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犬冠狀病毒疫苗.pdf

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冠狀病毒 疫苗
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摘要
申請專利號:

CN201280030171.8

申請日:

20120626

公開號:

CN103687615A

公開日:

20140326

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/215,C07K14/165,C12N7/00,C12N15/33 主分類號: A61K39/215,C07K14/165,C12N7/00,C12N15/33
申請人: 尼古拉·德卡羅,維托·馬爾泰拉,加布里埃拉·伊利亞,卡尼奧·伯納沃格利亞
發明人: 尼古拉·德卡羅,維托·馬爾泰拉,加布里埃拉·伊利亞,卡尼奧·伯納沃格利亞
地址: 意大利巴里
優先權: MI2011A001182
專利代理機構: 北京市中咨律師事務所 代理人: 凌立;黃革生
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280030171.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明描述了具有降低的致病性且能夠引發免疫反應的新的泛嗜性犬冠狀病毒(CCoV)毒株。

權利要求書

1.分離的犬冠狀病毒(CCoV),其不表達功能性輔助蛋白3c。2.權利要求1的分離的CCoV,其包含與SEQ?ID?NO:1或其互補鏈具有至少95%同源性的分離的多核苷酸。3.權利要求1或2的分離的CCoV,其包含具有SEQ?ID?NO:5的多肽。4.權利要求1-3中任一項的分離的CCoV,其包含具有SEQ?ID?NO:4的多肽。5.權利要求1-3中任一項的分離的CCoV,其包含具有SEQ?ID?NO:2或6-10中任一個的多肽。6.權利要求1-5中任一項的分離的CCoV,其是滅活的。7.權利要求1-5中任一項的分離的CCoV,其是減毒的。8.權利要求1-5中任一項的分離的CCoV,其處于純化的亞單位形式。9.來自犬冠狀病毒(CCoV)的分離的多核苷酸,其中所述分離的多核苷酸與SEQ?ID?NO:1或其互補鏈具有至少95%同源性,條件是所述多核苷酸不包含CB/05毒株多核苷酸。10.權利要求9的分離的多核苷酸,其中所述多核苷酸不編碼功能性輔助蛋白3c。11.權利要求9或10的分離的多核苷酸,其中所述多核苷酸不編碼功能性輔助蛋白3b。12.權利要求9—11中任一項的分離的多核苷酸,其由SEQ?ID?NO:1或其互補鏈組成。13.組合物,其包含分離的SEQ?ID?NO:5的多肽。14.免疫原性組合物,其包含以下至少一種:(a)權利要求1至8中任一項的分離的犬冠狀病毒(CCoV);(b)權利要求9至12中任一項的分離的多核苷酸;或(c)權利要求13的多肽;及可藥用賦形劑、稀釋劑、載體蛋白質或佐劑。15.權利要求14的免疫原性組合物,其包含滅活或減毒形式的分離的CCoV。16.權利要求14的免疫原性組合物,其包含權利要求13的多肽,其中所述多肽是所述分離的犬冠狀病毒(CCoV)的亞單位抗原。17.權利要求14-16中任一項的免疫原性組合物,其中所述組合物不包含功能性輔助蛋白3c。18.權利要求14-17中任一項的免疫原性組合物,其用于在犬中治療或預防冠狀病毒感染。19.權利要求14-17中任一項的免疫原性組合物的用途,用于制備用于在犬中治療或預防冠狀病毒感染的藥物。20.在犬中治療或預防冠狀病毒感染的方法,其包括以在所述犬中產生免疫原性反應的有效量施用權利要求14-17中任一項的免疫原性組合物。21.犬冠狀病毒(CCoV)疫苗,其包含(a)權利要求1至8中任一項的分離的犬冠狀病毒(CCoV);(b)權利要求9至12中任一項的分離的多核苷酸;或(c)權利要求13的多肽。

說明書

技術領域

本發明描述了新的泛嗜性犬冠狀病毒(CCoV)毒株的分離,以及包含CCoV毒株的新的免疫原性組合物的產生。尤其是通過序列分析在分子和生物學水平表征了該毒株。

背景技術

冠狀病毒是在人類和鳥類中引起呼吸道和/或腸道疾病的大的有包膜單鏈RNA病毒(18)。在犬中,迄今已描述了三種冠狀病毒。犬冠狀病毒(CCoV)I型和II型是隸屬于抗原組1的腸道病毒(13),而最先由Erles等在英國報道(19)的犬呼吸道冠狀病毒(CRCoV)是2組冠狀病毒,其尤其是在與其他病原體結合時引起呼吸性窘迫(1,9)。

I型和II型CCoV廣泛分布在歐洲(7,14),通常是造成小犬中出現輕度至中度胃腸炎的原因,雖然死亡可以由于同時受兩種基因型(5)或受其他病原體(3-11)感染而發生。單一CCoV感染通常限于胃腸道,導致出現食欲缺乏、腹瀉和嘔吐(Tennant等,1991)。

由于廣泛分布的與CCoV相關的感染,存在對能夠在犬中保護免受CCoV感染的疫苗的需要。

發明概述

本發明提供分離的不表達功能性輔助蛋白3c的泛嗜性犬冠狀病毒(CCoV)。更具體而言,該CCoV毒株也不表達功能性輔助蛋白3b。在另一實施方案中,該分離的CCoV毒株包含分離的與SEQ?ID?NO:1或其互補鏈具有至少95%同源性的多核苷酸。在另一實施方案中,通過化學處理或加熱來滅活該CCoV毒株。在另一實施方案中,該CCoV毒株是減毒的。在另一實施方案中,該分離的CCoV包含SEQ?ID?NO:5。

本發明還提供來自犬冠狀病毒(CCoV)的分離的多核苷酸,其中該分離的多核苷酸與SEQ?ID?NO:1或其互補鏈具有至少95%同源性。更具體而言,該多核苷酸不編碼功能性輔助蛋白3c。在另一實施方案中,該多核苷酸不編碼功能性輔助蛋白3b。在另一實施方案中,該分離的多核苷酸由SEQ?ID?NO:1或其互補鏈組成。

本發明的另一實施方案提供來自CCoV的分離的多肽或由與SEQ?ID?NO:1具有至少95%同源性的多核苷酸編碼的多種多肽。更具體而言,該多核苷酸不包含CB/05毒株多核苷酸。在另一實施方案中,該多肽與SEQ?ID?NO:2-10中任一個具有至少95%同源性。更具體而言,該多肽選自SEQ?ID?NO:4或5中的任一個。還更具體而言,該多肽是SEQ?ID?NO:5。

本發明的另一實施方案提供免疫原性組合物,其包含以下至少一種:(a)本文所述的多核苷酸、多肽或分離的犬冠狀病毒(CCoV);及可藥用賦形劑、稀釋劑、載體蛋白質或佐劑。在另一實施方案中,該免疫原性組合物包含該分離的犬冠狀病毒(CCoV)的滅活或減毒形式。在另一實施方案中,該免疫原性組合物包含分離的來自CCoV的多肽或由與SEQ?ID?NO:1具有至少95%同源性的多核苷酸編碼的多種多肽,其中該一種或多種多肽是該分離的CCoV的亞單位抗原。在另一實施方案中,該組合物不包含輔助蛋白3c。在另一實施方案中,該組合物不包含輔助蛋白3b。

本發明的另一實施方案提供上文所述的免疫原性組合物,用于在犬中治療或預防冠狀病毒感染。另一實施方案提供該免疫原性組合物在制備用于在犬中治療或預防冠狀病毒感染的藥物中的用途。另一實施方案提供在犬中治療或預防冠狀病毒感染的方法,其包括以在犬中產生免疫原性反應的有效量施用該免疫原性組合物。

本發明的另一實施方案提供犬冠狀病毒(CCoV)疫苗,其包含以下至少一種:(a)上文所述的多核苷酸;(b)上文所述的多肽;和/或(3)上文所述的分離的犬冠狀病毒(CCoV)毒株。

本發明的這些及其他實施方案、特征和優勢將從下文所示的發明詳述和所附權利要求變得明顯。

附圖簡述

附圖說明本文所述新的CCoV毒株的系統發生關系。在系統發生水平,毒株450/07在S和M/N蛋白質序列中都與毒株CB/05聚類,盡管M/N序列中還顯示最近檢測到的與重組CCoV/TGEV毒株(CCoV-IIb)的嚴格相關性。

發明詳述

在2005年,從一些死去的小犬的內部器官分離了CCoV的泛嗜性變體(毒株CB/05)(2),該病毒分類為CCoV-II的高毒性(hypervirulent)生物型,其與隸屬于此基因型的參考毒株具有高度遺傳同源性(9-12)。已提出S蛋白中的幾個aa變化(包括殘基125處Asp/His至Asn的突變)和ORF3b中38nt的缺失作為毒株CB/05的高致病性的潛在標記(9-12)。通過實驗性感染CCoV血清反應陰性小犬證明了該病毒分離株滿足Koch的假設,該實驗性感染顯示嚴重的臨床病征,包括明顯的淋巴細胞減少和死亡率(13)。在隨后的實驗中,觀察到了驚人的發現。實際上,從最近由向腸性CCoV毒株引起的感染恢復的血清反應陽性犬對隨后的毒株CB/05的實驗性攻擊易感,顯示輕度的臨床病征和淋巴細胞減少(14)。這可以解釋對腸道CCoV(因此,用腸道毒株制備的目前可用的CCoV疫苗)的泛嗜性變體的有限的交叉保護。

在本申請中,我們從已在全身性疾病后死亡的小犬的肺分離了新的泛嗜性CCoV毒株。在遺傳水平表征了該病毒,在由病毒基因組的3’端編碼的所有蛋白質中都顯示與原型毒株CB/05的密切相關性(超過99%的aa同一性)。S蛋白的氨基酸125顯示正如毒株CB/05的Asn殘基,還確認了ORF3b中38nt的缺失,但新毒株在ORF3c中顯示附加的164缺失,其可能阻止了所編碼的輔助蛋白的合成。認為冠狀病毒輔助蛋白基因并非體外復制所必需,但它們在感染天然宿主期間嚴格維持(26)。在兩種泛嗜性CCoV毒株中,輔助蛋白3b是截短的(22個aa,而不是其他CCoV的相同基因編碼的71個aa),在最近的一種(450/07)中,由于在基因的5’端中存在早期終止密碼子而不可能合成ORF3c產物。已提出貓冠狀病毒的輔助蛋白基因中相似的缺失在通過其高毒性生物型貓感染性腹膜炎病毒顯示的增強的致病性中發揮某種作用(21)。在毒株CB/05和450/07之間觀察到的密切的遺傳相關性與該新毒株是原型病毒的直接后代的假說一致。向腸性CCoV-II毒株通常涉及近年已檢測到的CB/05,但它們中沒有一種在輔助蛋白基因中顯示缺失(9-12)。因此,毒株450/07可以通過ORF3c中附加的164nt的缺失源自原型病毒。

在生物學水平,分離株CB/05和450/07都能夠感染小犬并擴散至它們的內部器官,引起全身性疾病和淋巴細胞減少。但是,盡管它們密切的遺傳相關性,這兩種病毒顯示不同程度的致病性。在實驗條件下,原型病毒引起嚴重的疾病形式,所感染的五只小犬中有兩只死亡,而新毒株在大多數受攻擊的小犬中僅誘導輕度至中度臨床病征。重要地,淋巴細胞減少在毒株CB/05感染的小犬(在所有動物中達到低于基線值的60%的淋巴細胞計數)中比在新的泛嗜性毒株攻擊的那些中更顯著,新的泛嗜性毒株僅在很少的小犬中顯示淋巴細胞數目的明顯減少。此外,與毒株CB/05相比,新病毒誘導的死后發現的嚴重程度較低,甚至糞便和內部器官中的病毒RNA效價也更低。此行為可以表明,就原型泛嗜性分離株而言,毒株450/07對犬的致病潛能更低。從流行病學的觀點看,從死去的小犬分離新的泛嗜性CcoV毒株值得注意,因為它似乎表明此變體在犬中循環。還針對新的分離株450/07證明(雖然在較低程度上)了毒株CB/05的泛嗜性和淋巴細胞減少屬性,此生物學行為暫時性地與幾個獨特的遺傳變化(突起蛋白(spike?protein)的殘基125處存在Asn)相關。具有泛嗜性和淋巴細胞減少屬性的CCoV簇的循環強調以腸道CCoV誘導的弱交叉保護為基礎發展同源疫苗的需要(14)。

因此,本發明的一個實施方案提供包含不表達功能性輔助蛋白3c的CCoV毒株的疫苗或免疫原性組合物。另一實施方案提供分離的不表達功能性輔助蛋白3c的犬冠狀病毒(CCoV)。更具體而言,該分離的CCoV包含與SEQ?ID?NO:1或其互補鏈具有至少95%同源性的多核苷酸。在另一實施方案中,該分離的CCoV包含具有SEQ?ID?NO:5的多肽。在另一實施方案中,該分離的CCoV包含具有SEQ?ID?NO:4的多肽。在另一實施方案中,該分離的CCoV包含具有SEQ?ID?NO:2或6—10中任一個的多肽。在另一實施方案中,該分離的CCoV通過化學處理或加熱來滅活,是減毒的或是純化的亞單位形式。

本發明的另一實施方案提供分離的來自犬冠狀病毒(CCoV)的多核苷酸,其中該分離的多核苷酸與SEQ?ID?NO:1或其互補鏈具有至少95%同源性。在另一實施方案中,該多核苷酸不編碼功能性輔助蛋白3c。在另一實施方案中,該多核苷酸不編碼功能性輔助蛋白3b。

在另一實施方案中,該多核苷酸由SEQ?ID?NO:1或其互補鏈組成。

本發明的另一實施方案提供包含分離的SEQ?ID?NO:5的多肽的組合物。

另一實施方案提供免疫原性組合物,其包含以下至少一種:(a)分離的犬冠狀病毒(CCoV);(b)分離的多核苷酸;和/或(c)本文所述的多肽;及可藥用賦形劑、稀釋劑、載體蛋白質或佐劑。

在另一實施方案中,該免疫原性組合物用于在犬中治療或預防冠狀病毒感染。另一實施方案提供該免疫原性組合物在制備用于在犬中治療或預防冠狀病毒感染的藥物中的用途。另一實施方案提供在犬中治療或預防冠狀病毒感染的方法,其包括以在犬中產生免疫原性反應的有效量施用該免疫原性組合物。

最后,另一實施方案提供犬冠狀病毒(CCoV)疫苗,其包含(a)分離的犬冠狀病毒(CCoV);(b)分離的多核苷酸;和/或(c)本文所述的多肽。

縮略詞和定義

除非另有說明,在本申請通篇中使用以下縮略詞和定義。按照此發明詳述,以下縮略詞和定義適用。必須指出,除非文中清楚地另有說明,本文所用的單數形式“一”、“一個”和“該”包括復數指代物。因此,例如,提到“一種抗體”包括多個這類抗體,提到“該劑量”包括提到一個或多個劑量及其本領域技術人員已知的等同物,等等。

縮略詞

aa????????氨基酸

CaHV??????犬皰疹病毒

CCoV??????犬冠狀病毒

CDV???????犬瘟熱病毒

CPE???????致致細胞病變效應

CPV???????犬細小病毒

CRM197????白喉類毒素交叉反應性物質197(gly52glu)

D-MEM?????Dulbecco極限必需培養基

EDTA??????乙二胺四乙酸

FCA???????弗氏完全佐劑

IFA???????弗式不完全佐劑

h?????????小時

i.m.??????肌內

IF????????免疫熒光

i.p.??????腹膜內

i.v.??????靜脈內

IgG???????免疫球蛋白G

ISCOM?????免疫刺激復合物

KLH???????來自巨孔匙(Megathura?crenulata)的血藍蛋白(“匙孔槭血”)

KMUA??????N-k-馬來酰亞胺基十一酸

KMUS??????(N-[k-馬來酰亞胺基十一酰基氧基磺基琥珀酰亞胺酯)

L?????????液體

LPS?????脂多糖

LT??????不耐熱毒素

MDP?????胞壁酰二肽,也稱為N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺

min?????分鐘

NO??????未觀察到

orf?????可讀框

p.o.????口服

PBS?????磷酸緩沖鹽溶液

PBST????含吐溫20的PBS

Poly?rA:Poly?rU??聚-腺苷酸-聚-尿苷酸復合物

POP-POE?聚氧丙烯聚氧乙烯

PT??????百日咳毒素

RAS?????RibiTM佐劑系統

RPM?????轉/分鐘

s.c.????皮下

TCID50??半數組織培養感染劑量

TGEV????傳染性胃腸炎冠狀病毒(Purdue毒株)

TNF?????腫瘤壞死因子

WBC?????白細胞

wk??????周

wt??????重量

定義

除非另有說明,本文中使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員的通常理解相同的含義。下文提供以下術語。

“免疫原性組合物”是含有免疫原(包括例如蛋白質;肽;全細胞;滅活、亞單位或減毒的病毒;或多糖;或其組合)的制劑,施用其來針對存在于該免疫原性組合物中的一種或多種抗原刺激受體的體液和細胞免疫系統。“免疫”是施用免疫原性組合物并在宿主中刺激對抗原的免疫或免疫原性反應的過程。

“免疫反應”指免疫系統與抗原接觸后的活動,包括特異性細胞毒性T細胞和B細胞的激活和增殖,導致抗原特異性抗體產生。

“抗原”是引發免疫反應的任意物質,例如蛋白質(或蛋白質的免疫原性片段,如黏附蛋白的片段)、肽或肽綴合物、免疫原、或多糖。在這種情況下,抗原優選包含冠狀病毒抗原。免疫原性組合物可以包含一種或多種冠狀病毒抗原或免疫原。

“單位劑量”是免疫原性組合物的確定和預定的濃度或量,其對在該組合物的受體中引發免疫反應安全和有效。

術語“亞單位”指從毒性宿主生物分開的抗原性物質的懸液。

本文所用的術語“治療”意指處理和/或預防。通過抑制、緩解、預防或消除由CCoV引起的疾病狀態來獲得療效。

本文所用的術語“有效量”意指通過諸如本領域已知的接種和/或治療冠狀病毒感染(例如CCoV感染)的考慮確定的量,其中它對在所處理的個體中提供可測量的減輕有效,如顯示改善,其包括但不限于改善的存活率、更快的恢復、癥狀的改善或消除、感染后并發癥的減少及(在合適的情況下)抗傳染物的抗體效價或提高的效價和本領域技術人員已知的其他測量(例如通過血液樣品測量)。

術語“分離的”指處于基本上純的形式(例如純度高于約95%)或以某種方式從它的天然環境純化的物質。“分離的”毒株(例如CCoV)指從它的天然環境(如從宿主動物/犬)取出和/或在生長培養基中的毒株。術語“分離的”涵蓋與其他物質/稀釋劑/賦形劑/佐劑一起處在溶液中的免疫原或CCoV毒株。

免疫原性組合物的“胃腸外”施用包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌內(i.m.)或胸骨內注射或輸注技術。

“可藥用的”意指并非在生物學上或在其他方面不希望的物質,即可以對個體施用而不引起不可接受的生物學作用(即死亡),或不以有害方式與它所包含在其中的組合物的任意其他成分相互作用的物質。

“佐劑”意指對增強免疫原性組合物的免疫原性的物質。因此,常提供佐劑來加強免疫反應,且為本領域公知。希望得到的佐劑的特征包括:(1)毒性的缺乏;(2)刺激持久的免疫反應的能力;(3)制備的簡單性和長期保存的穩定性;(4)針對通過多種途徑(如果需要)施用的抗原引發細胞介導免疫(CMI)和體液免疫反應(HIR)的能力;(5)與其他佐劑的協同;(6)與抗原呈遞細胞的群體選擇性相互作用的能力;(7)特異性引發適當的Th1或Th2細胞特異性免疫反應的能力;和(8)選擇性提高抗抗原的適當抗體同種型水平(例如IgA)的能力。

因此,在某些實施方案中,本文所述的免疫原性組合物還包含一種或多種佐劑。佐劑是在與免疫原或抗原一起施用時增強免疫反應的物質。已顯示許多細胞因子或淋巴因子具有免疫調節活性,并因此用作佐劑,其包括但不限于:白細胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(見例如美國專利號5,723,127)、13、14、15、16、17和18(及其突變體形式);干擾素-α、-β和-γ;粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(見例如美國專利號5,078,996和ATCC檢索號39900);巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF);粒細胞集落刺激因子(G-CSF);及腫瘤壞死因子α和β。用于本文所述的免疫原性組合物的其他佐劑還包括趨化因子,其非限制性地包括MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES;黏附分子,如選擇蛋白,例如L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白;黏蛋白樣分子,例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1;整聯蛋白家族的成員,如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95;免疫球蛋白超家族的成員,如PECAM、ICAM(例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3)、CD2和LFA-3;共刺激分子,如CD40和CD40L;生長因子,包括血管生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管內皮生長因子;受體分子,包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6;及胱天蛋白酶(ICE)。

用來增強免疫反應的適宜佐劑進一步非限制性地包括描述于美國專利號4,912,094中的MPLTM(3-O-脫酰單磷酰脂質A,Corixa,Hamilton,MT)。同樣適合用作佐劑的是合成的脂質A類似物或氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP),或其衍生物或類似物,其可從Corixa(Hamilton,MT)獲得,且描述于美國專利號6,113,918中。一個這種AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰胺基]乙基2-脫氧-4-O-磷酰-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰-氨基]-b-D-吡喃葡糖苷,其還稱為529(之前稱為RC529)。將此529佐劑配制為水性形式(AE)或配制為穩定乳劑(SE)。

其他佐劑還包括胞壁酰肽,如N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE);水包油型乳劑,如MF59(國際PCT公開號WO90/14837)(包含5%角鯊烯、0.5%Tween80和0.5%Span85(可選地包含多種量的MTP-PE),用諸如Model110Y高壓微射流設備(microfluidizer)(Microfluidics,Newton,MA)的高壓微射流設備配制為亞微米粒子)和SAF(包含10%角鯊烯、0.4%Tween80、5%普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L121和thr-MDP,高壓微射流為亞微米乳劑或渦旋來產生更大顆粒大小的乳劑);弗式不完全佐劑(IFA);鋁鹽(明礬),如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁;白榴石(Amphigen);Avridine;L121/角鯊烯;D-交酯-聚交酯/糖苷;普盧蘭尼克多元醇;滅活的博德特桿菌屬(Bordetella);皂苷,如描述于美國專利號5,057,540中的StimulonTM?QS-21(Antigenics,Framingham,MA.)、描述于美國專利號5,254,339中的ISCOMATRIX(CSL?Limited,Parkville,澳大利亞)和免疫刺激復合物(ISCOMS);結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis);細菌脂多糖;合成多核苷酸,如含有CpG基序的寡核苷酸(例如美國專利號6,207,646);描述于歐洲專利號1,296,713和1,326,634中的IC-31(Intercell?AG,?Vienna,奧地利);百日咳毒素(PT)或其突變體、霍亂毒素或其突變體(例如國際PCT公開號WO00/18434、WO02/098368和WO02/098369);或大腸桿菌(E.?coli)不耐熱毒素(LT),尤其是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129;見例如國際PCT公開號WO93/13302和WO92/19265。

示例性常規載體蛋白質也可以與本文所述的免疫原性組合物/抗原/CCoV毒株一起使用。載體蛋白質優選是無毒性和無致反應性且可以以足夠的量和純度獲得的蛋白質。載體蛋白質應順從標準綴合方法。在具體實施方案中,用CRM197作為載體蛋白質。在其他實施方案中,本發明的載體蛋白質是無酶促反應活性的鏈球菌C5a肽酶(SCP)(例如,描述于美國專利號6,270,775、6,355,255和6,951,653中的SCP變體中的一種或多種)。其他適宜的載體蛋白質包括滅活的細菌毒素,如破傷風類毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如描述于國際PCT公開號WO2004/083251中的CT?E29H)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、大腸桿菌DnaK蛋白質和來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)的外毒素A。還可以使用細菌外膜蛋白,如外膜復合物c(OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素毒素(例如美國專利號5,565,204)、肺炎球菌溶血素類毒素(例如國際PCT公開號WO2005/108580)、肺炎球菌表面蛋白質A(PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白質(PsaA)或流感嗜血桿菌(Haemophilus?influenzae)蛋白D。還可以使用細菌熱休克蛋白,如分枝桿菌hsp-70。還可以使用其他蛋白質,如表皮葡萄球菌(Staphylococcus?epidermidis)蛋白質SdrG、SitC和鉻鐵結合蛋白,及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)蛋白質ClfA、ClfB和FnbA。還可以用其他蛋白質作為載體蛋白質,如卵清蛋白、鑰孔槭血藍蛋白(KLH)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、牛血清白蛋白(BSA)、半乳糖激酶(galK)、泛素、β-半乳糖苷酶、流感NS1蛋白質或結核菌素的純化的蛋白質衍生物(PPD)。還可以使用例如來自輪狀病毒VP6或來自噬菌體Qβ的病毒樣顆粒。

本領域技術人員可以容易地選擇適當的載體用于此背景。用于將化合物偶聯至載體蛋白質的方法為本領域已知,見例如Ed?Harlow?and?David?Lane,Antibodies:A?Laboratory?Manual(1988);和Greg?T.Hermanson,Bioconjugate?Techniques(Academic?Press1996)。

所公開的組合物可以以多種方式施用。應指出,含有一種或多種免疫原的藥物組合物可以單獨施用,或與一種或多種可藥用載體、穩定劑、防腐劑、著色劑、調味劑和賦形劑組合施用。

可以用按照通常實施選擇的常規載體和賦形劑配制所公開的CCoV和相關組合物。水性制劑以無菌形式配制,且在預期用于通過口服施用之外的途徑遞送時通常是等滲的。所有制劑可選地包含賦形劑,如例如Handbook?of?Pharmaceutical?Excipients(第5版,Raymond?C.Rowe等,編輯,2006)中提供的那些。賦形劑包括抗壞血酸和其他抗氧化劑、螯合劑(例如EGTA和EDTA)、糖類(例如糊精)、羥烷基纖維素、羥烷基甲基纖維素、硬脂酸等。制劑的pH在約3至約11的范圍內,但通常為約7至約10。

用于口服施用之外的給藥途徑的生理可用載體的實例包括但不限于鹽溶液(例如正常鹽水、林格液、PBS(磷酸緩沖鹽溶液);多乙氧基醚;L-精氨酸;聚乙烯吡咯烷酮;α-d-吡喃葡糖基(glucopyranosyl);α-d-吡喃葡糖苷(海藻糖);及其組合。例如,海藻糖可以以組合物的從約2%至10%重量/體積的量存在于組合物中。在另一實例中,在海藻糖和多乙氧基醚都存在于組合物中時,海藻糖可以以約4%至約6%重量/體積的量存在,多乙氧基醚可以以約0.001%至0.01%(重量/體積)的量存在,且通常是多種生理上相容的鹽(包括鉀鹽和磷酸鹽)的混合物,含或不含糖添加劑(例如葡萄糖)。

適合用于免疫原性制劑的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油和乙醇。還可以向組合物加入無毒性的助劑,如濕潤劑、緩沖劑、穩定劑或乳化劑。

如果使用,則胃腸外施用通常表征為注射。無菌注射物可以以常規形式制備,作為液體溶液或懸液,適于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式,或作為乳劑。

治療和施用的方法

對于每個受體,施用必要的組合物總量可以衍生自免疫流程。取決于犬的品種、年齡、重量和一般條件,它的施用方式,是否與另一抗原、佐劑一起施用等,所需的這類免疫原性組合物的精確量可以在犬和犬之間不同。通常,劑量將近似施用其他免疫原性組合物的典型劑量。

免疫原性組合物通常作為無菌組合物施用。可以通過任意適宜的手段,例如胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈內、真皮內、外淋巴、鼻內、胸膜內、肺內、鞘內和硬膜上)或口服來施用免疫原性組合物。其他途徑包括直腸、鼻、鼻內、局部(包括口和舌下)和陰道。應理解,優選的途徑可以例如隨受體的條件而不同。用于遞送免疫原性組合物的時間和方法的適當評價良好地處于臨床醫生/獸醫的技術之內。例如,可以在選定的日期施用第一劑量,第二劑量可以在第一劑量后幾周至幾個月施用。必要時可以施用最初的免疫原性組合物或修飾形式的附加加強劑量(例如每年)。

雖然可能單獨施用活性成分,但可以優選作為免疫原性制劑提供它們。制劑可以包含與可接受的載體、賦形劑、佐劑和/或可選地與其他非活性和/或活性成分一起的至少一種活性成分。

制劑包括適合用于前述施用途徑的那些。制劑可以方便地以單位劑量形式提供,且可以通過藥學領域公知的任意方法來制備。技術和制劑通常見于Remington′s?Pharmaceutical?Sciences(Mack?Publishing?Co.,Easton,PA)中。這類方法包括使活性成分與載體(其構成一種或多種助劑)結合的步驟。通常,通過均勻地和緊密地使活性成分與液體載體或細碎的固體載體或二者結合并在必要時成形產物來制備制劑。

本發明的乳劑的油相可以以已知的方式從已知的成分構成。雖然該相可以僅包含乳化劑(或稱為乳化劑(emulgent)),但希望包含至少一種乳化劑與脂肪或油或與脂肪和油二者的混合物。優選地,與作為穩定劑的親脂性乳化劑一起包含親水性乳化劑。還有選包含油和脂肪二者。

適合用于本發明的制劑的Emulient和乳劑穩定劑包括但不限于60(以及其他聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑)、80、十六醇十八醇混合物、芐醇、肉豆蔻醇、甘油單硬脂酸酯和十二烷基硫酸鈉。

適合用于鼻施用的制劑具有例如0.1至500微米的范圍內的顆粒大小(包括以逐漸增加的微米數(如0.5、1、30、35等)在0.1和500微米之間的范圍內的顆粒大小),其通過鼻道快速吸入來施用。適宜的制劑包括活性成分的水性或油性溶液。角鯊烯是示例性載體。

適合用于胃腸外施用的制劑包括水性和非水性、等滲、無菌注射溶液,其可以包含使得制劑與預期受體的血液等滲的抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質,及水性和非水性無菌懸液,其可以包含懸浮劑和增稠劑。

制劑以單位劑量或多劑量容器(例如密封的安瓿和小管)提供,且可以保存在冷凍干燥(凍干)條件下,僅需在使用前加入無菌液體載體,例如注射用水。從無菌粉劑及前述種類的顆粒劑制備注射溶液和懸液。

獸用載體是用于施用組合物的目的的物質,且可以是固體、液體或氣體物質,其是惰性的或在獸醫領域中可接受,且與活性成分相容。這些獸用組合物可以口服、胃腸外或通過任意其他希望的途徑施用。

本發明的制劑可以在包含任意相容載體(如多種載體、佐劑、添加劑和稀釋劑)的可注射制劑中對患病犬施用;或者用于本發明的化合物可以以緩釋皮下植入物或靶向遞送系統(如聚合物基質、脂質體和小球體)的形式對患者胃腸外施用。適合用于本發明的植入物可以采用在植入后緩慢溶解的片或本領域技術人員公知的生物相容性遞送模塊的形式。這樣設計這類公知的劑型和模塊,使得活性成分在幾天至幾周的時期內緩慢釋放。

化合物和組合物還可以與其他活性成分組合使用。根據待治療的病癥、成分的交叉反應性和組合的藥理學特性來選擇這類組合。此外,本文所述的組合物和化合物還可以與用來治療病毒感染的其他常規藥物(如抗病毒藥、解熱藥、免疫原和鎮痛藥)結合施用。這些化合物和組合物可以與使用本文所述的化合物和組合物的療法一起施用,或在與使用本文所述的化合物和組合物的療法相同的過程中施用。組合的單種成分可以在分開或組合的藥物制劑中順次或同時施用。

被動免疫療法

本文提供的另一方面是用于處理個體來誘導被動免疫的方法和組合物。可以制備包含抗醫源性感染的免疫治療劑的組合物,并對個體動物施用。然后收集來自免疫的動物的血漿,并從包含抗-CCoV的血漿收獲超免疫球蛋白和(如果包含)其他抗載體蛋白質的抗體。超免疫球蛋白可以用來誘導對冠狀病毒感染的被動免疫。

對個體犬施用免疫原性組合物來誘導體液免疫反應。然后受體作為響應免疫原性組合物而產生的免疫球蛋白(即超免疫球蛋白)的來源。免疫的個體犬獻出血漿,然后例如通過常規血漿分級分離技術從該血漿獲得超免疫球蛋白。然后對另一個體犬施用包含抗-CCoV抗體的級分,以賦予對犬冠狀病毒感染的抗性或治療犬冠狀病毒感染。

為了更清楚的理解,且為了更清楚地說明本發明,下文顯示其具體實施例。以下實施例僅是說明性的,不理解為以任意方式限制本發明的范圍和潛在的原理。

實施例

A.臨床病例

60日齡的迷你品犬(miniature?pinscher)在顯示表征為發熱(39.5-40℃)、白細胞減少((4.7×109細胞/升,參考范圍6-17×109細胞/升)、主要為淋巴細胞減少(0.5×109細胞/升,參考范圍1.0-4.8×109細胞/升)、嗜睡、食欲缺乏、嘔吐和出血性腹瀉的全身性疾病后死亡。小犬在死亡前十天已施用單劑疫苗,該疫苗包含犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬腺病毒2型、鉤端螺旋體(Leptospira?canicola)和出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospira?icterohaemorrhagie)。抗生素(羥氨芐青霉素/棒酸)和流體(乳酸林格液)的支持性療法未成功獲得臨床病癥的任何改善,其持續惡化,直至小犬死亡。

尸體剖檢顯示消化道(出血性腸炎)、扁桃體(壞死區域)、肺(纖維蛋白性肺炎)、肝(腫大和壞死區域)、脾(腫大)和腎(皮質變性)中的眼觀病變。在死后檢查期間,從腦、肺、脾、肝、腸系膜淋巴結、腎和腸內容物收集樣品。

B.RNA/DNA提取

對于RNA純化,用Tissue?lyser(QIAGEN?S.p.A.,米蘭,意大利)在Dulbecco極限必需培養基(D-MEM)中勻化(50%w/v)組織樣品,而通過渦旋在D—MEM中勻化(10%wt/vol)腸內容物。8,000×g短暫離心3分鐘后,用Viral?RNA?Mini?Kit(QIAGEN?S.p.A.)對140μl上清進行RNA提取。通過DNeasy?Tissue?Kit和QIAamp?Viral?RNA?Mini?Kit(QIAGEN?S.p.A.,米蘭,意大利)從組織樣品和腸內容物提取DNA。

C.病毒學研究

針對犬的主要病毒病原體(如CCoV(4,5)、呼吸道腸道病毒(Leary等,2002)、輪狀病毒(20)、杯狀病毒(24)、犬細小病毒2型(CPV-2)(7,8)、犬腺病毒1型和2型(23)、犬瘟熱病毒(CDV)(17)、犬皰疹病毒1型(CaHV-1)(31))的分子檢測測試了從死亡犬收集的腸內容物和組織樣品。

D.用于CCoV表征的實時RT-PCR測定

利用類型特異性實時RT-PCR測定(5,6)進行了CCoV基因型的表征。按CCoV檢測進行反轉錄和實時PCR擴增,但使用不同組的引物/探針:引物對CCoVI—F(CGTTAGTGCACTTGGAAGAAGCT)/CCoVI-R(SEQ?ID?NO:11)(ACCAGCCATTTTAAATCCTTCA)(SEQ?ID?NO:12)和探針CCoVI—Pb(FAM—CCTCTTGAAGGTACACCAA—TAMRA)(SEQ?ID?NO:13)用于CCoV?I型檢測,而引物對CCoVII—F(TAGTGCATTAGGAAGAAGCT)/CCoVII-R(SEQ?ID?NO:14)(AGCAATTTTGAACCCTTC)(SEQ?ID?NO:15)和探針CCoVII-Pb(FAM-CCTCTTGAAGGTGTGCC-TAMRA)(SEQ?ID?NO:16)用于CCoV-II檢測。熱曲線圖由以下組成:在95℃激活iTaq?DNA聚合酶10分鐘,然后是95℃變性15秒、53℃(CCoV?I型特異性測定)或48℃(CCoV?II型特異性測定)退火30秒和60℃延伸1分鐘的45個循環。

E.來自CCoV陽性肺樣品的基因組3’端的擴增和序列分析

按之前所述(9,10,11)用SuperScriptTM?One-Step?RT-PCR?for?Long?Templates(Life?Technologies,Invitrogen?srl,米蘭,意大利)擴增在肺中檢測到的泛嗜性CCoV毒株的基因組的3’端。擴增涵蓋ORF2(S基因)、3a、3b、3c、4(E基因)、5(M基因)、6(N基因)、7a和7b的七個部分重疊的片段。由Genome?Express(Meylan,法國)測序PCR擴增產物,組裝獲得的序列,并用BioEdit軟件包(22)及NCBI(htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EMBL(http://www.ebi.ac.uk)的分析工具分析。此研究中獲得的核苷酸序列在檢索號GU146061下保藏于GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。將不同ORF的核苷酸(nt)序列轉化為氨基酸(aa)序列,用氨基酸序列進行與原型泛嗜性CCoV毒株CB/05(GenBank檢索號DQ112226)和參考冠狀病毒毒株的比較分析。用Mega3(25)進行系統發生和分子進化分析。用簡約法(parsimony)和鄰接法二者制作基于毒株450/07的S和M-N蛋白的系統樹,用超過1000個重復的bootstrapping提供統計學支持。

F.病毒分離

與抗生素(青霉素5000IU/ml、鏈霉素2500μg/ml、兩性霉素B10μg/ml)一起在D-MEM中勻化(10%w/v)死亡小犬的肺,并接種入犬纖維瘤(A-72)細胞。每天針對致細胞病變效應(CPE)的出現監測感染的細胞,孵育5天后,用靶向N蛋白的單克隆抗體(Gill?Chappuis博士惠贈,Merial,法國)通過免疫熒光(IF)測定來針對CCoV抗原測試它們。

G.犬的實驗性感染

七天的馴化期后,用來自同一窩的九只10-11周齡抗體譜確定的獵兔犬來進行此攻擊研究。該研究按照動物健康和福利法規在Animal?Hospital,Faculty?of?Veterinary?Medicine?of?Bari(意大利)的分離單位進行,且由意大利衛生部批準(批準號57/2006-C)。來自研究開始前(第-10天和第-1天)采集的直腸拭子的ELISA和PCR測試顯示所有動物為CCoV血清反應陰性。犬還是來自直腸拭子的CPV脫落PCR測試陰性,但已在犬舍中進行抗CPV接種,并測試為CPV血清抗體陽性。在它們到達時將犬飼養在三個分開的房間中的單籠中進行馴化,然后在第-3天通過隨機化入兩個不同組(T01和T02,表1)來重新分配。

表1.研究設計:處理組和攻擊物質

每只犬單獨飼養用于施用攻擊,并監測臨床病征。在研究第-3、-1、3和5天稱重所有動物。在研究第0天,用含有105TCID50/mL的毒株450/07(A-72細胞上的第3代)的4mL(3.0mL口服,1.0mL鼻內;每個鼻孔0.5mL)總體積攻擊處理組T02中的6只犬。T01組中的三只對照犬通過相同的施用途徑接受相同體積的未感染的A-72細胞的冷凍裂解物。從第-1天(攻擊前)開始,只要動物仍在研究中,由主治獸醫每天監測所有犬的臨床病征。用表2中所述的評分系統評估每只動物的一般性健康。用評分來評估個體動物及其處理組的一般性健康。

表2.攻擊試驗期間一般性健康觀察的評分系統

從每只犬采集血液樣品。在研究第-3、0(攻擊前)、3和5(尸體剖檢的日子)天從頸靜脈采集EDTA血液和血清樣品分別進行全血細胞計數和血細胞分類計數及CCoV抗體的檢測。在到達時、在研究第-3天、然后每天直至研究第5天測量直腸溫度(℃)。在研究第-3、-1、3和5天采集鼻和直腸拭子。

攻擊五天后,通過靜脈內施用10mg/kg體重的100(Virbac?S.r.l.,意大利)來使所有犬鎮靜,并通過靜脈內施用0.5mL/kg體重的(Intervet?Italia,意大利)來使其安樂死。尸體剖檢期間,從小腸、腸系膜淋巴結、下頜間淋巴結和腘淋巴結、肺、肝、脾和腎采集用于病毒分離和實時RT-PCR的樣品。將新鮮組織樣品采集在D-MEM和RNA?Later?Solution(QIAGEN?S.p.A.)中分別用于病毒分離和實時RT-PCR測定,并保存在-70℃,直至使用。

通過A-72細胞上的病毒分離(9,13)和/或通過實時RT-PCR(3,4)來針對CCoV測試生活期間采集的EDTA血液樣品和糞便拭子,以及在尸體剖檢時采集的組織樣品。通過之前所述(29;13)的ELISA和病毒中和測試來在血清樣品中搜索CCoV抗體。

結果

H.死亡犬的內部器官中CB/05樣毒株的鑒定

死亡犬(450/07)的腸內容物和組織樣品除CCoV外的所有病毒病原體都測試為陰性。通過實時RT-PCR(Decaro等,2004),在肺樣品中發現了最高的病毒RNA負荷(5.81x106RNA拷貝/μL模板),但在腸內容物(8.57x105RNA拷貝/μL模板)、腸系膜淋巴結(2.31x105RNA拷貝/μL模板)、脾(1.78x104RNA拷貝/μL模板)、肝(3.43x103RNA拷貝/μL模板)、腎(7.09x103RNA拷貝/μL模板)中也檢測到了病毒。在腦樣品中僅檢測到痕量的CCoV?RNA(4.36x101RNA拷貝/μL模板)。利用基因型特異的TaqMan測定(5,6)將該病毒(毒株450/07)表征為CCoV-II。

將具有最高病毒的肺樣品用于病毒分離嘗試,如通過CPE的出現和IF測定的陽性染色確認,該嘗試在第一代就已經成功。進行了三個系列代次,以獲得毒株450/07的病毒原液用于攻擊實驗,該病毒原液具有105TCID50/mL病毒懸液的效價。針對犬的其他病毒病原體的存在及需氧和厭氧細菌、支原體和真菌的缺乏測試病毒原液,且未檢測到污染物質。

通過擴增七個重疊片段來從肺物質擴增毒株450/07的基因組的3’端。獲得的序列長度為8,618nt,且包含ORF2、3a、3b、3c、4、5、6、7a和7b的全長。S蛋白(ORF2產物)長度為1454aa,與原型毒株CB/05的長度完全一樣,新的泛嗜性分離株在此水平上與原型毒株CB/05高度相關(99.5%aa同一性)。還在其他結構蛋白中發現了高度的遺傳相關性,包括分別由ORF4、5和6編碼的E(82aa,100%同一性)、M(262aa,99.2%同一性)和N(382aa,99.7%同一性)蛋白。就原型毒株CB/05而言,ORF3a(71aa)、3b(22aa)、7a(101aa)和7b(213aa)的產物是完整的。在毒株450/07中也檢測到了見于毒株CB/05中的ORF3b中38nt的缺失,毒株CB/05在ORF3c中顯示附加的164nt的缺失。此缺失負責移碼的變化,結果在所測序的基因組區域的nt4824處引入非常早的終止密碼子,其應阻止ORF3c產物的合成。

在系統發生水平,毒株450/07在S和M/N蛋白序列二者中都與毒株CB/05聚類,盡管M/N序列中還顯示最近檢測(16)到的與重組CCoV/TGEV毒株(CCoV-IIb)的嚴格相關性(圖)。

I.實驗性感染的犬中的臨床、死后和病毒學發現

表3中顯示每天記錄的所有臨床病征的總結。

表3.對照犬(T01)中及用毒株450/07實驗性感染的犬(T02)中在研究日(D)觀察到的臨床病征的總結

NO,未觀察到。

1S,軟;L,液體。

2M,中度;S,嚴重。

與它們在第-1天(攻擊前)的(基線)體重相比,T02中的全部六只犬和T01中的三只對照犬中的一只在攻擊后第3天體重減輕。攻擊前,從第-8天至第0天,T01和T02犬中的直腸溫度在37.6℃和38.9℃之間的范圍內。對于T01犬,攻擊后的直腸溫度在37.6℃至38.4℃的范圍內,而對于T02犬,攻擊后的范圍提高至37.6℃和39.5℃之間。但是,只有一只來自T02組的犬(9319)在第4天發燒,但T02組中三只以上的犬在攻擊后顯示其直腸溫度在正常范圍內的數值提高。在T01對照犬中未觀察到此范圍變化。發現T02中用毒株450/07攻擊的兩只犬在攻擊后第3和4天沮喪或昏睡,同一組的兩只犬在攻擊后笫3和4天輕度至嚴重脫水。攻擊后第3和4天在四只T02犬中觀察到了軟糞便或腹瀉。T02中全部六只犬都出現淋巴結腫大(lymphadenomegalia),第3、4或5天在這些犬的一只(9322)中,第4和5天在兩只犬(9314和9319)上,在第5天在其他三只犬中。犬9322還在攻擊后第0、1和4天具有鼻分泌,犬9314在第5天具有減少的毛細管再充盈和蒼白黏膜。根據表2中報道的評分系統,三只對照小犬中的兩只具有0的臨床評分,因為它們未顯示任何臨床病征。T01犬中的一只在攻擊后第3和5天體重減輕,但未顯示任何其他臨床病征。此小犬因此具有4的評分,它的組顯示1.3的平均評分。但是,T02組中的全部六只小犬都顯示多種臨床病征,該病征持續一至三天,因此它們的評分在2至9的范圍內(平均值5.7)。

將第-3天和第0天每μL的淋巴細胞和WBC計數平均,并用作基線水平來與攻擊后第3天的水平相比較。淋巴細胞計數在T02中的五只犬中減少≥30%,但在T02和T01中其余的犬中低于30%。WBC計數在T02中的六只犬中的四只中減少≥30%,但在T02中其余的犬中及在所有對照犬(T01)中低于≥30%(表4)。對于犬9322,淋巴細胞計數的減少尤其顯著(就基線值而言為75%),犬9322是更早開始顯示臨床病征且還顯示最嚴重的臨床病征的犬。

表4.對照犬(T01)中及用毒株450/07實驗性感染的犬(T02)中攻擊后第3天淋巴細胞和WBC計數的百分比減少

在尸體剖檢時,四只感染的小犬在一個或多個腸節段中顯示輕度至嚴重腸炎,五只顯示腸系膜淋巴結腫大,其充血且具有分散的出血(表5)。分別在一只(9314)和兩只小犬(9314和9322)中觀察到脾腫大和腘淋巴結和/或下頜間淋巴結的涉及。僅在小犬9314中檢測到肺充血和胸腺上的出血,而在四只小犬中存在大量腹水。因此,還從病變采集了胸腺樣品和腹水的整分試樣。

表5.對照犬(T01)及用毒株450/07實驗性感染的犬(T02)a的死后發現和組織樣品中的病毒檢測的總結

LN,淋巴結;P,腘;Neg,陰性;NC,未采集。

a?CCoV效價表示為每μL模板的RNA拷貝數。

b通過病毒分離測試為陽性的組織。

c在死后檢查時顯宏觀病變的組織。

通過實時RT-PCR,三只T02小犬在第3和/或5天在其糞便中排出病毒,效價在每μL模板2.75x103至1.07x107CCoV?RNA拷貝的范圍內,僅在T02中的小犬的一份第5天血液樣品中檢測到病毒RNA(每μL模板5.73x101RNA拷貝的效價)。如基于病毒負荷所預期,僅從T02組中的9314號小犬的第3天直腸拭子分離了CCoV。通過實時RT-PCR測試從五只感染的小犬采集的幾種組織為陽性,在淋巴組織中檢測到最高的效價(表5)。在三只犬中從腸系膜淋巴結、在一只犬中從十二指腸和空腸及在來自T02的兩只犬中從回腸分離了CCoV。來自T02犬的鼻拭子和來自T01犬的任意樣品都沒有通過實時RT-PCR或病毒分離測試為CCoV陽性。

通過ELISA和VN測試二者,在任意對照犬或攻擊的犬中都未檢測到抗CCoV的血清轉化。

在上文相關部分中討論的以下參考文獻在此引入作為參考,就如同在本文中全文顯示一樣。

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