褐變,20天后,愈傷組織誘導率為100%。取出誘導而得的愈傷組織,切成小塊,接種于由1/2MS+2.0mg/L?KT+1.0mg/L?IBA+150?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的增殖培養基中,愈傷組織生長迅速,顏色由棕黃色轉變為翠綠色,質地緊實,無褐變,月增殖倍數為5.73。

實施例4:

一種杉木愈傷組織培養方法,選取顆粒飽滿、無病蟲害的杉木種子作為外植體置于三角瓶內,加入濃度為2%~3%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗13?min后,置于流水下沖洗1h,然后用無菌水清洗2次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌12min,無菌水清洗10次后,將種子接種于MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。待種子萌發后,剪取苗齡為10天的杉木實生苗的葉片,接種于由1/2MS+2.0?mg/L?2,4-D+1.5mg/L?KT+100?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的誘導培養基中進行誘導培養。第4天葉片開始卷曲,第12天葉片傷口處或葉邊緣長愈傷組織,愈傷組織的顏色最初為嫩黃色,隨著愈傷組織增多其顏色逐漸變成棕黃色,無褐變,20天后,愈傷組織誘導率為100%。取出誘導而得的愈傷組織,切成小塊,接種于由1/2MS+2.0mg/L?KT+1.5mg/L?IBA+100?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的增殖培養基中,愈傷組織生長迅速,顏色由棕黃色轉變為翠綠色,結構致密,增殖生長出的愈傷組織無褐變,月增殖倍數為6.31。

實施例5:

一種杉木愈傷組織培養方法,選取顆粒飽滿、無病蟲害的杉木種子作為外植體置于三角瓶內,加入濃度為3%~4%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗15?min后,置于流水下沖洗2h,然后用無菌水清洗3次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌12min,無菌水清洗10次后,將種子接種于MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。待種子萌發后,剪取苗齡為2天的杉木實生苗的莖段,接種于由1/2MS+2.0?mg/L?2,4-D+1.0mg/L?KT+150?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的誘導培養基中進行誘導培養。第4天莖段開始膨大,第10天莖段切口處長出愈傷組織,愈傷組織的顏色最初為嫩黃色,隨著愈傷組織增多其顏色逐漸變成棕黃色,無褐變,20天后,愈傷組織誘導率為96.7%。取出誘導而得的愈傷組織,切成小塊,接種于由1/2MS+2.0mg/L?KT+1.0mg/L?IBA+130?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的增殖培養基中,愈傷組織生長迅速,顏色由棕黃色轉變為翠綠色,質地致密,無褐變,月增殖倍數為6.59。

實施例6:

一種杉木愈傷組織培養方法,選取顆粒飽滿、無病蟲害的杉木種子作為外植體置于三角瓶內,加入濃度為3~4%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗15?min后,置于流水下沖洗2h,然后用無菌水清洗3次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌12min,無菌水清洗10次后,將種子接種于MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。待種子萌發后,剪取苗齡為3天的杉木實生苗的根系,接種于由1/2MS+2.0?mg/L?2,4-D+1.5mg/L?KT+150?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的誘導培養基中進行誘導培養。第5天根尖開始膨大,第10天根尖處長出愈傷組織,愈傷組織顏色為淡棕黃色,20天后,愈傷組織誘導率為100%。取出誘導而得的愈傷組織,切成小塊,接種于由1/2M+2.0mg/L?KT+1.0mg/L?IBA+150?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的增殖培養基中,愈傷組織生長迅速,顏色由淡棕黃色轉變為翠綠色,結構致密,無褐變,月增殖倍數為6.18。

實施例7:

一種杉木愈傷組織培養方法,選取顆粒飽滿、無病蟲害的杉木種子作為外植體置于三角瓶內,加入濃度為4%~5%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗15?min后,置于流水下沖洗2h,然后用無菌水清洗3次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌12min,無菌水清洗10次后,將種子接種于MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。待種子萌發后,剪取苗齡為2天的杉木實生苗的葉片,接種于由MS+1.5?mg/L?2,4-D+1.0mg/L?KT+120?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的的誘導培養基中進行誘導培養。第2天葉片開始卷曲膨大,第4后葉片傷口處或葉邊緣長出愈傷組織,愈傷組織顏色為淡棕黃色,20天后,愈傷組織誘導率為100%。取出誘導而得的愈傷組織,切成小塊,接種于由MS+1.5mg/L?KT+1.0mg/L?IBA+120mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的增殖培養基中,愈傷組織生長迅速,顏色由棕黃色轉變為翠綠色,結構致密,無褐變,月增殖倍數為6.73。

實施例8:

一種杉木愈傷組織培養方法,選取顆粒飽滿、無病蟲害的杉木種子作為外植體置于三角瓶內,加入濃度為4%~5%的洗潔精溶液,采用紗布封住瓶口,置于搖床上振蕩漂洗15?min后,置于流水下沖洗2h,然后用無菌水清洗3次,將種子轉到超凈工作臺上用0.15%升汞溶液滅菌12min,無菌水清洗10次后,將種子接種于MS培養基上進行培養,獲取無菌實生苗。待種子萌發后,剪取苗齡為10天的杉木實生苗的根系,接種于由MS+2.0?mg/L?2,4-D+1.5mg/L?KT+150?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的誘導培養基中進行誘導培養。第5天根尖開始膨大,第12天根尖處長出愈傷組織,愈傷組織顏色為淡棕黃色,20天后,愈傷組織誘導率為100%。取出誘導而得的愈傷組織,切成小塊,接種于由MS+2.0mg/L?KT+1.5mg/L?IBA+150?mg/L維生素C+0.75%瓊脂+3.0%蔗糖組成的增殖培養基中,愈傷組織生長迅速,顏色由棕黃色轉變為翠綠色,結構致密,無褐變,月增殖倍數為6.20。

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