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用于不同治療應用的含熱穩定氧載體的藥物組合物.pdf

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用于 不同 治療 應用 穩定 載體 藥物 組合
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摘要
申請專利號:

CN201280034336.9

申請日:

20120711

公開號:

CN103687609B

公開日:

20160720

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K38/42,A61K47/48,A61K47/30,A61P35/00 主分類號: A61K38/42,A61K47/48,A61K47/30,A61P35/00
申請人: 億京國際有限公司
發明人: 黃炳镠,郭瑞儀,劉思行
地址: 中國香港上環
優先權: 13/179,590
專利代理機構: 北京安信方達知識產權代理有限公司 代理人: 陳建芳;閻娬斌
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280034336.9

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

提供了一種適合用于哺乳動物且不會導致腎損傷和血管收縮的高度純化的和熱穩定的、交聯的非聚合四聚體血紅蛋白。執行高溫短時(HTST)加熱加工步驟以有效地去除不合乎需要的二聚體形式的血紅蛋白、未交聯的四聚體血紅蛋白、和血漿蛋白雜質。在熱處理后和任選地在熱處理前添加N-乙酰半胱氨酸維持低水平的高鐵血紅蛋白。熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白可以改善和延長常氧和低氧組織中的氧合。在另一方面,該產品用于治療各種類型的癌癥諸白血病、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。本發明的四聚體血紅蛋白還可以用于預防手術切除腫瘤后的腫瘤轉移和復發。此外本發明的四聚體血紅蛋白可以在化療和放射治療之前施用于患者。

權利要求書

1.含有非聚合的、高度純化的和熱穩定的氧載體的組合物在制備用于在哺乳動物中減少由循環內皮祖細胞引起的癌性腫瘤復發和/或防止由循環內皮祖細胞引起的腫瘤細胞轉移的藥物中的用途,其中所述組合物包含具有高效液相色譜系統檢測不到的二聚體濃度的交聯的四聚體血紅蛋白,其中所述交聯的四聚體血紅蛋白具有60-70kDa的分子量和0.2-0.4%濃度的N-乙酰半胱氨酸。2.權利要求1所述的用途,其中所述組合物在手術去除腫瘤期間的中斷血液供應前和重建血液供應期間被施用于所述哺乳動物。3.權利要求2所述的用途,其中所述組合物以0.2g/kg-1.2g/kg所述哺乳動物的體重的范圍施用。4.權利要求1所述的用途,其中所述癌性腫瘤和腫瘤細胞是肝的或鼻咽的。5.權利要求1所述的用途,其中所述癌性腫瘤和腫瘤細胞是低氧的。6.權利要求1所述的用途,其中所述組合物不含引起血管收縮的雜質,是無致熱原的、無內毒素的、無磷脂的、無基質的和具有小于5%的高鐵血紅蛋白水平。7.權利要求6所述的用途,其中所述引起血管收縮的雜質是蛋白雜質。

說明書

相關申請的交叉引用

本申請是要求于2011年7月11日提交的美國部分繼續申請號13/179,590、目前為專利號8,048,856的優先權的國際專利申請,該美國部分繼續申請的公開內容通過引用結合于此。

版權通知/許可

本專利文件的一部分公開內容含有受版權保護的資料。版權擁有者不反對任何人對出現在美國專利商標局專利文件或記錄中的專利文件或專利公開內容的傳真印刷,但另外地完全保留所有的版權權利。下面的通知適用于如下所述以及在所附的附圖中的方法、實驗和數據:版權2010,BillionKingInternationalLimited,保留所有權利。

技術領域

本發明涉及一種用于制備含熱穩定氧載體的藥物組合物的方法和由所述方法制備的組合物。本發明還涉及所述含熱穩定氧載體的藥物組合物在人和其他動物的癌癥治療、缺氧病癥(oxygen-deprivationdisorder)和器官保存中的用途。

背景技術

血紅蛋白在大多數脊椎動物中對于血管系統和組織之間的氣體交換具有重要作用。其負責經由血液循環將氧從呼吸系統運送至機體細胞,并且還將代謝廢物二氧化碳從機體細胞運離至呼吸系統,在呼吸系統二氧化碳被呼出。由于血紅蛋白具有此氧運輸特性,因此如果其在離體(exvivo)狀態下可以被穩定并且可以在體內(invivo)使用,則其可以被用作有效的供氧器。

天然存在的血紅蛋白是四聚體,當其存在于紅細胞內時通常是穩定的。然而,當天然存在的血紅蛋白移出紅細胞時,其在血漿中變得不穩定,并且分裂成兩個α-β二聚體。這些二聚體的每一個的分子量為約32kDa。這些二聚體當通過腎臟過濾和排泄時可能導致顯著的腎損傷。四聚體鍵的斷裂還負面地影響了功能性血紅蛋白在循環系統中存在的持久性。

為了解決這個問題,近年來在血紅蛋白加工方面的發展已經結合了多種交聯技術來形成四聚體內的分子內鍵以及四聚體之間的分子間鍵,從而形成聚合血紅蛋白。現有技術教導聚合血紅蛋白是增加血紅蛋白的循環半衰期的優選形式。然而,本發明人確定,聚合血紅蛋白在血液循環中更容易轉變成為高鐵血紅蛋白。高鐵血紅蛋白不能結合氧因此不能氧合組織。因此,現有技術教導的導致形成聚合血紅蛋白的交聯作用是有問題的。在本領域中存在著對允許分子內交聯從而形成穩定的四聚體而不同時形成聚合血紅蛋白的技術的需求。

現有技術為穩定血紅蛋白進行的嘗試所存在的更多問題包括:產生的四聚體血紅蛋白中包含無法接受的高百分比的二聚體單位;二聚體的存在使得血紅蛋白組合物不能令人滿意地施用于哺乳動物。血紅蛋白的二聚體形式可以導致哺乳動物身體的嚴重腎損傷;此腎損傷可以嚴重到足以導致死亡。因此,本領域中存在著對在終產物中形成具有檢測不到的二聚體形式的穩定的四聚體血紅蛋白的需求。

現有技術血紅蛋白產品存在的另一問題是給藥后血壓的急劇增加。在過去,從上一代基于血紅蛋白的氧載體已經記錄到血管收縮事件。例如,產品(BiopureCo.,USA)導致與基線(96±10mmHg)相比較高的平均動脈壓(124±9mmHg)或高30%,如由Katz等人,2010公開。現有技術解決此問題的嘗試依賴于巰基試劑與血紅蛋白巰基反應,據稱以防止內皮細胞舒血管因子與該巰基的結合。然而,巰基處理的使用增加了加工步驟,導致增加的成本和雜質,所述雜質以后必須從血紅蛋白組合物中去除。因此,在本領域中存在著對制備當應用于哺乳動物時不引起血管收縮和高血壓的血紅蛋白的方法的需求。

現有技術為形成穩定的血紅蛋白進行的嘗試所存在的更多問題包括:存在蛋白雜質諸如免疫球蛋白G,其可以引起哺乳動物中的變態反應效應。因此,本領域中存在著對可以產生穩定的不含蛋白雜質的四聚體血紅蛋白的方法的需求。

除了上述問題以外,在本領域中還存在著對穩定化的四聚體血紅蛋白的需求,所述四聚體血紅蛋白不含二聚體,不含磷脂并且能夠以工業規模生產。

發明內容

本發明提供了一種加工非聚合的、熱穩定的、純化的、交聯的四聚體血紅蛋白的方法,所述四聚體血紅蛋白適合用于哺乳動物,而不會引起嚴重腎損傷、血管有害作用和嚴重不良事件包括死亡。本發明去除了二聚體形式的血紅蛋白、未交聯的四聚體血紅蛋白、磷脂和蛋白雜質。另外地,本發明使用(1)用于精確的和受控的低滲裂解的即時細胞裂解設備,(2)流通柱色譜(flowthroughcolumnchromatography),(3)高溫短時(HTST)設備,其用于在純化過程中熱加工血紅蛋白溶液,以去除不合乎需要的未穩定化的血紅蛋白二聚體,并且去除蛋白雜質,例如免疫球蛋白-G,使得可以避免腎損傷、血管有害作用和其他毒性反應,和(4)氣密輸液袋包裝以避免氧侵入至產品中。

該方法包括哺乳動物全血的起始材料,所述全血至少包括紅細胞和血漿。將哺乳動物全血中的紅細胞與血漿分離,緊接著進行過濾從而獲得濾過的紅細胞級分。洗滌濾過的紅細胞級分從而去除血漿蛋白雜質。在即時細胞裂解設備中以50-1000升/小時的流速通過受控的低滲裂解來破壞所述洗滌過的紅細胞,持續足以裂解紅細胞卻不裂解白細胞的時間。進行過濾從而從溶胞產物中去除至少一部分廢滲余物。從所述溶胞產物中提取第一血紅蛋白溶液。

使用超濾濾器進行第一超濾過程,所述超濾濾器被配置成從第一血紅蛋白溶液中去除分子量比四聚體血紅蛋白高的雜質并且進一步去除任何病毒和殘留的廢滲余物,從而獲得第二血紅蛋白溶液。對所述第二血紅蛋白溶液進行流通柱色譜以去除蛋白雜質、二聚體血紅蛋白和磷脂以形成無磷脂的血紅蛋白溶液。使用配置成去除雜質的濾器對所述無磷脂的血紅蛋白溶液進行第二超濾過程,產生濃縮的純化的無磷脂的血紅蛋白溶液。

通過富馬酸二-3,5-二溴水楊酸酯交聯純化的血紅蛋白的至少α-α亞基,從而形成熱穩定的交聯血紅蛋白而不形成聚合血紅蛋白,使得得到的非聚合交聯四聚體血紅蛋白的分子量為60-70kDa。表述“非聚合”當在本文中使用時是指不與其他血紅蛋白分子或任何其他非血紅蛋白分子諸如PEG分子間交聯的四聚體血紅蛋白。用合適的生理緩沖液諸如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、乳酸鹽林格氏溶液、乙酸鹽林格氏溶液或Tris緩沖液交換所述交聯四聚體血紅蛋白。使用切向流過濾去除任何殘留的化學物質。

在此步驟后,交聯血紅蛋白被熱處理以去除任何殘留的未交聯的四聚體血紅蛋白和任何未穩定化的血紅蛋白(例如,二聚體形式的血紅蛋白)和任何其他蛋白雜質。在熱處理之前,任選地向所述交聯四聚體血紅蛋白加入約0.2%的濃度的N-乙酰半胱氨酸以防止高鐵血紅蛋白的形成。在熱處理和冷卻后立即加入約0.2%-0.4%的濃度的N-乙酰半胱氨酸以進一步防止高鐵血紅蛋白的形成。熱處理優選是在約70℃-95℃下進行30秒至3小時的高溫短時處理,隨后冷卻至25℃。之后在熱處理期間形成的任何沉淀物均通過離心或過濾設備去除以形成清亮的溶液。

不含二聚體、不含磷脂、不含蛋白雜質的、熱穩定的、非聚合的交聯四聚體血紅蛋白然后加入至藥學上可接受的載體。

之后,將熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白在定制的和氣密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EVOH)輸液袋中配制和包裝。該包裝防止氧污染,氧污染導致形成無活性的高鐵血紅蛋白。

通過上述方法制備的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白用于治療多種癌癥諸如白血病、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。破壞癌細胞的機制是改善低氧條件下腫瘤的氧合,從而提高對放射線和化療劑的敏感性。該熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白也用于在移植期間保護器官組織或用于在體內缺少供氧的情況下(諸如在缺氧心臟中)保護心臟。

此外,通過上述方法制備的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白用于減少癌性腫瘤復發和使腫瘤細胞轉移最小化。在用于腫瘤切除手術的缺血前和在去除腫瘤后重建血供(再灌注)期間施用所述血紅蛋白。所述血紅蛋白還可以用于增加癌組織的氧合和減小腫瘤的大小。

附圖簡述

圖1是描繪本發明的方法的概況的流程圖。

圖2示意性描繪了本發明的方法中使用的即時細胞裂解設備。

圖3描繪了對于(a)未熱處理的交聯四聚體血紅蛋白、和(b)熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白(其已經在90℃經歷45秒至2分鐘或在80℃經歷30分鐘的熱處理)的高效液相色譜分析。

圖4描繪了對熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的電噴霧電離質譜(ES1-MS)分析。

圖5顯示了對(a)純化的血紅蛋白溶液和(b)熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的圓二色性光譜分析。

圖6顯示了正常組織中氧合的改善。注射0.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液導致(A)血漿血紅蛋白濃度和(B)至肌肉的氧輸送的顯著增加。與血漿血紅蛋白水平相比觀察到持續較長時間段的氧合顯著增加。

圖7顯示了低氧的腫瘤組織中氧合的改善。注射0.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液導致至頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)異種移植物的氧輸送顯著增加。

圖8顯示了(A)鼻咽癌(NPC)和(B)肝腫瘤的嚙齒動物模型中的部分腫瘤縮小。

圖9示出了在用熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療后,嚴重出血性休克的大鼠模型中的平均動脈壓變化。

圖10是流通柱色譜的洗脫圖;血紅蛋白溶液處于流過級分中。

圖11示意性描繪了用于工業規模操作的具有超濾作用的流通CM柱色譜系統。

圖12是用于HTST熱處理加工步驟的設備的示意性圖示。

圖13示出了HTST加工設備中的溫度曲線和在本發明的系統中在85℃和90℃去除未被穩定化的四聚體(二聚體)所需的時間。

圖14示出了在圖12的HTST加工設備中在85℃和90℃在系統中高鐵血紅蛋白形成的速率。

圖15是用于本發明的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的輸液袋的示意性圖示。

圖16顯示了總結在肝切除術期間的手術和血紅蛋白產品給藥操作的示意圖。

圖17顯示了在肝切除術和缺血/再灌注操作后IR損傷組大鼠中誘發的肝內肝癌復發和轉移以及遠處肺轉移以及使用本發明的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的保護作用的代表性實例。

圖18顯示了在肝切除和IR損傷操作后4周時實驗組和對照組中的組織學檢查。

圖19A顯示了在肝切除術和IR操作后的IR損傷組(對照組)大鼠以及已經用本發明的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療的大鼠(Hb治療組)中發現的復發肝腫瘤的體積(cm3)。

圖19B顯示了在肝切除術和IR操作后的IR損傷大鼠(對照組)以及已經用本發明的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療的大鼠(Hb組)的肝復發率(左)和平均復發腫瘤大小(右)。

圖20顯示了在肝切除術和缺血/再灌注操作后IR損傷組大鼠(對照組:C10和C13)和使用本發明的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療的大鼠(Hb治療組:Y9、Y10和Y11)中誘發的肝內肝癌復發和轉移以及遠處肺轉移的代表性實例。

圖21顯示了在整個肝臟手術和再灌注中從第一次施用本發明的血紅蛋白產品或RA緩沖液(對照)起的肝氧分壓(mmHg)的代表性實例。

圖22顯示了在肝臟手術后用或不用本發明的血紅蛋白產品治療28天的情況下大鼠外周血中循環內皮祖細胞水平(EPC)的比較。

具體實施方式

血紅蛋白是哺乳動物和其他動物的血液的紅細胞中含鐵的氧運輸蛋白。血紅蛋白顯示蛋白的三級和四級結構兩者的特性。血紅蛋白中的大多數氨基酸形成由短的非螺旋段連接的α螺旋。氫鍵穩定血紅蛋白內部的螺旋段,產生其分子內的吸引力,將每條多肽鏈折疊成特定的形狀。血紅蛋白分子由四個球狀蛋白亞基組裝而成。每個亞基由排列成一組α-螺旋結構段的多肽鏈構成,所述α-螺旋結構段以“肌紅蛋白折疊”排列方式與包埋的血紅素基團連接。

血紅素基團由固定在稱為卟啉的雜環中的鐵原子組成。鐵原子與位于一個平面中的環中心中的所有4個氮原子同等地結合。然后氧能夠結合于與卟啉環的平面垂直的鐵中心。因此,單個血紅蛋白分子具有與四個氧分子結合的能力。

在成人中,最常見類型的血紅蛋白是稱為血紅蛋白A的四聚體,其由稱為α2β2的兩個α和兩個β非共價結合的亞基組成,每個亞基分別由141和146個氨基酸殘基構成。α和β亞基的尺寸和結構彼此非常類似。對于總分子量為約65kDa的四聚體,每個亞基的分子量為約16kDa。四條多肽鏈通過鹽橋、氫鍵和疏水相互作用彼此結合。牛血紅蛋白的結構與人血紅蛋白類似(α鏈中的同一性為90.14%;β鏈中的同一性為84.35%)。不同之處在于牛血紅蛋白中的兩個巰基位于βCys93處,而人血紅蛋白中的巰基分別位于αCys104、βCys93和βCys112處。

在紅細胞內部的天然存在的血紅蛋白中,α鏈與其相應的β鏈的締合非常強并且在生理條件下不會離解。然而,在紅細胞外,一個αβ二聚體與另一個αβ二聚體的締合相當弱。該結合具有分裂成兩個αβ二聚體的傾向,每個二聚體為約32kDa。這些不需要的二聚體足夠小從而被腎臟過濾和排泄,結果造成潛在的腎損傷和并導致顯著減少的血管內滯留時間。

因此,從功效和安全性兩方面來看,穩定在紅細胞外使用的任何血紅蛋白是必要的。下面概述了制備穩定的血紅蛋白的方法;本發明的方法的概況呈現在圖1的流程圖中。

首先,選擇全血來源作為來自紅細胞的血紅蛋白的來源。選擇哺乳動物全血,包括,但不限于,人、牛、豬、馬和犬全血。將紅細胞與血漿分離、過濾、和洗滌以去除血漿蛋白雜質。

為了從紅細胞釋放血紅蛋白,需裂解細胞膜。盡管多種技術可以用來裂解紅細胞,但本發明利用可以以適合于工業規模生產的體積以精確受控的方式在低滲條件下的裂解。為此,圖2中所示的即時細胞裂解設備用來裂解紅細胞。低滲裂解形成溶胞產物溶液,其包含血紅蛋白和廢滲余物。為了能夠進行工業規模生產,小心地控制裂解作用使得僅紅細胞被裂解卻不裂解白細胞或其他細胞。在一個實施方案中,選擇即時細胞裂解設備的尺寸使得紅細胞在2-30秒內或另外地在足以裂解紅細胞的時間內(優選30秒內)穿越該設備。所述即時細胞裂解設備包括靜態混合器。去離子的和蒸餾的水用作低滲溶液。當然要理解使用具有不同的鹽濃度的其他低滲溶液將導致紅細胞裂解的時間段不同。由于受控的裂解步驟僅裂解紅細胞,不裂解白細胞或細胞性物質,因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA從白細胞和其他細胞性物質的釋放最小化。在30秒后,即在含有紅細胞的溶液已經穿越即時細胞裂解設備的靜態混合器部分后,立即加入高滲溶液。得到的血紅蛋白與使用其他裂解技術得到的血紅蛋白相比具有較高的純度和較低水平的污染物諸如不合乎需要的DNA和磷脂。分別通過聚合酶鏈式反應(檢出限=64pg)和高效液相色譜(HPLC,檢出限=1μg/mL)方法沒有在該血紅蛋白溶液中檢測到來自白細胞的不合乎需要的核酸和磷脂雜質。

進行兩個超濾過程:一個過程在流通柱色譜前去除分子量比血紅蛋白大的雜質,另一個過程在流通柱色譜后去除分子量比血紅蛋白小的雜質。后一超濾過程濃縮血紅蛋白。在一些實施方案中,100kDa濾器用于第一超濾過程,而30kDa濾器用于第二超濾過程。

流通柱色譜用來去除純化血紅蛋白溶液中的蛋白雜質諸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些實施方案中,通過使用一種市售離子交換柱或其組合來進行柱色譜,所述離子交換柱諸如DEAE柱、CM柱、羥基磷灰石柱等。用于柱色譜的典型pH為6-8.5。在一個實施方案中,使用流通CM柱色譜步驟在pH8.0去除蛋白雜質。進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)以檢測從柱色譜洗脫后的樣品中殘留的蛋白雜質和磷脂。此獨特的流通柱色譜分離能夠實現連續的分離方案以進行工業規模生產。ELISA結果顯示在洗脫的血紅蛋白中這些雜質的量非常低(免疫球蛋白-G:44.3ng/mL;白蛋白:20.37ng/mL;碳酸酐酶:81.2μg/mL)。使用不同類型的柱采用不同的pH值去除蛋白雜質的結果顯示在下面的表1中。

表1

在柱色譜過程后,血紅蛋白通過富馬酸二-3,5-二溴水楊酸酯(DBSF)進行交聯。為了防止聚合血紅蛋白的形成,在脫氧環境(優選小于0.1ppm溶解氧水平)中小心地控制反應,血紅蛋白與DBSF的摩爾比為1∶2.5-1∶4.0,反應在環境溫度(15-25℃)下,優選在約8-9的pH下持續3-16小時的時間段,使得得到的交聯血紅蛋白是分子量為60-70kDa的四聚體血紅蛋白,證明不存在聚合血紅蛋白。DBSF反應的收率高,>99%且終產物中的二聚體濃度低。任選地,本發明的方法不需要如在各種現有技術方法中使用的巰基處理試劑諸如碘乙酰胺來在交聯之前與血紅蛋白反應。

此時,用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)——一種生理緩沖液——交換交聯溶液,并且通過切向流過濾去除任何殘留的化學物質。

在脫氧條件下通過DBSF交聯血紅蛋白的過程后,本發明提供了在脫氧環境中對交聯四聚體血紅蛋白溶液的加熱加工步驟。在熱處理之前,任選地加入N-乙酰半胱氨酸以防止高鐵血紅蛋白(無活性血紅蛋白)的形成。在該加熱加工步驟后,將溶液冷卻并立即加入N-乙酰半胱氨酸以保持低水平的高鐵血紅蛋白。如果在熱處理之前和之后均加入N-乙酰半胱氨酸,則熱處理前加入的量為約0.2%,而在熱處理后加入的量為約0.2-0.4%。然而,如果僅在熱處理后加入N-乙酰半胱氨酸,則加入的量為0.4%。

在—些實施方案中,將交聯四聚體血紅蛋白溶液在脫氧環境(小于0.1ppm溶解氧水平)中在50℃至95℃的溫度范圍內加熱0.5分鐘至10小時的持續時間。在一些實施方案中,將交聯四聚體血紅蛋白溶液在70℃至95℃的溫度范圍內加熱30秒至3小時的持續時間。在一些優選的實施方案中,將交聯四聚體血紅蛋白溶液在80℃加熱30分鐘。并且還在其他優選的實施方案中,將交聯血紅蛋白溶液加熱至90℃持續30秒至3分鐘,然后快速地在約15-30秒內冷卻至約25℃,并且如上所述加入N-乙酰半胱氨酸。產生非常低的量的高鐵血紅蛋白,例如,小于3%。不使用N-乙酰半胱氨酸,形成的高鐵血紅蛋白的量為約16%,對于制藥應用來說是不可接受的高百分比。

之后使用高效液相色譜(HPLC)、電噴霧電離質譜(ESI-MS)、圓二色性(CD)光譜儀和用于p50測量的血氧分析儀(HemoxAnalyzer)來分析和表征熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白。對于源自牛血來源的血紅蛋白,圖3顯示二聚體形式的血紅蛋白在用于血紅蛋白(其已經在90℃經歷45秒至2分鐘或在80℃經歷30分鐘的熱處理)的HPLC系統(檢出限:2.6μg/ml或0.043%)中是檢測不到的。交聯的非聚合四聚體血紅蛋白發現在80℃或90℃在一段時間內是熱穩定的。加熱加工(高溫短時,HTST)步驟是使天然的未反應的四聚體形式和二聚體形式的血紅蛋白變性的有力步驟。

為了分析此HTST步驟的結果,使用HPLC分析法來檢測此加熱加工步驟后二聚體的量。用于HPLC分析的流動相含有氯化鎂(0.75M),其可以分離二聚體(未被穩定的四聚體)和熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白。對于促進血紅蛋白解離成二聚體,在相同的離子強度下氯化鎂的效力是氯化鈉的約30倍。該加熱加工步驟還充當變性步驟以大幅度地去除交聯的四聚體血紅蛋白中那些不需要的蛋白雜質(檢測不到免疫球蛋白-G;檢測不到白蛋白;碳酸酐酶減少99.99%)。進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)以檢測樣品中的蛋白雜質。因此,純化的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液具有檢測不到的水平的二聚體(低于檢出限:0.043%)和免疫球蛋白-G,以及非常低的量的白蛋白(0.02μg/ml)和碳酸酐酶(0.014μg/ml)。表2顯示了關于通過HTST加熱加工步驟去除蛋白雜質和二聚體的實驗結果。此HTST加熱步驟能夠選擇性地將熱穩定的交聯四聚體與不穩定的四聚體和二聚體分離。

表2

在脫氧條件下對交聯血紅蛋白的加熱加工步驟后,熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白就可以進行藥物配制和包裝。本發明描述了在脫氧環境中熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液的氣密包裝步驟。在本發明中熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白在脫氧條件下穩定達多于兩年的時間。

在本發明中,含氧載體的藥物組合物主要意欲用于靜脈內注射應用。傳統上,現有技術產品使用常規的PVC血袋或Stericon血袋,其具有高氧通透性,將最終縮短產品的壽命,因為產品在氧合條件下會快速地(在幾天內)轉變成無活性的高鐵血紅蛋白。

本發明中使用的包裝使熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白穩定超過兩年。EVA/EVOH材料的多層包裝用來使氣體通透性最小化并且避免形成無活性的高鐵血紅蛋白。被設計來與本發明的純化的和熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白一起使用的100mL輸液袋由厚度為0.4mm的5層EVA/EVOH層壓材料制成,其氧通透性為在室溫下每個大氣壓每24小時每100平方英寸0.006-0.132cm3。此材料是VI類塑料(由USP<88>定義),其滿足體內生物學反應性測試和物理化學測試并且適合于制造靜脈注射用輸液袋。此初級袋可特別地用于保護熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液免于長期暴露氧,長期暴露氧導致其不穩定并且最終影響其治療性能。

對于血液產品的二次保護,已經知道使用鋁外包裝以防止潛在的漏氣并且將產品保持在脫氧狀態。然而,在鋁外包裝中有存在針孔的可能性,使其氣密性受損并且使產品變得不穩定。因此,本發明使用鋁外包裝袋作為二次包裝,其防止氧合并且還防止暴露于光。外包裝袋的組成包括0.012mm聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、0.007mm鋁(Al)、0.015mm尼龍(NY)和0.1mm聚乙烯(PE)。外包裝薄膜的厚度為0.14mm且其氧傳遞速率為在室溫下0.006cm3/100平方英寸/24小時/大氣壓。此二次包裝延長了血紅蛋白的穩定時間,從而延長了產品保存期限。

本發明的血紅蛋白通過多種技術被分析,包括ESI-MS。ESI-MS允許分析非常大的分子。其是一種電離技術,該技術通過電離蛋白質,然后基于質量/電荷比分離電離的蛋白質來分析高分子量化合物。因此,可以準確地確定分子量和蛋白相互作用。在圖4中,ES1-MS分析結果表明熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的尺寸為65kDa(非聚合血紅蛋白四聚體)。190-240nm的遠紫外CD譜揭示了血紅蛋白的珠蛋白部分的二級結構。在圖5中,純化的血紅蛋白溶液和熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的光譜一致性揭示血紅蛋白鏈即使在90℃熱處理后也被正確地折疊。CD結果顯示熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白具有大約42%的α-螺旋、38%的β-折疊、2.5%的β-轉角和16%的無規卷曲。其進一步確定交聯的四聚體血紅蛋白是熱穩定的。

本發明的方法適用于熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的大規模工業生產。另外,熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白與藥用載體(例如,水、生理緩沖液、以膠囊形式)的組合適合于哺乳動物應用。

本發明還公開了含氧載體的藥物組合物在改善組織氧合中、在癌癥治療中、在治療缺氧病癥諸如出血性休克中和在低氧含量環境下的心臟保存(例如,心臟移植物)中的用途。選擇劑量使其具有約0.2-1.3g/kg的濃度范圍,輸液速度小于10ml/小時/kg體重。

對于在癌癥治療中的用途,本發明的含氧載體的藥物組合物作為組織氧合劑起作用,以改善腫瘤組織中的氧合,從而提高化學敏感性和放射敏感性。

另外,在本發明中證明了熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白改善正常組織中(圖6)和極度低氧的腫瘤(圖7)(人鼻咽癌(使用CNE2細胞系))中的氧合的能力。沿人CNE2異種移植物的組織軌跡的代表性氧特征曲線顯示在圖7中。腫瘤塊內的氧分壓(pO2)通過與微定位系統(DTILimited)耦聯的光纖氧傳感器(OxfordOptronixLimited)直接監測。靜脈內注射0.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白后,中位數pO2值在15分鐘內從基線升高至相對平均氧分壓的約2倍并且延續到6小時。此外,在輸注后24至48小時平均氧水平仍然保持比基線值高出25%-30%的水平。當與在本發明中制備的含氧載體的藥物組合物相比,沒有一個市售產品或現有技術顯示如此高的功效。

對于腫瘤組織氧合,人頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)異種移植物(FaDu)的代表性氧特征曲線顯示在圖7中。靜脈內注射0.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白后,分別在3小時和6小時觀察到多于6.5-倍和5-倍的平均pO2的顯著增加(圖7)。

對于在癌癥治療中的應用,本發明的含氧載體的藥物組合物充當組織氧合劑,以改善腫瘤組織中的氧合,從而提高化學敏感性和放射敏感性。結合X-線照射和熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白,腫瘤生長被延緩。在圖8A中,代表性曲線顯示了鼻咽癌的嚙齒動物模型中的顯著的腫瘤縮小。攜帶CNE2異種移植物的裸鼠用單獨X-線(2Gy)或與熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白聯合(2Gy+Hb)治療。在X-線照射前約3-6小時將1.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白經靜脈內注射至小鼠,并且導致鼻咽癌異種移植物的部分縮小。

在一個實施方案中,聯合化療劑,在注射所述組合物后觀察到顯著的肝腫瘤縮小。在圖8B中,代表性的圖表顯示在大鼠原位肝癌模型中顯著的腫瘤縮小。攜帶肝腫瘤原位移植物(CRL1601細胞系)的水牛鼠(buffalorat)用單獨3mg/kg順鉑治療,或聯合0.4g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療(順鉑+Hb)。在順鉑注射前施用熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白導致肝腫瘤的部分縮小。

對于在治療缺氧病癥和在心臟保存中的用途,本發明的含氧載體的藥物組合物作為將氧提供至靶器官的血液代用品起作用。

在用0.5g/kg的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療后嚴重出血性休克的大鼠模型中的平均動脈壓變化顯示在圖9中。在嚴重出血性休克的大鼠模型中,在用熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療后,平均動脈壓恢復至安全和穩定的水平,并且保持在基線處或基線附近。在用熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療后,平均動脈壓恢復至正常所需的時間甚至比施用充當陽性對照的自體大鼠血還短。所述結果表明在輸注熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白后沒有發生血管收縮事件。

實施例

以描述本發明的具體實施方案的方式提供以下的實施例,但不意在以任何方式限制本發明的范圍。

實施例1

過程概況

本發明的方法的示意性流程圖顯示在圖1中。將牛全血采集在封閉的無菌容器/袋中,該容器/袋裝有作為抗凝劑的3.8%(w/v)枸櫞酸三鈉溶液。然后將血液與枸櫞酸三鈉溶液立即充分混合以抑制血液凝結。通過單采機制(apheresismechamism)將紅細胞(RBC)與血漿和其他較小的血細胞分離并收集紅細胞。對于此步驟,“細胞洗滌機”與γ滅菌的一次性離心機轉筒(centrifugebowl)一起使用。用等體積的0.9%(重量/體積氯化鈉)鹽水洗滌RBC。

通過對紅細胞的細胞膜進行低滲休克,來裂解洗滌過的紅細胞以釋放血紅蛋白內容物。圖2中繪制的用于RBC裂解裝置的專用即時細胞裂解設備用于此目的。在RBC裂解后,使用100kDa膜通過切向流超濾將血紅蛋白分子與其他蛋白分離。收集濾液中的血紅蛋白用于流通柱色譜,并且通過30kDa膜進一步濃縮至12-14g/dL。進行柱色譜法以去除蛋白雜質。

濃縮的血紅蛋白溶液首先與DBSF在脫氧條件下反應以形成熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白分子。然后在最終的配制和包裝前在脫氧條件下在90℃進行熱處理步驟30秒-3分鐘。

實施例2

時間和受控的低滲裂解和過濾

采集新鮮牛全血并在冷卻條件(2-10℃)下運輸。經細胞洗滌機將紅細胞與血漿分離,隨后對紅細胞進行0.65μm過濾。在用0.9%鹽水洗滌紅細胞(RBC)濾液后,通過低滲裂解破裂濾液。通過使用圖2中繪制的即時細胞裂解設備來進行低滲裂解。該即時細胞裂解設備包括靜態混合器以輔助細胞裂解。含有受控的血紅蛋白濃度(12-14g/dL)的RBC懸浮液與4體積的純凈水混合從而產生對RBC細胞膜的低滲休克。控制低滲休克的時期以避免不希望的對白細胞和血小板的裂解。低滲溶液經過該即時細胞裂解設備的靜態混合器部分,持續2-30秒,或另外地足以裂解紅細胞的時間,優選地30秒。在30秒后當溶胞產物離開靜態混合器時通過將溶胞產物與1/10體積的高滲緩沖液混合而終止休克。使用的高滲溶液為0.1M磷酸鹽緩沖液,7.4%NaCl,pH7.4。圖2的即時細胞裂解設備可以連續地處理50-1000升溶胞產物/小時,優選地至少300升/小時。

在RBC裂解后,紅細胞的溶胞產物通過0.22μm濾器過濾以獲得血紅蛋白溶液。分別通過聚合酶鏈式反應法(檢出限=64pg)和HPLC(檢出限=1μg/mL)方法在該血紅蛋白溶液中都沒有檢測到來自白細胞的核酸和磷脂雜質。進行第一100kDa超濾以去除分子量大于血紅蛋白的雜質。緊接著進行流通柱色譜以進一步純化該血紅蛋白溶液。然后進行第二30kDa超濾以去除分子量比血紅蛋白小的雜質,并用于濃縮。

實施例3

對無基質的(stroma-free)血紅蛋白溶液的病毒清除研究

為了證明本發明所述的產品的安全性,我們通過病毒驗證研究證明(1)0.65μm滲濾步驟和(2)100kDa超濾步驟的病毒清除能力。這通過在規模縮小形式的這兩個過程中故意地添加不同的模型病毒(腦心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus)、偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)、牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrhoeavirus)和牛細小病毒(bovineparvovims))來進行。在此研究中使用四種類型的病毒(見表3)。這些病毒的生物物理特征和結構特征不同,并且顯示在對物理的和化學的試劑或治療的抗性方面有變化。

表3

驗證方案簡要地顯示在下表4中。

表4

下面的表5中顯示了對在(1)0.65μm滲濾和(2)100kDa超濾中4種病毒的對數(log)減少的結果的總結。通過0.65μm滲濾和100kDa超濾有效地去除所有4種病毒,BVDV、BPV、EMCV和PRV。

表5

注釋:

≥沒有測定到殘留的感染性

實施例4

流通柱色譜

CM柱(商購自GEhealthcare)用來進一步去除任何蛋白雜質。起始緩沖液為20mM乙酸鈉(PH8.0),且洗脫緩沖液為20mM乙酸鈉、2MNaCl(pH8.0)。用起始緩沖液平衡CM柱后,將蛋白樣品加樣至柱中。用至少5個柱體積的起始緩沖液洗滌未結合的蛋白雜質。使用8個柱體積的25%洗脫緩沖液(0-0.5MNaCl)進行洗脫。洗脫特征曲線顯示在圖10中;血紅蛋白溶液處于流過級分中。流過級分的純度通過ELISA分析。結果顯示在下面的表6中。

表6

由于血紅蛋白溶液在來自CM柱色譜的pH8的流過級分中(不在洗脫物中),因此這是一種用于連續的工業規模操作的良好方式。第一超濾裝置直接連接至流通CM柱色譜系統,并且流通管可以連接至用于工業規模操作的第二超濾裝置。示意性的工業工藝配置顯示在圖11中。

實施例5

熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的制備

(5a)與DBSF的交聯反應

在脫氧條件下進行交聯反應。將DBSF加入至血紅蛋白溶液中以形成交聯的四聚體血紅蛋白而不形成聚合血紅蛋白。DBSF穩定步驟穩定四聚體形式的血紅蛋白(65kDa)并且防止解離成二聚體(32kDa),所述二聚體通過腎臟排泄。在此實施方案中,使用1∶2.5的血紅蛋白與DBSF的摩爾比,并且pH為8.6。此過程在環境溫度(15-25℃)下在氮氣惰性氣氛中進行3-16小時的時段以防止血紅蛋白被氧化形成高鐵血紅蛋白(其是生理上無活性的)(溶解氧水平維持在小于0.1ppm)。通過使用HPLC測量殘留的DBSF來檢測DBSF反應的完成情況。DBSF反應的收率很高,>99%。

(5b)HTST加熱加工步驟

高溫短時(HTST)加工設備顯示在圖12中。對交聯的四聚體血紅蛋白進行使用HTST加工設備的加熱加工。在此實施例中,熱處理的條件為90℃持續30秒至3分鐘,并且優選地45-60秒,盡管如上所述可以選擇其他的條件,并且相應地改動設備。含有交聯的血紅蛋白且任選地向其加入0.2%N-乙酰半胱氨酸的溶液以1.0升/分鐘的流速被泵入至HTST加工設備(HTST熱交換器的第一段被預先加熱并維持在90℃)中,在該設備的第一部分的滯留時間為45-60秒,然后使該溶液以相同的流速通過進入到熱交換器的維持在25℃的另一部分。冷卻所需的時間為15-30秒。冷卻至25℃后,立即以0.2%-0.4%優選地以0.4%的濃度加入N-乙酰半胱氨酸。在HTST加熱加工后的此化學物質添加對于將高鐵血紅蛋白(無活性血紅蛋白)維持在低水平是非常重要的。容易控制加工設備的設置以進行工業操作。二聚體含量以及溫度特征曲線顯示在圖13中。如果血紅蛋白未交聯,則其是對熱不穩定的,并且在加熱步驟后形成沉淀物。然后通過離心或過濾設備將該沉淀物去除以之后形成清亮溶液。

在90℃的HTST加熱加工期間,高鐵血紅蛋白(無活性血紅蛋白)增加(顯示在圖14中)。立即添加N-乙酰半胱氨酸后,可以維持低水平的高鐵血紅蛋白,大約小于3%。

下面的表7顯示蛋白雜質諸如免疫球蛋白-G、白蛋白、碳酸酐酶和不合乎需要的未被穩定的四聚體或二聚體在熱處理步驟后被去除。使用ELISA法測量免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶的量,而通過HPLC法測定二聚體的量。在HTST加熱加工步驟后熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的純度極高,在98.0-99.9%的范圍。通過血氧分析儀測量的p50值——氧分壓(在此壓力下血紅蛋白溶液被半飽和(50%))——在整個HTST加熱加工步驟中保持在30-40mmHg左右,并且因此,熱處理的交聯的四聚體血紅蛋白在90℃是穩定的。

表7

實施例6

包裝

因為本發明的產品在脫氧條件下是穩定的,因此用于該產品的包裝使透氣性最小化是重要的。對于靜脈內應用,定制設計的100mL輸液袋由厚度為0.4mm的5層EVA/EVOH層壓材料制成,其氧通透性為在室溫下0.006-0.132cm3/100平方英寸/24小時/大氣壓。此特殊材料是VI類塑料(由USP<88>定義),其滿足體內生物學反應性測試和物理化學測試并且適合于制造靜脈內注射用容器(需注意也可以由此材料制成其他形式的包裝,取決于所需的應用)。二次包裝的鋁外包裝袋也應用于該初級包裝輸液袋,其提供額外的屏障,使光暴露和氧擴散最小化。該袋的各層包括:0.012mm聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、0.007mm鋁(Al)、0.015mm尼龍(NY)和0.1mm聚乙烯(PE)。外包裝薄膜的厚度為0.14mm且其氧傳遞速率為在室溫下0.006cm3/100平方英寸/24小時/大氣壓。輸液袋的示意圖繪制在圖15中。根據本發明的每個輸液袋的總氧通透性為在室溫下0.0025cm3/24小時/大氣壓。

實施例7

氧合的改善

(7a)正常組織中氧合的改善

對于熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白對正常組織氧合進行一些研究(圖6中所示)。在水牛鼠中進行比較藥物動力學和藥效學研究。經由雄性近交水牛鼠的陰莖靜脈通過推注向該大鼠分別施用0.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液或林格氏乙酸鹽緩沖液(對照組)。通過HemocueTM光度計在1、6、24、48小時測定血漿血紅蛋白的濃度-時間分布曲線并與基線讀數比較。該方法基于血紅蛋白的光度計測量,其中血紅蛋白的濃度以g/dL直接讀數。水牛鼠后腿肌肉的氧分壓(pO2)通過OxylabTM組織氧合和溫度監測儀(OxfordOptronixLimited)直接測量。大鼠通過腹膜內注射30-50mg/kg戊巴比妥溶液進行麻醉,緊接著將氧傳感器插入至肌肉中。所有pO2讀數通過Datatrax2數據采集系統(WorldPrecisionInstrument)以實時的方式記錄。結果證明在靜脈內注射0.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白后,平均pO2值在15分鐘內從基線升高至相對平均氧分壓的約2倍并且延續到6小時。此外,在注射后24至48小時平均氧水平仍然保持在比基線值高出25%-30%(圖6B)。

(7b)極度低氧的腫瘤區域中氧合的顯著改善

通過人頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)異種移植物模型評價極度低氧的腫瘤區域中氧合的改善。下咽鱗狀細胞癌(FaDu細胞系)獲自美國模式培養物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)。約1×106癌細胞經皮下注射至4至6周齡近交BALB/cAnN-nu(裸鼠)小鼠中。當腫瘤異種移植物達到8-10mm的直徑時,通過OxylabTM組織氧合和溫度監測儀(OxfordOptronixLimited)直接監測腫瘤塊內的氧分壓(pO2)。所有pO2讀數通過Datatrax2數據采集系統(WorldPrecisionInstrument)以實時的方式記錄。當pO2讀數穩定時,通過小鼠的尾靜脈靜脈內注射0.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液,并測量組織氧合。結果證明在靜脈內注射0.2g/kg所述熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白后,分別在3小時和6小時觀察到多于6.5-倍和5-倍的平均pO2的顯著增加(圖7)。

實施例8

癌癥治療研究:鼻咽癌的顯著腫瘤縮小

在聯合X-線照射施用熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液后觀察到顯著的腫瘤縮小(圖8A)。采用人鼻咽癌異種移植物模型。將約1x106癌細胞(CNE2細胞系)皮下注射至4-6周齡近交BALB/cAnN-nu(裸鼠)小鼠。當腫瘤異種移植物達到8-10mm的直徑,攜帶腫瘤的小鼠被隨機分為如下的三組:

第1組:林格氏乙酸鹽緩沖液(對照)

第2組:林格氏乙酸鹽緩沖液+X-線照射(2Gy)

第3組:熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白+X-線照射(2Gy+Hb)

攜帶CNE2異種移植物的裸鼠用單獨X-照射(第2組)輻照或聯合熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白(第3組)。對于X-線照射(第2組和第3組),小鼠通過腹膜內注射50mg/kg戊巴比妥溶液麻醉。通過直線加速器系統(VarianMedicalSystems)將2戈瑞(Gray)X-線遞送至攜帶腫瘤的小鼠的異種移植物。對于第3組,在X-線治療前將1.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白通過尾靜脈靜脈內注射至小鼠中。從治療第一天開始每隔一天記錄腫瘤尺寸和體重。腫瘤重量使用方程1/2LW2計算,其中L和W表示腫瘤塊的長度和寬度,在每次測量時通過數顯卡尺(MitutoyoCo,Tokyo,Japan)測量。第1組是未治療對照組。結果(顯示在圖8中)證明在用熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液聯合X-照射治療的小鼠中觀察到CNE2異種移植物的顯著縮小(第3組,圖8A)。

實施例9

癌癥治療研究:肝腫瘤的顯著縮小

另外,在聯合順鉑施用熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白溶液后觀察到顯著的腫瘤縮小(圖8B)。采用大鼠原位肝癌模型。將約2x106標記有螢光素酶基因(CRL1601-Luc)的大鼠肝腫瘤細胞注射至水牛鼠的肝左葉中。通過Xenogen體內成像系統監測腫瘤生長。注射后2-3周,獲取腫瘤組織,切成小塊并原位移植到第二組大鼠的肝左葉中。攜帶肝腫瘤的大鼠被隨機分為如下的三組:

第1組:林格氏乙酸鹽緩沖液(對照)

第2組:林格氏乙酸鹽緩沖液+順鉑(順鉑)

第3組:熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白+順鉑(順鉑+Hb)

移植了肝腫瘤組織的大鼠用單獨3mg/kg順鉑(第2組)或聯合熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白(第3組)治療。對于第2組和第3組,大鼠通過腹膜內注射30-50mg/kg戊巴比妥溶液麻醉,并經由左門靜脈施用順鉑。對于第3組,在順鉑治療前將0.4g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白通過大鼠的陰莖靜脈靜脈內注射。第1組是未治療對照組。重要的是,在治療后3周觀察到肝腫瘤的顯著縮小(圖8B)。

實施例10

大鼠急性嚴重出血性休克的治療

熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白還在大鼠的急性嚴重出血性休克模型中用作復蘇劑。將50只Sprague-Dawley大鼠根據復蘇劑隨機地分成3組,每組16-18只大鼠。

第1組:乳酸鹽林格氏溶液(陰性對照,16只大鼠)

第2組:動物自體血(陽性對照,16只大鼠)

第3組:熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療組(0.5gHb/kg體重,18只大鼠)

通過抽取50%的動物全血,估計為體重的7.4%,造成急性嚴重出血性休克。造成出血性休克10分鐘后,將乳酸鹽林格氏溶液、動物自體血、或0.5gHb/kg的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白輸注至動物體內。熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的輸液速率設置為5mL/h,之后,對所有試驗動物觀察24小時。在研究期間觀察和分析一組參數,包括存活率、血流動力學、心肌力學、心輸出量、心功能、血氣、組織氧輸送和氧耗量、組織灌注和氧張力(肝、腎和腦)、肝功能和腎功能、血液流變學(血液粘度)、和線粒體呼吸控制速率(肝、腎和腦)。其中,存活率是主要終點指標。觀察24小時后,熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療組與乳酸鹽林格氏溶液或陰性對照組和自體血組相比具有高得多的存活率(顯示在下表8中)。

表8

*Hb=熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白

實施例11:預防手術后肝腫瘤復發和轉移的方法

手術切除肝腫瘤是肝癌的一線治療。然而,癌癥的手術后復發和轉移仍然是這些患者中不利預后的主要特征。例如,以前的研究報道肝切除術與50%的5年存活率相關,但也與70%的復發率相關。對肝細胞癌(HCC)患者的隨訪研究也揭示在大約15%的HCC患者中檢測到來自原發HCC的肝外轉移,其中肺是肝外轉移的最常見部位。已經提示手術應激特別是在肝臟手術期間引起的缺血/再灌注(IR)損傷是腫瘤進展的主要原因。按照慣例,外科醫生通常使用肝血流控制來防止肝切除術期間的大出血。例如,已經使用通過阻斷肝門(肝門血流阻斷(Pringlemaneuver))的入肝血流阻斷來使失血最小化并且減少圍手術期輸血的需求。最近的日本研究顯示25%的外科醫生常規地采用肝門血流阻斷。然而,肝門血流阻斷會在殘留肝臟中誘發不同程度的缺血損傷并且與癌癥復發和轉移相關。

IR損傷和腫瘤進展的相關性也得到以前的動物研究的支持。首先,在采用原位肝癌模型的最近一項研究中證明了IR損傷和肝切除對肝癌復發和轉移的作用。肝臟IR損傷和肝切除術導致肝臟腫瘤的顯著復發和轉移。在結直腸肝轉移小鼠模型中獲得了類似的結果,其中IR損傷的引入加速了結直腸肝轉移的生長。

以前,已經研究了幾種保護性策略用于減少切除期間的IR損傷。例如,在延期阻斷前采用短時段的缺血,被稱為缺血預適應(IP),被提議用來觸發肝細胞防御機制并且已經被用來減少肝切除期間的IR損傷。其他人采用間歇阻斷(IC)操作,該操作允許多個周期的入肝血流阻斷,緊接著再灌注。兩者方法均被提議有效地保護經歷肝臟大手術的非肝硬化患者免受手術后肝損傷。然而,在腫瘤的情況下,動物研究還顯示IP不能保護肝臟免于IR損傷誘發的加速腫瘤生長。另外,一些小組嘗試使用抗氧化劑諸如α-生育酚和抗壞血酸來保護肝臟免于IR損傷,由此防止肝轉移。然而,兩種抗氧化劑均不能限制由IR刺激的肝內腫瘤生長。

從機制上,不同的證據提示由于以下的多種原因,低氧與腫瘤復發和轉移相關聯:(1)研究顯示低氧的腫瘤對放射療法和化學療法耐受性較大,在治療中存活的腫瘤細胞易于復發;臨床證據還提示具有較多的低氧腫瘤區域的患者具有較高的轉移率;(2)在低氧條件下,癌細胞通過低氧誘導因子-1(HIF-1)途徑的激活變得更有侵襲性。這又觸發了補充反應,該補充反應涉及促血管生成因子血管內皮細胞生長因子(VEGF)和受體諸如c-Met和CXCR4,其增強細胞運動性和至特異的遠處器官的歸巢;(3)近年來的研究還證明循環癌細胞(CTC)在低氧條件下變得更有侵襲性。在癌癥患者的外周血中檢測到的循環腫瘤細胞顯示是具有遠處轉移的患者中疾病侵襲的指標,而低氧使得這些細胞具有更具侵襲性的表型并且使凋亡潛能消失。特別地,在氧水平降低的情況下對放射線較為耐受的癌癥干細胞群在腦腫瘤中富集。

因此,鑒于上面的觀察結果和研究,本發明的非聚合的交聯四聚體血紅蛋白用于防止肝切除后的手術后肝腫瘤復發和轉移。建立了大鼠原位肝癌模型。肝細胞癌細胞系(McA-RH7777細胞)用來在水牛鼠(雄性,300-350g)中建立原位肝癌模型。圖16顯示了總結了手術和血紅蛋白產品施用操作的示意圖。將McA-RH7777細胞(3×105/100μl)注射至水牛鼠的肝包膜中以誘發實體腫瘤生長。2周后(此時腫瘤體積達到約10×10mm),收集腫瘤組織并將其切成1-2mm3方塊并植入至新的一組水牛鼠的肝左葉中。原位肝腫瘤植入后2周,使大鼠經歷肝切除(攜帶肝腫瘤的左葉)和部分肝IR損傷(在右葉上缺血30分鐘)。

兩組帶有植入的腫瘤組織的大鼠用于比較腫瘤復發和轉移。在第1組中,大鼠用戊巴比妥麻醉并在缺血前1小時靜脈內施用0.2g/kg本發明的非聚合的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白。通過用動脈夾夾閉肝臟門靜脈的右支和肝動脈在肝臟的右葉中引起缺血。隨后,在左肝葉進行結扎,緊接著切除攜帶肝腫瘤的左肝葉。在缺血后30分鐘時,通過下腔靜脈注射額外的0.2g/kg熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白,緊接著再灌注。在第2組中,以相同的操作注射作為載體對照的林格氏乙酸鹽緩沖液。在肝切除術操作后4周處死所有大鼠。

為了檢查腫瘤生長和轉移,在缺血/再灌注和肝切除術操作后4周時將水牛鼠的肝臟和肺取樣用于形態學檢查。獲取組織,對其進行石蠟包埋并切片,緊接著進行蘇木素和伊紅(H&E)染色。通過組織學檢查確認局部復發/轉移(肝內)和遠處轉移(肺)。表9總結了觀察結果。

表9:在大鼠原位肝癌模型中在肝切除和IR損傷后4周時腫瘤復發/轉移的比較。

為了檢查非聚合的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白對肝腫瘤復發和轉移的保護效應,在肝切除術和IR操作后4周處死所有大鼠。收獲肺和肝組織;在兩組中比較肝腫瘤復發/轉移和肺中的遠處轉移。結果顯示血紅蛋白治療減少兩個器官中的復發和轉移的發生率。

圖17顯示了在肝切除術和缺血/再灌注操作后IR損傷組大鼠中誘發的肝內肝癌復發和轉移以及遠處肺轉移以及使用本發明的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白的保護作用的代表性實例。在圖17A中,在IR損傷組中觀察到廣泛的肝內肝癌復發/轉移。在同一只大鼠中還發生了遠處肺轉移(由實心箭頭指示)。在圖17B中,在IR損傷組的另一例中觀察到肝內肝癌復發/轉移(由虛線箭頭指示)。在同一例中觀察到廣泛的肺轉移(由實心箭頭指示)。相反,圖17C顯示了在用本發明的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療的大鼠中保護免于發生肝內肝癌復發/轉移和遠處肺轉移的代表性實例。

圖18顯示了在肝切除和IR損傷操作后4周時在兩組中的組織學檢查。在IR損傷組和血紅蛋白治療組兩組中進行肝臟和肺組織的組織學檢查(H&E染色)以確認腫瘤結節的性質。顯示了示出血紅蛋白治療組(T3)和IR損傷組(T1和T2)中肝內復發/轉移的代表性視野。包括在治療組中顯示出正常的肝臟整體結構(N1)的組織學檢查用于比較。另外,在IR損傷組的同一只大鼠中發現肺中的遠處轉移(M)。在治療組中示出沒有轉移灶的肺組織(N2)用于比較。

為了進一步確認非聚合的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白對腫瘤復發和轉移的保護效應,研究了缺血/再灌注和肝切除術操作后腫瘤的復發率和復發腫瘤的大小。再次,如圖16中所述,通過如上所述注射McA-RH7777細胞制備的帶有植入的腫瘤組織的大鼠在缺血前和在肝切除操作后再灌注時用大約0.2-0.4g/kg本發明的非聚合的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白或作為陰性對照的林格氏乙酸鹽(RA)緩沖液經靜脈內治療。測試總共24只大鼠,其中11只大鼠用本發明的血紅蛋白治療且13只是陰性對照大鼠,陰性對照大鼠僅用RA緩沖液治療。在肝切除術和IR操作后4周處死所有大鼠,檢查測試大鼠的肝臟和肺的腫瘤復發/轉移并且測量復發腫瘤的相對尺寸。

圖19A顯示測試大鼠中的肝腫瘤復發和各復發腫瘤的體積。13只未治療的對照大鼠中有9只發生肝腫瘤復發/轉移,而11只經治療的大鼠中僅有4只經歷腫瘤復發/轉移。還明顯的是在觀察到腫瘤復發的情況下,用本發明的血紅蛋白治療的大鼠的復發腫瘤的尺寸顯著小于那些未治療的大鼠。這些結果顯示采用本發明的治療極大地減小了腫瘤復發率并且顯著地減小了復發腫瘤的尺寸,如圖19B中總結的那樣。

圖20圖示了在使用本發明的非聚合的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療的大鼠和IR損傷(陰性對照)組大鼠在肝切除術和IR操作后4周收獲的肝和肺組織的代表性實例。如在未治療的陰性對照組的代表性實例(大鼠C10和13)中所見,觀察到廣泛的肝內肝癌復發/轉移和遠處肺轉移灶(圓圈)。另一方面,通過本發明的血紅蛋白的治療防止了肝內肝癌復發/轉移和遠處肺轉移,如大鼠Y9、Y10和Y11中所見。

實施例12:用非聚合的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療減少缺血

如實施例7中所證明,本發明的非聚合的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白對低氧的腫瘤的靜脈內注射顯著地改善了其中的氧合。因此,研究了在腫瘤切除和IR操作期間本發明的血紅蛋白產品的氧合效應。使用如實施例11中所述通過注射McA-RH7777細胞制備的帶有植入的肝腫瘤組織的大鼠,并使其接受手術和0.2-0.4g/kg本發明的血紅蛋白產品或RA緩沖液施用操作,如圖16中所概述的那樣。從首次向肝腫瘤施用本發明的血紅蛋白產品/RA緩沖液的時間開始并在整個IR操作、肝腫瘤切除期間和再灌注后測量肝臟的氧分壓。結果(圖21)顯示在引入缺血后觀察到用本發明的血紅蛋白治療增加了氧合。另外,如圖21中所見,再灌注后,已經用本發明的血紅蛋白治療的肝臟的氧分壓是未治療的肝臟的大約3倍。證實與未治療相比,在缺血前和在腫瘤切除后再灌注時本發明的血紅蛋白的治療顯著地改善肝組織的氧合。鑒于本領域中提出的低氧的腫瘤和增加的腫瘤復發/轉移的可能性之間的強相關性,如在此實施例中所證明的本發明的血紅蛋白產品的巨大氧合效應以及其在腫瘤切除操作期間的使用,本發明的血紅蛋白產品減少腫瘤復發和轉移的有效性得到明顯地證實。

實施例13:用非聚合的熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療減少循環內皮祖細胞水平

不同的研究已經證明了癌癥干細胞(CSC)和/或祖細胞群在肝癌進展中的重要意義。重要的是,以前的研究顯示在HCC患者(包括經歷肝切除術的那些患者)中發現明顯較高水平的循環內皮祖細胞(EPC)。

因此,通過表面分子諸如CD133、CD34和VEGFR2的表達評價了循環EPC的水平。研究了采用或不采用本發明的血紅蛋白產品治療的肝切除手術和IR操作后的循環內皮祖細胞水平。兩組帶有植入的肝腫瘤的大鼠接受本發明的血紅蛋白或RA緩沖液(對照)的治療,如上面實施例11和圖16中所述,分別在缺血前和在肝切除后再灌注時。然后在肝切除和IR操作后0、3、7、14、21和28天時測量兩組大鼠的循環EPC的數目。結果(圖22)顯示盡管在手術后第0天至第3天期間治療的和未治療的組的EPC水平是相當的,但血紅蛋白治療組的EPC水平大大低于那些RA緩沖液治療的組。這些結果與實施例11的結果是一致的,在實施例11中驗證了本發明的血紅蛋白減少和最小化腫瘤復發/轉移的保護效應。

作為上面研究的結果,得出結論:用本發明的非聚合的、熱穩定的交聯四聚體血紅蛋白治療對肝腫瘤的復發和其他器官中的轉移均具有預防作用。

盡管已經就多個實施方案描述了前述發明,但這些實施方案并非限制性的。本領域普通技術人員將理解大量的變化形式和改型。這樣的變化形式和改型被認為包括在下列權利要求的范圍內。

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