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交叉保護性沙粒病毒疫苗及其使用方法.pdf

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交叉 保護性 沙粒 病毒 疫苗 及其 使用方法
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摘要
申請專利號:

CN201280034401.8

申請日:

20120711

公開號:

CN103687625A

公開日:

20140326

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,C12N15/00 主分類號: A61K48/00,C12N15/00
申請人: 艾諾奧醫藥品有限公司
發明人: 凱特·布羅德里克,尼蘭詹·薩爾德賽,凱瑟琳·卡什曼,康妮·施馬爾約翰
地址: 美國賓夕法尼亞州
優先權: 61/506,579,61/507,062
專利代理機構: 北京康信知識產權代理有限責任公司 代理人: 余剛;張英
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280034401.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及單獨或同時靶向多種沙粒病毒劑的DNA疫苗。

權利要求書

1.一種包含核苷酸編碼序列的DNA疫苗,所述核苷酸編碼序列編碼一種或多種能夠在有需要的受試者中產生針對沙粒病毒的保護性免疫應答的免疫原性蛋白,所述DNA疫苗包含:編碼沙粒病毒的糖蛋白前體的編碼序列,所述編碼序列針對所述受試者進行密碼子優化;或其與所述糖蛋白前體98%同源的免疫原性片段。2.如權利要求1所述的DNA疫苗,其中所述編碼序列基本上由以下組成:LASV(LASV-GPC)的糖蛋白前體結構域、LCMV(LCMV-GPC)的糖蛋白前體結構域、MACV(MACV-GPC)的糖蛋白前體結構域、JUNV(JUNV-GPC)的糖蛋白前體結構域、GTOV(GTOV-GPC)的糖蛋白前體結構域、WWAV(WWAV-GPC)的糖蛋白前體結構域或PICV(PICV-GPC)的糖蛋白前體結構域。3.如權利要求2所述的DNA疫苗,其中所述片段包括:包括殘基441至449的LASV-GPC的片段,包括殘基447至455的LMCV-GPC的片段,包括殘基444至452的MACV-GPC的片段,包括殘基429至437的JUNV-GPC的片段,包括殘基427至435的GTOV-GPC的片段,包括殘基428至436的WWAV-GPC的片段,或包括殘基455至463的PICV-GPC的片段。4.如權利要求1至3中任一項所述的DNA疫苗,其中所述DNA疫苗基本上由所述編碼序列之一組成。5.如權利要求1至3中任一項所述的DNA疫苗,其中所述DNA疫苗基本上由所述編碼序列的至少兩個組成。6.如權利要求1至5中任一項所述的DNA疫苗,其進一步包含選自由以下組成的組的佐劑:IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。7.如權利要求6所述的DNA疫苗,其中所述編碼序列為:SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2,或編碼SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:5的核苷酸序列。8.一種誘導針對沙粒病毒的保護性免疫應答的方法,其包括:向有需要的受試者施用如權利要求1至6中任一項所述的DNA疫苗,以及電穿孔所述受試者。9.如權利要求8所述的方法,其中所述電穿孔步驟包括:將具有能量的電穿孔脈沖遞送至發生施用步驟的所述受試者上的部位。10.如權利要求9所述的方法,其中所述施用步驟和電穿孔步驟都發生在所述受試者的真皮內層。

說明書

相關申請的交叉引用

本申請要求2011年7月11日提交的美國臨時申請號61/506,579和2011年7月12日提交的美國臨時申請號61/507,062的權益,所述美國臨時申請的內容以引用的方式整體并入本文。

聯邦資助的研究和開發

關于本發明的主題開發的活動至少部分地由美國政府軍隊合同號W81XWH-12-0154資助,并且因此美國可以在本發明中具有某些權利。

發明領域

本發明涉及有效于引出針對沙粒病毒的保護性免疫應答的基于DNA的疫苗,以及制造和使用所述疫苗的方法。

發明背景

沙粒病毒(AV)是嚙齒動物傳播的病毒,所述病毒引起急性和經常致命性的出血熱,并具有相關的不適、嚴重水腫、失血以及高死亡率。拉沙病毒(LASV)是西非地區特有的舊大陸沙粒病毒。已在美國、歐洲和加拿大報道過拉沙熱的輸入性病例。據估計,每年發生300,000例至500,000例之間的拉沙熱病例,在住院患者中有15%至20%的死亡率。新大陸沙粒病毒(呼寧(Junin)病毒(JUNV)、馬秋博(Machupo)病毒(MACV)、瓜納瑞托(Guanarito)病毒以及薩比亞(Sabia)病毒)是南美洲特有的,并且已知每年引起成千上萬例嚴重出血熱病例。沙粒病毒是CDC?A類生物威脅劑,并且在新興疾病爆發或被這些病毒生物恐怖襲擊的不利情況下,將不存在可供公眾使用的FDA批準的曝露前或曝露后治療劑或疫苗。已報道了鑒別可以在小鼠中引出免疫應答的HLA?I類限制性表位的研究。參見Botten,J.等,J.Vir.9947-9956(2010年10月)。

對于因爆發和高度的發病率和死亡率而最近受到所有關注的沙粒病毒,存在非常少的可供使用的治療。不存在獲得許可的疫苗用于AV預防,并且僅獲得許可用于治療人AV感染的藥物為抗病毒藥物病毒唑。如果在曝露早期服用,病毒唑幫助減小與AV感染相關的發病率和死亡率,但要遭受到高毒性和副作用。存在對于以下的明確未滿足的需要:開發低成本和/或對治療有療效的藥物和用于在世界AV特有區域進行預防以及用于經由生物防御威脅或通過在世界特有的各地部署美國軍事人員來防治曝露的有效疫苗。

此外,還存在對多藥劑沙粒病毒疫苗的未滿足的需要。如更早所指出,不存在可供使用的競爭性有效的預防法或療法。據我們所知,由FDA批準的用于在試驗性新藥(IND)身份下限制使用的呼林減毒活疫苗(候選#1)是用于沙粒病毒感染所測試的唯一疫苗。然而,隨后此疫苗還在動物研究中顯示出不能針對其它沙粒病毒株進行交叉保護。

因此,仍存在對提供有療效藥物的疫苗或用于沙粒病毒的有效疫苗以及單獨或同時靶向多種沙粒病毒劑的疫苗的需要。

附圖簡述

圖1(A)、圖1(B)、圖1(C)和圖1(D)展示出用非優化的(包含SEQ?ID?NO:3)與優化的構建體(包含SEQ?ID?NO:1)進行疫苗接種的豚鼠的血清病毒血癥評分和發病率評分。

圖1(B2)和圖1(D2)展示出分別添加非侵害性電穿孔(NTVEP)的血清病毒血癥評分和發病率評分的圖1(B)和圖1(D)的數據。

圖2(A)和圖2(B)展示出豚鼠中非優化(包含SEQ?ID?NO:3)和密碼子優化的(包含SEQ?ID?NO:1)LASV?DNA疫苗的存活曲線。

圖3(A)和圖3(B)展示出參與反激發(back?challenge)研究的豚鼠的重量和溫度。

圖4展示出用LASV致命激發存活的LASV-GPC或模擬疫苗接種的猴子的BAERCOM聽覺篩分。

圖5(A)、圖5(B)和圖5(C)展示出接受LASV-GPC(包含SEQ?ID?NO:2)或模擬(包含SEQ?ID?NO:3)DNA疫苗的食蟹猴(cynomolgus?macaque)的存活曲線、血清病毒血癥評分以及發病率評分。

圖6(A)、圖6(B)和圖6(C)展示出接受LASV-GPC(包含SEQ?ID?NO:2)或模擬(包含SEQ?ID?NO:3)DNA疫苗的食蟹猴的所選擇的血液化學值。

圖7展示出接受LASV-GPC(包含SEQ?ID?NO:2)或模擬(包含SEQ?ID?NO:3)DNA疫苗的食蟹猴的選擇的血液學值。

圖8展示出針對豚鼠優化的LASV-GPC密碼子(LASV-GPC?GP)、針對非人靈長類動物優化的LASV-GPC密碼子(LASV-GPC?NHP)與參比LASV?GPC(對照)之間的序列比對。

詳述

本發明的一方面提供包括核苷酸編碼序列的DNA疫苗,所述核苷酸編碼序列編碼一種或多種能夠在有需要的受試者中產生針對沙粒病毒的保護性免疫應答的免疫原性蛋白。編碼序列編碼沙粒病毒的糖蛋白前體,并且是針對感興趣的受試者進行密碼子優化的。另外,編碼序列可以是其與糖蛋白前體至少98%同源的免疫原性片段。

在一些實施方案中,編碼序列基本上由以下組成:LASV(LASV-GPC)的糖蛋白前體結構域、LCMV(LCMV-GPC)的糖蛋白前體結構域、MACV(MACV-GPC)的糖蛋白前體結構域、JUNV(JUNV-GPC)的糖蛋白前體結構域、GTOV(GTOV-GPC)的糖蛋白前體結構域、WWAV(WWAV-GPC)的糖蛋白前體結構域或PICV(PICV-GPC)的糖蛋白前體結構域。優選地,片段包括:包括殘基441至449的LASV-GPC的片段、包括殘基447至455的LMCV-GPC的片段、包括殘基444至452的MACV-GPC的片段、包括殘基429至437的JUNV-GPC的片段、包括殘基427至435的GTOV-GPC的片段、包括殘基428至436的WWAV-GPC的片段或包括殘基455至463的PICV-GPC的片段。

在一個優選的實施方案中,DNA疫苗基本上由所述編碼序列之一—單一藥劑或單價疫苗組成。在另一個優選的實施方案中,DNA疫苗基本上由所述編碼序列的至少兩個—復合藥劑或多價疫苗組成。優選地,單價或多價疫苗包括所公開的LASV-GPC,并且更優選地SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2,或編碼SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:5的核苷酸編碼序列。

在一些實施方案中,所提供的DNA疫苗進一步包含選自由以下組成的組的佐劑:IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

在本發明的一方面中,提供了誘導針對沙粒病毒的保護性免疫應答的方法,所述方法包括施用本文提供的DNA疫苗,以及電穿孔所述受試者。在一些實施方案中,電穿孔步驟包括將具有能量的電穿孔脈沖遞送至發生施用步驟的所述受試者上的部位。優選地,施用步驟和電穿孔步驟都發生在所述受試者的真皮內層中。

所公開的本發明涉及新型DNA候選疫苗,其在受試者中針對一種或在一些情況下針對多種沙粒病毒(LASV、LCMV、MACV、JUNV、GTOV、WWAV以及PICV)產生保護性免疫應答,所述沙粒病毒涵蓋舊大陸病原體和新大陸病原體。

所提供的疫苗包含AV?GPC結構域DNA免疫原以便增加免疫應答的多樣性和針對多種相關但相異的病毒的交叉保護。本文進一步描述了基因優化過的免疫原,特別是針對沙粒病毒優化的GPC結構域,其能夠靶向更廣譜的病原體。疫苗的一個實施方案是優化的LASV編碼序列,其可以額外地包括靶向LASV、LCMV、MACV、JUNV、GTOV、WWAV以及PICV病毒并且優選MACV和JUNV病毒的疫苗以便得到復合藥劑制劑。

可以用高度創新的制造方法和優化的疫苗制劑來組合疫苗以便增強復合藥劑制劑的效力。傳統上,僅能夠制造出濃度為2mg/mL至4mg/mL的DNA。此物理限制使得難以在足夠高以達到保護性療效的劑量水平下組合靶向多抗原的DNA質粒。通過利用如在美國專利號7,238,522和美國專利公布號2009-0004716中描述的專有制造方法,可以制造出濃度>10mg/mL且具有高純度的DNA質粒,所述專利整體并入本文。此高濃度制劑還有益于在小的注射體積(0.1mL)下進行有效遞送,如用于常規ID注射。

疫苗還可以用基于高度創新和有效電穿孔(EP)的DNA遞送系統來組合以便增加所注射的DNA疫苗的效力。具有淺電穿孔深度和低/瞬態電參數的EP遞送系統使新裝置對預防應用和群體疫苗接種的耐受性大得多。

用所提供的制造方法和電穿孔遞送裝置組合的此DNA疫苗尤其可以提供以下益處:

·無載體誘導的應答-反復加強;復合疫苗/組合疫苗

·比在靈長類動物中和人中的病毒載體效力更大

·制造優點

本文提供了單一藥劑LASV候選疫苗的細節,所述單一藥劑LASV候選疫苗已顯示出在受試者中對在豚鼠和非人靈長類動物激發模型中的致死引出100%保護。在非人靈長類動物模型中,LASV候選疫苗顯示出促進此疫苗方法的臨床轉化。先前在具有任何其它沙粒病毒候選疫苗(具載體型或非具載體型)的文獻中還沒有實現針對兩種不同激發模型的這種成功。

LASV候選疫苗是靶向舊大陸病毒和新大陸病毒兩者的復合藥劑候選疫苗。GPC抗原(病毒的免疫原性組分)在LASV、MACV以及JUNV中不是高度保守的,在不同沙粒病毒亞型(分別為LASV-MACV/JUNV和MACV-JUNV)中具有42%至71%范圍內的同源性并且在不同亞型內的序列之中具有2%至10%的差異。因此,開發復合藥劑疫苗不是顯而易見的并且充滿若干技術挑戰。

本文所提供的候選疫苗已優化了GPC候選疫苗用于各靶標的病毒亞型,以使得它們單獨針對各自的株系(例如,LASV、JUNV、MACV)有效并且共同對這些和其它沙粒病毒株進行交叉保護。制造候選疫苗以使得質粒組分處于高濃度(>10mg/mL)。候選疫苗的組分可以被組合用于用EP進行遞送。相對于不帶有EP的DNA遞送,EP遞送已顯示出改進DNA轉染和基因表達效率超過1000倍,并且改進免疫原性和療效超過10至100倍。復合DNA疫苗-低注射體積-EP遞送使得此方法尤其適用于預防性疫苗接種并且具體是復合藥劑疫苗遞送。

本文所描述的DNA疫苗方法擁有優于其它競爭性減毒活病毒/死病毒方法以及其它基于載體的方法(Ad5、MVA、YF)的獨特安全優勢,因為DNA疫苗是非復制的,不能整合到基因組中,并且不像載體,不能引起可以進一步限制具載體的疫苗的效力的抗載體血清學。DNA疫苗如今經過幾百個不同的疫苗試驗已遞送至好幾千人受試者,從安全角度來看具有較少的注意。與EP遞送一起,DNAEP疫苗(HIV、HPV、流感、HCV、前列腺癌、黑素瘤)已經由肌肉內或真皮內途徑遞送至超過150人以上的受試者和超過350次以上的疫苗接種,并且安全特性(safety?profile)不值得注意。

在一個實施方案中,候選疫苗可以具有以下性能說明:

將在豚鼠(品系13)和食蟹猴中進行激發。如在研究小節中所指出,存在兩種建立的模型用于沙粒病毒激發。

在一些實施方案中,候選疫苗將包含所有2種或更多種候選疫苗(LASV、LCMV、MACV、JUNV、GTOV、WWAV以及PICV),它們可以賦予交叉保護;而在其它實施方案中,僅存在兩種候選疫苗的組合,并且更優選地兩種(一種舊大陸和一種新大陸質粒)的實例如LASV與或者JUNV或者MACV賦予針對AV的所有多個株的保護。在一個實例中,DNA疫苗包含兩種DNA疫苗質粒(LASV+JUNV/MACV)。在另一個實例中,DNA疫苗包含候選疫苗和細胞因子質粒。在另一個實例中,DNA疫苗包含三種質粒候選疫苗,包括LASV、JUNV和MACV。

存在一些實施方案,其中候選疫苗還包括分子佐劑,例如IL-12和IL-28以及RANTES。佐劑可以增加免疫應答的寬度、它們的幅度或改變疫苗的免疫表型以便賦予疫苗以額外的益處,如:改進的交叉株療效(寬度)和/或在更低劑量下的100%療效(效力)。

在一些實施方案中,候選疫苗是靶向LASV的單一質粒。此候選單一質粒已顯示出在保護豚鼠和非人靈長類動物(“NHP”)不受致命激發影響方面高度有效。

定義

本文中所使用的術語僅是用于描述具體實施方案的目的并且不意圖進行限制。如在說明書和所附權利要求書中所使用,單數形式“一個”、“一種”以及“所述”包括復數對象,除非上下文另外清楚地指明。

針對本文中數值范圍的敘述,明確涵蓋具有相同精確度的介于其間的每個數字。例如,針對6至9的范圍,除了6和9之外還涵蓋數字7和8,并且針對6.0至7.0的范圍,明確涵蓋數字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

佐劑

本文中所使用的“佐劑”意指添加至本文所描述的DNA疫苗中以便增強由DNA構建體編碼的抗原的免疫原性的任何分子,所述分子構成DNA疫苗和下文中所描述的編碼核酸序列。

編碼序列

本文中所使用的“編碼序列”或“編碼核酸”意指包含編碼蛋白質的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列可以進一步包括可操作連接至調節元件的起始信號和終止信號,所述調節元件包括能夠在向其施用核酸的個體或哺乳動物的細胞中指導表達的啟動子和多腺苷酸化信號。

互補

本文中所使用的“互補”或“互補的”意指核酸可以意味著核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如,A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基配對。

電穿孔

本文中互換使用的“電穿孔”、“電滲透”或“動電學增強”(“EP”)意指使用跨膜電場脈沖以便在生物膜中誘導微觀路徑(孔隙);它們的存在允許生物分子如質粒、寡核苷酸、siRNA、藥物、離子以及水從細胞膜的一側穿至另一側。

片段

關于核酸序列而在本文中所使用的“片段”意指核酸序列或其一部分,所述序列編碼在與沙粒病毒GPC抗原發生交叉反應的哺乳動物中能夠引出免疫應答的多肽。片段可以是選自以下的至少一個的DNA片段:編碼共有氨基酸序列的各種核苷酸序列和包含所述序列的構建體。DNA片段可以包含用于免疫球蛋白前導的編碼序列,如IgE或IgG序列。DNA片段可以編碼以下列出的蛋白質片段。

關于多肽序列的“片段”意指在與沙粒病毒抗原發生交叉反應的哺乳動物中能夠引出免疫應答的多肽,所述沙粒病毒抗原包括例如拉沙病毒(LASV)、脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、呼寧病毒(JUNV)、馬秋博病毒(MACV)、淋巴細胞瓜納瑞托病毒(GTOV)、白水河阿羅約病毒(White-water?Arroyo?virus)(WWAV)以及皮欽德病毒(Pichinde?virus)(PICV)。

LASV糖蛋白前體(LASV-GPC)序列為約491個氨基酸,并且優選地被密碼子優化。LASV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的LASV-GPC,并且優選地含有GPC區的殘基441至449的片段。在一些實施方案中,LASV-GPC的片段包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:5。

LCMV糖蛋白前體(LCMV-GPC)序列為約498個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號NP_694851,其整體并入本文。LCMV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的LCMV-GPC,并且優選地片段包含殘基447至455。

JUNV糖蛋白前體(JUNV-GPC)序列為約485個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號BAA00964,其整體并入本文。JUNV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的JUNV-GPC,并且優選地片段包含殘基429至437。

MACV糖蛋白前體(MACV-GPC)序列為約496個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAN05425,其整體并入本文。MACV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的MACV-GPC,并且優選地片段包含殘基444至452。

GTOV糖蛋白前體(GTOV-GPC)序列為約496個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAN05423,其整體并入本文。GTOV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的GTOV-GPC,并且優選地片段包含殘基427至435。

WWAV糖蛋白前體(WWAV-GPC)序列為約496個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAK60497,其整體并入本文。WWAV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的WWAV-GPC,并且優選地片段包含殘基428至436。

PICV糖蛋白前體(PICV-GPC)序列為約496個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAC32281,其整體并入本文。PICV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的PICV-GPC,并且優選地片段包含殘基455至463。

基因構建體

本文中所使用的術語“基因構建體”是指包含編碼蛋白質的核苷酸序列的DNA或RNA分子。編碼序列包括可操作連接至調節元件的起始信號和終止信號,所述調節元件包括能夠在向其施用核酸分子的個體的細胞中指導表達的啟動子和多腺苷酸化信號。本文中所使用的術語“可表達的形式”是指包含可操作連接至編碼蛋白質的編碼序列的必要調節元件的基因構建體,這樣使得當存在于個體的細胞中時,編碼序列將被表達。

同源性

使用ClustalW軟件產生多重序列比對的同源性和系統發生圖。

同一的

在兩種或更多種核酸或多肽序列的背景下,本文中所使用的“同一的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的與在指定區上相同的殘基。可以通過以下來計算百分比:最優比對兩個序列、比較兩個序列的指定區、確定同一殘基發生在這兩個序列中的位置的數目以便得到匹配的位置的數目、用匹配的位置的數目除以指定區中的位置的總數目以及使結果乘以100以便得到序列同一性的百分比。在其中兩個序列具有不同的長度或比對產生一個或多個交錯末端以及比較的指定區僅包括單一序列的情況下,單一序列的殘基被包括在計算的分母而不是分子中。當比較DNA和RNA時,胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被認為是等同的。可以手動或通過使用計算機序列算法如BLAST或BLAST2.0進行同一性。

免疫應答

本文中所使用的“免疫應答”意指響應于引入抗原如沙粒病毒抗原來激活宿主的免疫系統,例如哺乳動物的免疫系統。免疫應答可以呈細胞應答或體液應答或這兩者的形式。

核酸

本文中所使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共價連接在一起的至少兩個核苷酸。單鏈的描寫也定義了互補鏈的序列。因此,核酸還涵蓋所描寫的單鏈的互補鏈。核酸的許多變體可以用于與給定的核酸相同的目的。因此,核酸還涵蓋大致上同一的核酸及其互補鏈。單鏈提供了在嚴格的雜交條件下可以雜交至靶標序列的探針。因此,核酸還涵蓋在嚴格的雜交條件下雜交的探針。

核酸可以是單鏈的或雙鏈的,或可以包含雙鏈序列和單鏈序列兩者的部分。核酸可以是DNA、基因組和cDNA兩者、RNA或雜交體,其中核酸可以包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合以及堿基的組合,所述堿基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶以及異鳥嘌呤。可以通過化學合成方法或通過重組方法獲得核酸。

可操作連接

本文中所使用的“可操作連接”意指基因的表達是在所述基因與其空間連接的啟動子的控制下。啟動子可以位于其控制下的基因的5’(上游)或3’(下游)。啟動子與基因之間的距離可以近似與所述啟動子與啟動子源自其中的基因中控制的基因之間的距離相同。如在本領域中已知的,可以接納此距離的變化而不失去啟動子功能。

啟動子

本文中所使用的“啟動子”意指合成的或天然來源的分子,其能夠在細胞中賦予、激活或增強核酸的表達。啟動子可以包含一個或多個特異性的轉錄調節序列以便進一步增強表達和/或以便改變其空間表達和/或時間表達。啟動子還可以包含遠側的增強子或抑制子元件,其可以位于距離轉錄起始位點高達幾千個堿基對。啟動子可以源自以下來源,包括:病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲以及動物。啟動子可以調節基因組分相對于其中發生表達的細胞、組織或器官或相對于發生表達所處的發育階段或響應于外部刺激(如生理應激、病原體、金屬離子或誘導劑)組成型地或差異性地表達。啟動子的代表性實例包括噬菌體T7啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、lac操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40晚期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子、CMV?IE啟動子、SV40早期啟動子或SV40晚期啟動子以及CMV?IE啟動子。

嚴格的雜交條件

本文中所使用的“嚴格的雜交條件”意指在所述條件下第一核酸序列(例如,探針)將雜交至第二核酸序列(例如,靶標)中的條件,如在核酸的復雜混合物中。嚴格的條件是依賴序列的并且在不同的情況中將會不同。嚴格的條件可以被選擇為在限定的離子強度、pH下低于特定序列的熱熔點(Tm)的約5℃至10℃。Tm可以是在所述溫度下處于平衡時50%互補于靶標的探針雜交至靶標序列(因為靶標序列過量存在,所以在Tm下,平衡時50%的探針被占據)的溫度(在限定的離子強度、pH以及核酸濃度下)。嚴格的條件可以是其中在pH7.0至8.3下鹽濃度小于約1.0M鈉離子,如約0.01M至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽),并且針對短探針(例如,約10至50個核苷酸)的溫度為至少約30℃,且針對長探針(例如,大于約50個核苷酸)的溫度為至少約60℃的那些條件。嚴格的條件還可以通過添加去穩定劑如甲酰胺來實現。為了選擇性的或特異性的雜交,正信號可以是背景雜交的至少2倍至10倍。示例性的嚴格雜交條件包括以下:50%甲酰胺、5×SSC以及1%SDS、在42℃下孵育;或5×SSC、1%SDS、在65℃下孵育、其中在65℃下用0.2×SSC和0.1%SDS洗滌。

大致上互補

本文中所使用的“大致上互補”意指第一序列在具有8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、180個、270個、360個、450個、540個、630個、720個、810個、900個、990個、1080個、1170個、1260個、1350個或1440個或更多個核苷酸或氨基酸的區域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一于第二序列的互補鏈,或這兩個序列在嚴格的雜交條件下雜交。

大致上同一

本文中所使用的“大致上同一”意指第一序列與第二序列在具有8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、180個、270個、360個、450個、540個、630個、720個、810個、900個、990個、1080個、1170個、1260個、1350個或1440個或更多個核苷酸或氨基酸的區域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一,或相對于核酸,如果第一序列大致上互補于第二序列的互補鏈。

亞型或血清型

“亞型”或“血清型”:在本文中可互換使用并且是關于沙粒病毒抗原,意指沙粒病毒抗原的基因變體,這樣使得一種亞型(或變體)被除了不同亞型的免疫系統識別。

變體

關于核酸而在本文中使用的“變體”意指:(i)參考的核苷酸序列的一部分或片段;(ii)參考的核苷酸序列或其部分的互補鏈;(iii)大致上同一于參考的核酸或其補體的核酸;或(iv)在嚴格條件下雜交至參考的核酸、其互補鏈的核酸,或大致上同一于其的序列。

關于肽或多肽的“變體”通過氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同,但是保留至少一種生物活性。變體還可以意指具有以下氨基酸序列的蛋白質,所述序列大致上同一于具有保留至少一種生物活性的氨基酸序列的參考蛋白質。氨基酸的保守取代,即用具有相似性質(例如,親水性、帶電區的程度和分布)的不同氨基酸替換氨基酸在本領域中通常被認為涉及微小變化。這些微小變化可以部分地通過考慮氨基酸的親水指數來鑒別,如本領域中所理解。Kyte等,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的親水指數基于其疏水性和電荷的考慮。本領域中已知的是,具有相似親水指數的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白質功能。一方面,親水指數為±2的氨基酸被取代。氨基酸的親水性還可以用來顯現取代,這將產生保留生物功能的蛋白質。在肽的背景下考慮氨基酸的親水性容許計算所述肽的最大局部平均親水性,這是一種已報道與抗原性和免疫原性很好地關聯的有用測量。美國專利號4,554,101,其以引用的方式完全并入本文。具有相似親水性值的氨基酸的取代可以產生保留生物活性(例如免疫原性)的肽,如本領域中所理解。可以用彼此具有親水性值為±2之內的氨基酸進行取代。氨基酸的疏水性指數和親水性值兩者都受到所述氨基酸的具體側鏈的影響。與所述觀察一致,與生物功能相容的氨基酸取代被理解為取決于氨基酸的相對相似性,并且具體是那些氨基酸的側鏈,如通過疏水性、親水性、電荷、大小以及其它性質所顯現。

載體

本文中所使用的“載體”意指含有復制起點的核酸序列。載體可以是載體、噬菌體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA載體或RNA載體。載體可以是自我復制的染色體外載體,并且優選地是DNA質粒。

賦形劑和疫苗的其它組分

疫苗可以進一步包含其它組分,如轉染促進劑、藥學上可接受的賦形劑、佐劑。藥學上可接受的賦形劑可以是功能性分子,如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑。藥學上可接受的賦形劑可以是轉染促進劑,其可以包括表面活性劑,如免疫刺激性復合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質A)、胞壁酰肽、醌類似物、囊泡(如角鯊烯和角鯊烯)、透明質酸、脂質、脂質體、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒,或其它已知的轉染促進劑。

轉染促進劑可以是聚陰離子、聚陽離子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂質。轉染促進劑可以是聚-L-谷氨酸。聚-L-谷氨酸可以小于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉染促進劑還可以包括表面活性劑,如免疫刺激性復合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質A)、胞壁酰肽、醌類似物以及囊泡(如角鯊烯和角鯊烯),并且透明質酸還可以與基因構建體一起施用而使用。在一些實施方案中,DNA質粒疫苗還可以包括轉染促進劑如脂質、脂質體,包括卵磷脂脂質體或本領域中已知的其它脂質體,如DNA-脂質體混合物(參見例如W09324640)、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒,或其它已知的轉染促進劑。轉染促進劑為聚陰離子、聚陽離子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂質。疫苗中的轉染劑的濃度為小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

藥學上可接受的賦形劑可以是佐劑。佐劑可以是在替代性質粒中表達或在疫苗中以蛋白質形式與以上質粒組合遞送的其它基因。佐劑可以選自由以下組成的組:α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、γ-干擾素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達的趨化因子(TECK)、粘膜相關的上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86,包括信號序列缺失的IL-15并且任選地包括來自IgE的信號肽。佐劑可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其組合。

可以是有用的佐劑的其它基因包括編碼以下的那些:MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性的NIK、SAP?K、SAP-1、JNK、干擾素應答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK?LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能片段。

疫苗可以進一步包含在1994年4月1日提交的美國序號021,579中所描述的基因疫苗促進劑,所述專利文獻以引用的方式完全并入。

可以根據待使用的施用方式配制疫苗。可注射的疫苗藥物組合物可以是無菌的、不含致熱原以及不含微粒。可以使用等滲制劑或溶液。用于等滲性的添加劑可以包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇以及乳糖。疫苗可以包含血管收縮劑。等滲溶液可以包括磷酸鹽緩沖的鹽水。疫苗可以進一步包含穩定劑,包括明膠和白蛋白。穩定劑可以允許制劑在室溫或環境溫度下穩定延長的時間段,包括LGS或聚陽離子或聚陰離子。

疫苗接種的方法

本文中提供了一種對受試者進行疫苗接種的方法。所述方法使用電穿孔作為遞送疫苗的機理。可以經由微創裝置進行電穿孔。

密碼子優化的AV?GPC抗原

LASV糖蛋白前體(LASV-GPC)序列為約491個氨基酸,并且優選地被密碼子優化。LASV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的LASV-GPC,并且優選地含有GPC區的殘基441至449的片段。在一些實施方案中,LASV-GPC的片段包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:5。

LCMV糖蛋白前體(LCMV-GPC)序列為約498個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號NP_694851,其整體并入本文。LCMV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的LCMV-GPC,并且優選地片段包含殘基447至455。

JUNV糖蛋白前體(JUNV-GPC)序列為約485個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號BAA00964,其整體并入本文。JUNV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的JUNV-GPC,并且優選地片段包含殘基429至437。

MACV糖蛋白前體(MACV-GPC)序列為約496個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAN05425,其整體并入本文。MACV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的MACV-GPC,并且優選地片段包含殘基444至452。

GTOV糖蛋白前體(GTOV-GPC)序列為約496個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAN05423,其整體并入本文。GTOV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的GTOV-GPC,并且優選地片段包含殘基427至435。

WWAV糖蛋白前體(WWAV-GPC)序列為約496個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAK60497,其整體并入本文。WWAV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的WWAV-GPC,并且優選地片段包含殘基428至436。

PICV糖蛋白前體(PICV-GPC)序列為約496個氨基酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAC32281,其整體并入本文。PICV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的PICV-GPC,并且優選地片段包含殘基455至463。

核苷酸序列—編碼序列和構建體以及質粒

LASV糖蛋白前體(LASV-GPC)核苷酸編碼序列為約1476個核苷酸,并且優選地被密碼子優化。LASV-GPC的免疫原性片段的編碼序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的所編碼的LASV-GPC,并且優選地含有GPC區的殘基441至449的片段。在一些實施方案中,LASV-GPC的編碼序列為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2。在一些實施方案中,LASV-GPC的片段的編碼序列包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的SEQ?ID?NO:4或SEQ?ID?NO:5。在一些實施方案中,LASV-GPC的片段的編碼序列包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2。

LCMV糖蛋白前體(LCMV-GPC)核苷酸編碼序列為約1494個核苷酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號NP_694851,其整體并入本文。LCMV-GPC的免疫原性片段的編碼序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的LCMV-GPC,并且優選地片段包含殘基447至455。

JUNV糖蛋白前體(JUNV-GPC)核苷酸編碼序列為約1455個核苷酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號BAA00964,其整體并入本文。JUNV-GPC的免疫原性片段的編碼序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的JUNV-GPC,并且優選地片段包含殘基429至437。

MACV糖蛋白前體(MACV-GPC)核苷酸編碼序列為約1488個核苷酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAN05425,其整體并入本文。MACV-GPC的免疫原性片段的編碼序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的MACV-GPC,并且優選地片段包含殘基444至452。

GTOV糖蛋白前體(GTOV-GPC)核苷酸編碼序列為約1488個核苷酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAN05423,其整體并入本文。GTOV-GPC的免疫原性片段的編碼序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的GTOV-GPC,并且優選地片段包含殘基427至435。

WWAV糖蛋白前體(WWAV-GPC)核苷酸編碼序列為約1488個核苷酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAK60497,其整體并入本文。WWAV-GPC的免疫原性片段的編碼序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的WWAV-GPC,并且優選地片段包含殘基428至436。

PICV糖蛋白前體(PICV-GPC)核苷酸編碼序列為約1488個核苷酸,并且優選地被密碼子優化—參見NCBI登錄號AAC32281,其整體并入本文。PICV-GPC的免疫原性片段的編碼序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的PICV-GPC,并且優選地片段包含殘基455至463。

本文提供了基因構建體,其可以包含編碼本文公開的AV?GPC抗原(包括其免疫原性片段)的核酸序列。基因構建體可以作為功能性染色體外分子存在于細胞中。基因構建體可以是線性微染色體,包括著絲粒、端粒或質粒或粘粒。

基因構建體還可以是重組病毒載體的基因組的部分,包括重組腺病毒、重組腺病毒相關的病毒以及重組痘苗。基因構建體可以是減毒活微生物或活在細胞中的重組微生物載體中的遺傳物質的部分。

基因構建體可以包含用于基因表達核酸的編碼序列的調節元件。調節元件可以是啟動子、增強子、起始密碼子、終止密碼子或多腺苷酸化信號。

核酸序列可以構成基因構建體,其可以是載體。載體可以能夠以有效于在哺乳動物中引出免疫應答的量而在哺乳動物的細胞中表達抗原。載體可以是重組的。載體可以包含編碼抗原的異源核酸。載體可以是質粒。載體可以對用編碼抗原的核酸轉染細胞有用,在其中發生抗原表達的條件下培養和維持所轉化的宿主細胞。

可以優化編碼序列的穩定性和高水平的表達。在一些例子中,密碼子被選擇來減少RNA的二級結構形成,如由于分子內鍵合所形成的。

載體可以包含編碼抗原的異源核酸,并且可以進一步包含起始密碼子和終止密碼子,所述起始密碼子可以位于抗原編碼序列的上游,而所述終止密碼子可以位于抗原編碼序列的下游。起始密碼子和終止密碼子可以在抗原編碼序列的框架中。載體還可以包含可操作連接至抗原編碼序列的啟動子。可操作連接至抗原編碼序列的啟動子可以是來自猿猴病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動子(如牛免疫缺陷病毒(BIV)長末端重復區(LTR)啟動子)、莫洛尼病毒啟動子、禽類白血病病毒(ALV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子(如CMV立即早期啟動子、埃-巴二氏病毒(EBV)啟動子)或勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子。啟動子還可以是來自人基因的啟動子,如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或人金屬硫蛋白。啟動子還可以是組織特異性啟動子,如天然或合成的肌肉或皮膚特異性啟動子。所述啟動子的實例描述在美國專利申請公布號US20040175727中,其內容整體并入本文。

載體還可以包含多腺苷酸化信號,其可以位于AV?GPC蛋白編碼序列的下游。多腺苷酸化信號可以是SV40多腺苷酸化信號、LTR多腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)多腺苷酸化信號、人生長激素(hGH)多腺苷酸化信號或人β-球蛋白多腺苷酸化信號。SV40多腺苷酸化信號可以是來自pCEP4載體(Invitrogen,San?Diego,CA)的多腺苷酸化信號。

載體還可以包含位于AV?GPC蛋白編碼序列上游的增強子。增強子可以是DNA表達所必需的。增強子可以是人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或病毒增強子,如來自CMV、HA、RSV或EBV的病毒增強子。多核苷酸功能增強描述在美國專利號5,593,972、5,962,428以及WO94/016737中,這些專利文獻各自的內容以引用的方式完全并入。

載體還可以包含哺乳動物復制起點,以便在染色體外維持載體并且在細胞中產生多個拷貝的載體。載體可以是來自Invitrogen(San?Diego,CA)的pWRG7077(參見下文Schmaljohn等)、pVAX1、pCEP4或pREP4,所述載體可以包含埃-巴二氏病毒復制起點和核抗原EBNA-1編碼區,這可以產生無整合的高拷貝的游離型復制。載體可以是pVAX1或具有變化的pVax1變體,如本文中所描述的變體質粒。變體pVax1質粒是骨架載體質粒pVAX1(Invitrogen,Carlsbad?CA)的2998個堿基對變體。CMV啟動子位于堿基137至724處。T7啟動子/引發位點處于堿基664至683處。多克隆位點處于堿基696至811處。牛GH多腺苷酸化信號處于堿基829至1053處。卡那霉素抗性基因處于堿基1226至2020處。pUC起點處于堿基2320至2993處。基于從Invitrogen可獲得的pVAX1的序列,在用作本文中列出的質粒1至6的骨架的pVAX1的序列中發現以下突變:

C>G241??在CMV啟動子中

C>T?1942??骨架,牛生長激素多腺苷酸化信號(bGHpolyA)的下游

A>-?2876??骨架,卡那霉素基因的下游

C>T?3277??在高拷貝數突變的pUC復制起點(Ori)中(參見Nucleic?Acid?Research1985)

G>C?3753??在RNASeH位點上游的pUC?Ori的最末端

在骨架中位于CMV啟動子上游的堿基對2、3以及4由ACT變為CTG。

載體的骨架可以是pAV0242。載體可以是復制缺陷的腺病毒類型5(Ad5)載體。

載體還可以包含調節序列,其可以很好地適用于在載體施用至其中的哺乳動物或人細胞中的基因表達。AV?GPC編碼序列可以包含密碼子,其可以允許在宿主細胞中更有效地轉錄編碼序列。

載體可以是pSE420(Invitrogen,San?Diego,Calif),其可以用于大腸桿菌(Escherichia?coli(E.coli))中的蛋白質產生。載體還可以是pYES2(Invitrogen,San?Diego,Calif.),其可以用于酵母的釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)菌株中的蛋白質產生。載體還可以具有MAXBACTM完全桿狀病毒表達系統(Invitrogen,San?Diego,Calif),其可以用于昆蟲細胞中的蛋白質產生。載體還可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen,San?Diego,Calif.),其可以用于哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中的蛋白質產生。載體可以是通過常規技術和容易獲得的起始材料產生蛋白質的表達載體或系統,所述技術和起始材料包括Sambrook等,Molecular?Cloning?and?Laboratory?Manual,第二版,Cold?Spring?Harbor(1989),其以引用的方式完全并入。

藥物組合物

本文提供了根據本發明的藥物組合物,在本文中又指示為DNA疫苗,其包含約1納克至約10毫克的DNA。在一些實施方案中,根據本發明的藥物組合物包含介于:1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100納克;或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克;或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10毫克或更多與2)高達并且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100納克;或高達并且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克;或高達并且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10毫克之間。在一些實施方案中,根據本發明的藥物組合物包含約5納克至約10毫克的DNA。在一些實施方案中,根據本發明的藥物組合物包含約25納克至約5毫克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約50納克至約1毫克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約0.1微克至約500微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約1微克至約350微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約5微克至約250微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約10微克至約200微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約15微克至約150微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約20微克至約100微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約25微克至約75微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約30微克至約50微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約35微克至約40微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約100微克至約200微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約10微克至約100微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約20微克至約80微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約25微克至約60微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約30納克至約50微克的DNA。在一些實施方案中,藥物組合物包含約35納克至約45微克的DNA。在一些優選的實施方案中,藥物組合物包含約0.1微克至約500微克的DNA。在一些優選的實施方案中,藥物組合物包含約1微克至約350微克的DNA。在一些優選的實施方案中,藥物組合物包含約25微克至約250微克的DNA。在一些優選的實施方案中,藥物組合物包含約100微克至約200微克的DNA。

根據本發明的藥物組合物根據待使用的施用方式來配制。在其中藥物組合物為可注射的藥物組合物的情況下,它們為無菌的、不含致熱原以及不含微粒。優選使用等滲制劑。通常,用于等滲性的添加劑可以包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇以及乳糖。在一些情況下,等滲溶液如磷酸鹽緩沖的鹽水是優選的。穩定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中,血管收縮劑被添加至制劑中。

優選地,藥物組合物是疫苗,并且更優選地DNA疫苗。

本文提供了能夠在哺乳動物中產生針對一種或多種AV的保護性免疫應答的疫苗。疫苗可以包含如本文中所討論的基因構建體。

雖然不希望受到科學理論的約束,但是疫苗可以用來引出廣泛針對一種或多種類型的AV的免疫應答(體液的、細胞的或這兩者)。

DNA疫苗被公開在美國專利號5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055以及5,676,594中,其以引用的方式完全并入本文。DNA疫苗可以進一步包含抑制其整合至染色體中的元件或試劑。疫苗可以是AV?GPC蛋白的RNA。RNA疫苗可以被引入到細胞中。

疫苗可以是重組疫苗,其包含本文中所描述的基因構建體或抗原。疫苗還可以包含以一種或多種蛋白質亞單位的形式的一種或多種AV?GPC核心蛋白;包含一種或多種AV?GPC蛋白的一種或多種死病毒顆粒;或包含一種或多種AV?GPC蛋白的一種或多種減毒病毒顆粒。減毒疫苗可以是減毒活疫苗、滅活的疫苗和使用重組載體遞送編碼一種或多種AV?GPC蛋白的外源基因的疫苗、以及亞單位和糖蛋白疫苗。減毒活疫苗、使用重組載體遞送外源抗原的那些、亞單位疫苗以及糖蛋白疫苗的實例描述在美國專利號:4,510,245;4,797,368;4,722,848;4,790,987;4,920,209;5,017,487;5,077,044;5,110,587;5,112,749;5,174,993;5,223,424;5,225,336;5,240,703;5,242,829;5,294,441;5,294,548;5,310,668;5,387,744;5,389,368;5,424,065;5,451,499;5,453,364;5,462,734;5,470,734;5,474,935;5,482,713;5,591,439;5,643,579;5,650,309;5,698,202;5,955,088;6,034,298;6,042,836;6,156,319以及6,589,529中,所述專利文獻各自以引用的方式并入本文。

疫苗可以包含針對來自世界多個具體地區的多種AV的載體和/或蛋白質。所提供的疫苗可以用來誘導免疫應答,包括治療性或預防性免疫應答。可以產生針對AV?GPC蛋白并且也廣泛在多種AV病毒上的抗體和/或殺傷性T細胞。可以分離所述抗體和細胞。

疫苗可以進一步包含藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑可以是功能性分子,如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑。藥學上可接受的賦形劑可以是轉染促進劑,其可以包括表面活性劑,如免疫刺激性復合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質A)、胞壁酰肽、醌類似物、囊泡(如角鯊烯和角鯊烯)、透明質酸、脂質、脂質體、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒,或其它已知的轉染促進劑。

轉染促進劑為聚陰離子、聚陽離子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂質。轉染促進劑為聚-L-谷氨酸,并且更優選地,聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉染促進劑還可以包括表面活性劑,如免疫刺激性復合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質A)、胞壁酰肽、醌類似物和囊泡(如角鯊烯和角鯊烯),并且透明質酸還可以與基因構建體一起施用而使用。在一些實施方案中,DNA載體疫苗還可以包括轉染促進劑,如脂質、脂質體,包括卵磷脂脂質體或本領域中已知的其它脂質體,如DNA-脂質體混合物(參見例如W09324640)、鈣離子、病毒蛋白、聚陰離子、聚陽離子或納米顆粒,或其它已知的轉染促進劑。優選地,轉染促進劑為聚陰離子、聚陽離子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂質。疫苗中的轉染劑的濃度為小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

佐劑

藥學上可接受的賦形劑可以是佐劑。佐劑可以是在替代性質粒中表達或在疫苗中以蛋白質形式與以上質粒組合遞送的其它基因。佐劑可以選自由以下組成的組:α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、γ-干擾素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達的趨化因子(TECK)、粘膜相關的上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86,包括信號序列缺失的IL-15并且任選地包括來自IgE的信號肽。佐劑可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生的生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、1L-12、IL-18或其組合。優選地,佐劑為IL12、IL15、IL28以及RANTES。

可以是有用的佐劑的其它基因包括編碼以下的那些:MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性的NIK、SAP?K、SAP-1、JNK、干擾素應答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK?LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。

遞送方法

本文提供了一種用于遞送藥物制劑(優選疫苗)以便提供AV?GPC蛋白的基因構建體和蛋白質的方法,所述基因構建體和蛋白質包含使它們成為特別有效的免疫原的表位,針對所述免疫原可以誘導對于AV病毒感染的免疫應答。可以提供遞送疫苗或疫苗接種的方法來誘導治療性和/或預防性免疫應答。疫苗接種方法可以在哺乳動物中產生針對多個AV病毒的免疫應答。可以將疫苗遞送至個體以便調節哺乳動物免疫系統的活性并且增強免疫應答。疫苗的遞送可以是AV?GPC抗原轉染為核酸分子,所述核酸分子在細胞中表達并且當免疫系統識別其時遞送至細胞的表面并且誘導細胞應答、體液應答或細胞和體液應答。疫苗的遞送可以通過向哺乳動物施用本文中所討論的疫苗而用來在哺乳動物中針對多個AV病毒誘導或引出免疫應答。一旦疫苗遞送至哺乳動物,載體隨即進入哺乳動物的細胞中,轉染的細胞便將表達和分泌AV?GPC蛋白。這些分泌的蛋白質或合成的抗原將被免疫系統識別為外源的,這將發動免疫應答,其可以包括:針對抗原得到抗體和特異性針對抗原進行T細胞應答。在一些實施例中,用本文中所討論的疫苗接種的哺乳動物將具有引發的免疫系統,并且當用AV病毒株激發時,所引發的免疫系統將允許快速清除后來的AV病毒,不論通過體液、細胞或這兩者。可以將疫苗遞送至個體以便調節個體的免疫系統的活性,從而增強免疫應答。

可以DNA疫苗的形式遞送疫苗,并且遞送DNA疫苗的方法描述在美國專利號4,945,050和5,036,006中,其均以引用的方式完全并入。

可以將疫苗施用至哺乳動物以便在哺乳動物中引出免疫應答。哺乳動物可以是人、非人靈長類動物、奶牛、豬、綿羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科動物、鹿、刺猬、大象、大羊駝、羊駝、小鼠、大鼠或雞,并且優選是人、奶牛、豬或雞。

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提交時,不提供此頁

施用途徑

疫苗可以通過不同途徑來施用,包括:經口、腸胃外、舌下、經皮、直腸、經粘膜、局部、經由吸入、經由口腔施用、胸腔內、靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、鼻內、鞘內以及關節內或其組合。對于獸醫使用,可以根據正常的獸醫實踐呈適合地可接受的制劑施用組合物。獸醫師可以容易地確定最適合于具體動物的給藥方案和施用途徑。可以通過傳統的注射器、無針注射裝置、“微粒轟擊槍”或其它物理方法如電穿孔(“EP”)、“流體動力學方法”或超聲來施用疫苗。

可以通過若干眾所周知的技術將疫苗的載體遞送至哺乳動物,所述技術包括具有和不具有體內電穿孔的DNA注射(又稱為DNA疫苗接種)、脂質體介導、納米顆粒促進、重組載體如重組腺病毒、重組腺病毒相關的病毒以及重組痘苗。AV?GPC抗原可以經由DNA注射以及連同體內電穿孔來遞送。

電穿孔

經由電穿孔疫苗的質粒進行的疫苗施用可以使用電穿孔裝置來完成,所述電穿孔裝置可以被配置來將具有有效使得可逆孔隙在細胞膜中形成的能量的脈沖遞送至哺乳動物的希望的組織,并且優選具有能量的脈沖是相似于使用者所輸入的預設電流的恒定電流。電穿孔裝置可以包括電穿孔部件和電極組件或把手組件。電穿孔部件可以包括并且并入有電穿孔裝置的各種元件中的一個或多個,包括:控制器、電流波形發生器、阻抗測試器、波形記錄儀、輸入元件、狀態報告元件、通信端口、存儲器部件、電源以及電源開關。可以使用體內電穿孔裝置例如EP系統(Inovio?Pharmaceuticals,Inc.,Blue?Bell,PA)或Elgen電穿孔儀(Inovio?Pharmaceuticals,Inc.)來完成電穿孔以便促進細胞被質粒所轉染。可以促進本發明的DNA疫苗遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法的實例包括描述在Draghia-Akli.等的美國專利號7,245,963、由Smith等遞交的美國專利公布2005/0052630中的那些,所述專利文獻的內容特此以引用的方式整體并入。可以用于促進DNA疫苗遞送的其它電穿孔裝置和電穿孔方法包括提供在2007年10月17日提交的共同待決和共有的美國專利申請序號11/874072中的那些,所述專利申請根據美國法典第35卷第119條第(e)項要求了2006年10月17日提交的美國臨時申請序號60/852,149和2007年10月10日提交的美國臨時申請序號60/978,982的權益,所有這些專利文獻都特此整體并入。Draghia-Akli等的美國專利號7,245,963描述了模塊化電極系統及其用于促進生物分子引入到身體內或植物中選擇的組織的細胞中的用途。模塊化電極系統可以包括多個針電極;皮下針;提供從可編程恒流脈沖控制器至多個針電極的導電鏈路的電連接器;以及電源。操作者可以握住安裝在支撐結構上的多個針電極并且牢牢地將它們插入到身體或植物中選擇的組織中。然后經由皮下針將生物分子遞送到所選擇的組織中。激活可編程恒流脈沖控制器,并且將恒流電脈沖施加至多個針電極。所施加的恒流電脈沖促進生物分子引入到多個電極之間的細胞中。美國專利號7,245,963的整個內容特此以引用的方式并入。

Smith等遞交的美國專利公布2005/0052630描述了一種電穿孔裝置,其可以用來有效地促進生物分子引入到身體或植物中選擇的組織的細胞中。電穿孔裝置包括電動裝置(“EKD裝置”),其操作是通過軟件或固件來指定的。EKD裝置基于使用者控制和輸入脈沖參數而在陣列中的電極之間產生一系列可編程恒流脈沖樣式,并且允許電流波形數據的存儲和獲取。電穿孔裝置還包括具有針電極陣列的可替換電極圓盤、用于注射針的中心注射通道以及可移除的導向圓盤。美國專利公布2005/0052630的整個內容特此以引用的方式并入。

在美國專利號7,245,963和美國專利公布2005/0052630中描述的電極陣列和方法可以適于深度滲透到不僅如肌肉的組織中,而且其它組織或器官中。由于電極陣列的配置,注射針(為了遞送所選擇的生物分子)也被完全插入到靶標器官中,并且在被電極預先勾勒的區域中,垂直于靶標組織施用注射。在美國專利號7,245,963和美國專利公布2005/005263中描述的電極優選地為20mm長和21號。

另外,在一些實施方案中涵蓋并入有電穿孔裝置及其用途,存在描述在以下專利中的那些電穿孔裝置:1993年12月28日授權的美國專利5,273,525、2000年8月29日授權的美國專利6,110,161、2001年7月17日授權的美國專利6,261,281和2005年10月25日授權的美國專利6,958,060以及2005年9月6日授權的美國專利6,939,862。此外,涵蓋提供在2004年2月24日授權的美國專利6,697,669中的主題的專利,其涉及使用任何各種裝置遞送DNA,以及指出注射DNA的方法的2008年2月5日授權的美國專利7,328,064被涵蓋在本文中。以上專利以引用的方式整體并入。

制備疫苗的方法

本文提供了用于制備DNA質粒的方法,所述DNA質粒包含本文中討論的DNA疫苗。在最后亞克隆步驟到哺乳動物表達質粒中之后,使用本領域中已知的方法,DNA質粒可以用來在大規模發酵罐中接種細胞培養物。

可以使用已知的裝置和技術的組合配制或制造用于與本發明的EP裝置一起使用的DNA質粒,但優選地使用優化的質粒制造技術制造它們,所述質粒制造技術技術被描述在2007年5月23日提交的美國公布申請號20090004716中。在一些實施例中,可以在大于或等于10mg/mL的濃度下配制這些研究中所使用的DNA質粒。除了描述在美國序號60/939792中的那些之外,制造技術還包括或并入有本領域普通技術人員通常已知的各種裝置和實驗方案,包括描述在2007年7月3日授權的許可使用的專利、美國專利號7,238,522中的那些。以上引用的申請和專利(分別是美國序號60/939,792和美國專利號7,238,522)特此整體并入。

實施例

在以下實施例中進一步說明了本發明。應該理解,這些實施例雖然指明了本發明的優選實施方案,但是它們僅以說明的方式給出。從以上討論和這些實施例,本領域技術人員可以確定本發明的本質特征,并且在不背離其精神和范圍的情況下,可以對本發明作出各種變化和修改以便使其適宜各種用法和條件。因此,除了本文中所顯示和描述的那些之外,本領域技術人員從上述描述將對于本發明的各種修改變得清楚。

動物研究—豚鼠。將第13品系豚鼠(Cavia?porcellus)分成每組6只動物的4個組(先導研究)或每組8只或5只動物的7個組(跟蹤研究)。使動物麻醉,然后在3周的時間間隔里,施用真正的(LASV-GPC—SEQ?ID?NO:1(優化的)或SEQ?ID?NO:3(未優化的))或模擬的(空質粒)12μg(基因槍或GG)或100μg(經由肌肉內電穿孔裝置(IM?EP)、微創皮內裝置(MID)或無創裝置(NINV))DNA的疫苗接種。在最后一次疫苗接種之后四周,在4級生物安全等級(BSL)條件下進行病毒感染。每個動物施用1000pfu的單次皮下劑量的LASV。每日觀察動物的疾病進展。在感染前第7天或感染后第0天、第7天、第14天、第21天以及第29天或第32天獲取血液樣品。當動物垂死時,使其安樂死。分析血清樣品的病毒血癥和血液化學值。對每只動物進行尸體解剖,并且分析組織的LASV特異性組織病理學和免疫組織化學的分析。

動物研究—非人靈長類動物。將食蟹獼猴(Macaca?fasicularis)分成每組4只動物的2個組。使動物麻醉,然后在3周的時間間隔里,施用真正的或模擬的1mg?DNA(SEQ?ID?NO:2)的疫苗接種。在最后一次疫苗接種之后四周,在BSL-4條件下進行病毒感染。每只動物施用1000pfu的單次肌肉內劑量的LASV。每日觀察動物的疾病進展。在感染后第0天、第3天、第6天、第10天、第14天、第21天、第28天以及第45天獲取血液樣品。當動物垂死時,使其安樂死。分析血液樣品的CBC、血液化學以及血清病毒血癥。

病毒血癥的分析。在37℃、5%CO2下,在輕柔旋轉下,用血清的10倍連續稀釋液吸附接種于6孔細胞培養板中的Vero細胞,保持1h,然后將含0.8%瓊脂糖的具有10%胎牛血清的EBME覆層施加至每個孔。然后在37℃、5%CO2下,孵育細胞4天,然后用中性紅(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色。對噬斑計數并且記錄下來。

血液化學分析。經由Piccolo血液化學分析儀(Abaxis)上的13項普通化學檢測(General?Chemistry13-panel)旋轉器分析靈長類動物血清樣品的GLU、CRE、UA、CA、ALB、TP、ALT、AST、(ALP)、TBIL、GGT以及AMY。經由Abaxis?VetScan血液化學分析儀分析豚鼠樣品的全套代謝功能檢測上的以上各項。

全血計數。對于靈長類動物研究,在Hemavet儀器(Drew?Scientific)上分析約25ul體積的全EDTA血液。

組織的病理分析。將組織包埋于石蠟中,切片并且用蘇木精和曙紅染色。使用LASV特異性單克隆抗體和可商購的試劑盒(Envision?System;DAKO,Carpinteria,CA)進行免疫組織化學分析。使組織脫石蠟,阻斷,然后與一級抗體和二級抗體一起孵育,然后用蘇木精復染。

組織的病理分析。將組織包埋于石蠟中,切片并且用蘇木精和曙紅染色。使用LASV特異性單克隆抗體和可商購的試劑盒(Envision?System;DAKO,Carpinteria,CA)進行免疫組織化學分析。使組織脫石蠟,阻斷,然后與一級抗體和二級抗體一起孵育,然后用蘇木精復染。

LASV?DNA的產生

通過將編碼LASV(Josiah株)的糖蛋白前體(GPC)基因的cDNA克隆到更早所描述的質粒載體pWRG7077(Schmaljohn等,J.Vir.71,9563-9569(1997))中來產生LASV?DNA疫苗。將LASV-GPC基因克隆到NotI/BgIII限制性位點中。表達處于CMV啟動子的控制下。

通過肌肉內(IM)EP遞送到豚鼠中并進行激發來測試疫苗的保護功效,這發展為類似于在非人靈長類動物(NHP)和人中所觀察的出血性疾病。在3至4周的時間間隔里,使豚鼠(每組6只)通過肌肉內(IM)EP接受50μg或通過基因槍(GG)接受約5μg的DNA疫苗(包含SEQ?ID?NO:3)三次。在疫苗接種之后約4周,通過腹膜內(IP)施用1000個噬斑形成單位(pfu)的LASV(標準致死激發劑量)來激發豚鼠。所有對照豚鼠都死于LASV感染,而83%的疫苗接種的動物存活,并且死亡的單一動物顯示出死亡時間延遲。在接種疫苗但不是對照豚鼠中進行激發之后,檢測針對LASV的中和抗體,從而表明啟動應答是由DNA疫苗引起(數據未示出)。

雖然此豚鼠研究證明了IM?EP加LASV?DNA疫苗可以引起保護性免疫,但是受激發的動物確實出現發熱并且顯示出輕微的疾病臨床癥狀(圖1A、圖1C);因此,尋求疫苗構建體和皮內遞送方法的進一步改進。針對此目標,對LASV?GPC?DNA疫苗進行了優化以使哺乳動物密碼子可獲得性最大并且去除顯示出危害表達的病毒元件。在第13品系豚鼠(每組8只)中測試此優化的疫苗(包含SEQ?ID?NO:1),在3至4周的時間間隔里,使用參數經過修正的肌肉內電穿孔裝置(IM?EP)、用微創皮內裝置(MID)或用無創裝置(NINV)疫苗接種50μg的DNA三次。(MID)具有形狀為三角形的電極間距,其中在一側上具有3mm間隔的電極并且另外兩側上為5mm間隔的電極。NINV具有呈4×4模式的電極陣列,使得它與皮膚表面接觸而不會滲透皮膚(或替代地進入皮膚到角質層中)。

在激發之后,用空質粒疫苗接種的所有豚鼠或沒有接受疫苗的那些豚鼠出現發熱,展現出疾病的癥狀、體重減輕并且在激發之后第15天到第18天死于感染(圖1)。相比之下,通過任何EP方法用密碼子優化的LASV?DNA疫苗接種的所有豚鼠都在激發中存活。與用未優化的LASV?DNA疫苗接種的豚鼠顯示出疾病癥狀的先導研究不同,在此研究中,MID和IM?EP組中的豚鼠都沒有展現出疾病的癥狀,無發熱并且維持恒定的體重。然而,在通過IM?EP接受LASV?DNA疫苗的一些豚鼠中觀察到輕微的疾病癥狀,包括低熱和輕微的病毒血癥,這表明皮膚電穿孔在此研究中更有效。

圖2展示出使用IM或MID皮膚EP裝置,用密碼子優化的LASV?DNA或用空質粒對照進行疫苗接種的豚鼠(每組8只)的存活曲線。在最后一次疫苗接種之后4周,用1000pfu的LASV激發豚鼠。

為了證實疫苗和遞送方法的功效和持久性,選擇一小組通過MID?EP接種疫苗的豚鼠用于反激發實驗。將這些豚鼠保持在BSL-4防護中,持續120天,并且然后連同4個重量匹配的未經過處理的豚鼠一起用1000pfu的LASV激發。每日觀察豚鼠,持續30天,接著進行病毒感染,并且監測體重、溫度以及疾病進展。在研究和存活的再感染期間,接種疫苗的動物從未患病(圖3)。

圖3展示出一小組通過MID?EP接種疫苗的豚鼠的反激發實驗的結果,其中圖3A顯示出組中體重的變化,并且圖3B顯示出各組的平均體溫的變化。

進一步評估了在NHP中通過MID?EP遞送的密碼子優化的LASV?DNA疫苗(包含SEQ?ID?NO:2)。NHP模型是用于評價疫苗功效的信息量最大的模型,因為在這些動物中觀察到的疾病最接近地模擬了人的疾病。

在3周的時間間隔里,使用MID?EP裝置,用1mg的LASV?DNA疫苗(包含SEQ?ID?NO:2)或1mg的空載體質粒疫苗接種具有四個NHP的組三次,并且在最后一次疫苗接種之后4周,通過IM注射1000pfu的LASV來進行激發。監測從NHP收集的血液樣品的CBC和血液化學,并且每日兩次觀察動物的疾病進展。在出血時間窗的期間(感染后第13天和第17天),四個對照NHP中有兩個死于疾病。其它兩個對照NHP出現神經癥狀,包括共濟失調和耳聾,如通過將它們在研究最后一天(激發后第45天)所產生的聽力圖與LASV?DNA疫苗接種的NHP的那些聽力圖比較所表明(圖4)。耳聾(單邊或雙邊)是在約30%的LASV患者中發生的公認的LASV感染的結果,但根據我們的知識,這是NHP中的此疾病后果的第一個文件證據,并且可以充當疾病標記。

如在圖4中所顯示,NHP#2和NHP#7的聽力圖分別為用空質粒或LASV?DNA疫苗接種的。由用0分貝刺激猴得到的聽力圖沒有顯示出響應。NHP#2的左耳和右耳的聽力圖在75分貝下沒有顯示出響應,相比之下,NHP#7的聽力圖顯示出聽力響應圖案。

雖然兩個對照NHP在感染中存活,但是在整個研究中,它們持續病重(感染后第45天)。相比之下,四個LASV?DNA疫苗接種的NHP看起來在整個研究中都是健康的,從未發熱,并且維持正常的CBC和血液化學(圖5)。

圖5展示出通過MID?EP用LASV?DNA疫苗或空質粒疫苗接種并用LASV激發的NHP的存活評分、病毒血癥評分以及發病率評分。圖5A顯示出所有LASV?DNA疫苗接種的NHP在LASV激發中存活,而用空質粒疫苗接種的4個對照NHP中有2個死于感染。圖5B顯示出全部4個空質粒疫苗接種的NHP出現病毒血癥,但是2個存活的NHP能夠在激發后28天清除病毒。LASV?DNA疫苗接種的NHP在所有時間點都是無病毒血癥的。C.發病率評分是NHP在研究期間的患病程度的量度。對照動物在死亡前病重。直到研究結束還未死亡的持續病重的2個NHP從未恢復到激發前的狀況。LASV?DNA疫苗接種的NHP從未患病。

圖6顯示出接受LASV-GPC(包含SEQ?ID?NO:2)或模擬DNA疫苗的獼猴的選擇的血液化學值。

圖7展示出用LASV-GPC(包含SEQ?ID?NO:2)和模擬DNA疫苗兩者疫苗接種的獼猴(NHP)的CBC和血液化學。所展現的結果顯示出NHP中正常的CBC和血液化學。

實驗和方法

進行LASV?DNA疫苗的劑量范圍研究(1至8個月):

有待評價第13品系豚鼠中的三種劑量的LASV?DNA疫苗。在先前的研究中,在3周時間間隔里通過MID?EP給予的50μg?LASV?DNA疫苗的三次疫苗接種為第13品系豚鼠提供了完全的保護性免疫。將比較通過MID?EP(表1)給予的50μg、5μg以及1μg的在縮短的給藥方案(3周分開給予兩次疫苗接種)中的疫苗的保護功效。

表1

通過真皮內電穿孔遞送至品系13豚鼠的LASV密碼子優化的DNA疫苗的劑量范圍評價。

確定JUNV和MACV?DNA疫苗的交叉保護和復合藥劑疫苗制劑 的測量干擾

將測試DNA疫苗皮膚電穿孔系統作為復合藥劑疫苗平臺的總體適用性。將產生針對JUNV和MACV(其享有約96%的GPC氨基酸同源性)的密碼子優化的DNA疫苗,并且將進行交叉激發研究(表2)。當確定JUNV和MACV疫苗為交叉保護性時,則旨在保護不受舊大陸和新大陸沙粒病毒影響的未來研究可以僅使用兩種疫苗之一與LASV疫苗組合。此研究中的一組豚鼠將用所有三種DNA候選疫苗接種并且用LASV激發。

表2

先導研究評價:(1)JUNV和MACV密碼子優化的DNA疫苗的交叉保護;以及(2)疫苗平臺的復合藥劑效力。

測量NHP激發模型中的免疫相關性、劑量減少以及細胞因子佐 劑

將進行研究來測量通過EP用LASV?DNA疫苗(包含SEQ?ID?NO:2)在具有和不具有細胞因子佐劑下疫苗接種非人靈長類動物(NHP)的免疫應答(參見以下表3中的清單)。在疫苗接種之后,將在BSL-4防護實驗室中激發NHP。

將與LASV?DNA疫苗、IL-28以及IL-12組合測試兩種細胞因子DNA質粒。

在3周時間間隔里用1mg的LASV?DNA疫苗(包含SEQ?ID?NO:2)接種NHP三次顯示出在早期研究中顯示對LASV的激發的保護。將進行研究來比較以下給藥:在4周時間間隔里給予劑量1mg的疫苗三次與間隔8周給予相同劑量兩次。另外,將比較單獨或與表達IL-12或IL-28細胞因子的基因的質粒組合給予的半強度劑量疫苗(0.5mg)。這些細胞因子用以輔佐疫苗并且提供改進的細胞介導的免疫應答。

細胞免疫表型由LASV疫苗誘導,并且細胞因子佐劑將通過以下分析來評價:抗原特異性IFNg?ELISPOT、細胞內細胞因子染色(包括測定多功能性T細胞分布)、經由CFSE稀釋的增殖以及對于溶細胞性CD8+T細胞的標記的染色,包括表達Tbet、穿孔蛋白、顆粒酶B以及CD107a如在Hersperger等2010a、Hersperger等2010b、Morrow等2010b以及Migueles等2008中所描述。這些免疫測定的組合將允許特異性的詢問針對LASV?DNA疫苗的CD8+T細胞應答,其中特別強調CTL(細胞毒性淋巴細胞)表型和活性,如CD8+T細胞的此功能直接與消除病毒感染的細胞相關并且構成免疫系統控制和消除病毒感染的主要機理。采用IL-12和IL-28的先前研究已表明這些佐劑都能驅動疫苗特異性的CTL誘導,其展示出穿孔蛋白釋放、顆粒酶B負荷和釋放、以及CD107a表達的強勁增加。在除了佐劑之外還使用HIV抗原的NHP模型中進行所述研究,并且在PBMC以及從腸系膜淋巴結中收獲的T細胞中都看到這些增加的應答,從而表明這些佐劑對外周血以及二級淋巴器官施加了影響。此外,IL-12和IL-28都能夠長期對CTL表型和功能施加它們的影響,因為在最后免疫之后3個月進行的分析顯示出增強的抗原特異性免疫應答的持續存在。

表3

具有和不具有IL-12或IL-28佐劑的NHP中的給藥

LASV?DNA疫苗效力測定的開發

為了能使IND提交,將需要有力的和可靠的效力測定。定量的流式細胞效力測定有待用于AV疫苗,例如LASV?DNA疫苗。已經開發了類似的測定,并且在用于具有由漢坦病毒(hantavirus)感染引起的腎病綜合癥的出血熱(Badger等2011)的DNA疫苗的第1階段臨床研究的支持下在USAMRIID已用了多于三年,并且支持用于委瑞內拉馬腦炎病毒(Venezuelan?equine?encephalitis?virus)的DNA疫苗的IND提交。通常,方法涉及用測試DNA轉染細胞,并且將所測量的抗原表達與用從已知量的參比物質DNA的表達所產生的進行比較。

測定是快速的(小于一天)、高度可再現的,并且已經適于在良好實驗室實踐(GLP)指南下進行。因此,管理文件和程序已經到位。這應該極大地促進了適應用于測量LASV?DNA疫苗的效力的測定。雖然單獨的這項測定足以測量DNA疫苗的效力和穩定性,但因為對于LASV感染存在很少的保護性免疫的相關性,所以我們還將在第一年的每個穩定性時間點疫苗接種小組的豚鼠以便提供基因表達與抗原性相關聯的信息。

豚鼠激發模型是用于AV評價AV疫苗功效的被接受的模型。使用MID裝置,在3至4周時間間隔里用50ug的GPC?DNA?LASV疫苗疫苗接種動物3次。在最后疫苗接種之后三周,通過肌肉內注射1000pfu的LASV激發動物。如在圖2中所顯示出,大于90%的疫苗接種的動物在激發中存活,而截至激發后第15天,100%的對照(模擬疫苗接種的)動物死亡。圖5顯示出來自NHP研究的激發數據。在3周時間間隔里,用1mg的GPC?DNA?LASV疫苗或1mg的空載體疫苗接種具有4個NHP的組3次,并且在最后疫苗接種之后4周通過肌肉內注射1000pfu?LASV來激發。4/4的疫苗接種的NHP存活并且沒有顯示出病毒血癥的跡象,而4/4對照動物發展了病毒血癥并且2/4對照動物死于激發。

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