鬼佬大哥大
  • / 7
  • 下載費用:30 金幣  

一種轉移因子的制備方法.pdf

關 鍵 詞:
一種 轉移因子 制備 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201310640313.9

申請日:

20131204

公開號:

CN103611023B

公開日:

20160113

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/902,A61K35/57,A61P37/04,A61P31/12 主分類號: A61K36/902,A61K35/57,A61P37/04,A61P31/12
申請人: 山東魯冠獸藥有限責任公司
發明人: 馬秀娥,牛宗菲,王雪艷,王耀彬
地址: 250002 山東省濟南市市中區齊賢鎮濟微路130號
優先權: CN201310640313A
專利代理機構: 濟南泉城專利商標事務所 代理人: 張貴賓
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201310640313.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及醫藥技術領域,特別公開了一種轉移因子的制備方法。該轉移因子的制備方法,取健康雞的新鮮脾臟,處理后提取得到轉移因子。本發明采用健康雞的新鮮脾臟制的轉移因子,該轉移因子能夠有效的抑制病毒,能夠保護正常機體細胞免受病毒的感染,從根本上預防病毒病的發生,提供抗病力,增強機體免疫力。另外,本發明的制備方法簡單易行,生產時間短,成本低,具有很好的應用前景。

權利要求書

1.一種轉移因子的制備方法,以45日齡以上的健康雞的新鮮脾臟及淋巴結組織為原料,其特征為,包括如下步驟:(1)將原料用冷三蒸水洗凈,去除其表面的筋膜、脂肪組織,再用滅菌生理鹽水反復沖洗;(2)將清洗后的原料剪碎,加入2倍體積的冷生理鹽水后,采用多頻超聲正交破壁技術研磨制得勻漿液;(3)將勻漿液置于-30℃下快速冷凍后,水浴30-37℃中融化,交替凍融6次,每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎;(4)凍融后的勻漿液加入3倍體積的冷生理鹽水,置于低溫高速大通量管式連續流離心機中,于4℃下以19000-21000r/min離心30分鐘,回收濾液并用0.45μm濾膜加壓抽濾;(5)將抽濾后的濾液采用高通量聚醚砜中空纖維透析器透析,4℃連續循環4次,收集到的濾液經中空纖維超濾膜包加壓超濾;(6)在無菌條件下,將超濾得到的濾液用空間為0.05μm的濾膜抽濾除菌,然后采用納米膜純化,最終得到轉移因子溶液;(7)在每100ml轉移因子溶液中添加1-3g絞股藍提取物、1-5g澤蘭提取物、1-5g三棱提取物、1-5g山藥提取物和1-3g水飛薊提取物,得到產品。2.根據權利要求1所述的轉移因子的制備方法,其特征在于:步驟(2)中,研磨過程中,以3000r/min搗碎3次,每次3min,制得勻漿液。3.根據權利要求1所述的轉移因子的制備方法,其特征在于:步驟(4)中,凍融后的勻漿液加入0.2%體積的甲醛于37℃下滅活24小時,之后再加入冷生理鹽水。4.根據權利要求1所述的轉移因子的制備方法,其特征在于:步驟(5)中,高通量聚醚砜中空纖維透析器的孔徑為0.22μm,中空纖維超濾膜包的孔徑為0.1μm。5.根據權利要求1所述的轉移因子的制備方法,其特征在于:步驟(7)中,所述產品用無菌瓶分裝后在2-8℃或-20℃下冷藏保存。

說明書

(一)技術領域

本發明涉及醫藥技術領域,特別涉及一種轉移因子的制備方法。

(二)背景技術

轉移因子發現于20世紀40年代,并于20世紀70年代應用于臨床,是一種能傳遞遲發性超敏反應、分子量小于10000的具有生物活性的多肽及核苷酸的混合物,其具有活性不被胰蛋白酶、核糖核酸酶所破壞,耐熱、無種屬界限的特點。

轉移因子的主要成分為健康豬或牛脾臟中提取的多肽、氨基酸和多核苷酸等。臨床可用于輔助治療某些抗生素難以控制病毒性或霉菌性細胞內感染(如帶關皰疹、流行性乙型腦炎、白色念球菌感染、病毒性心肌炎等),對惡性腫瘤可作為輔助治療劑,對免疫缺陷病,如濕疹、血小板減少、多次感染綜合征及慢性皮膚黏膜真菌病等,有一定的療效。

(三)發明內容

本發明為了彌補現有技術的不足,提供了一種制備時間短、生產成本低的轉移因子的制備方法。

本發明是通過如下技術方案實現的:

一種轉移因子的制備方法,以45日齡以上的健康雞的新鮮脾臟及淋巴結組織為原料,包括如下步驟:

(1)將原料用冷三蒸水洗凈,去除其表面的筋膜、脂肪組織,再用滅菌生理鹽水反復沖洗;

(2)將清洗后的原料剪碎,加入2倍體積的冷生理鹽水后,采用多頻超聲正交破壁技術研磨制得勻漿液;

(3)將勻漿液置于-30℃下快速冷凍后,水浴30-37℃中融化,交替凍融6次,每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎;

(4)凍融后的勻漿液加入3倍體積的冷生理鹽水,置于低溫高速大通量管式連續流離心機中,于4℃下以19000-21000r/min離心30分鐘,回收濾液并用0.45μm濾膜加壓抽濾;

(5)將抽濾后的濾液采用高通量聚醚砜中空纖維透析器透析,4℃連續循環4次,收集到的濾液經中空纖維超濾膜包加壓超濾;

(6)在無菌條件下,將超濾得到的濾液用空間為0.05μm的濾膜抽濾除菌,然后采用納米膜純化,最終得到轉移因子溶液;

(7)在轉移因子溶液中添加絞股藍提取物、澤蘭提取物、三棱提取物、山藥提取物和水飛薊提取物,得到產品。

本發明的更優方案為:

步驟(2)中,研磨過程中,以3000r/min搗碎3次,每次3min,制得勻漿液。

步驟(4)中,凍融后的勻漿液加入0.2%體積的甲醛于37℃下滅活24小時,之后再加入冷生理鹽水。

步驟(5)中,高通量聚醚砜中空纖維透析器的孔徑為0.22μm,中空纖維超濾膜包的孔徑為0.1μm。

步驟(7)中,每100ml轉移因子溶液中添加有1-3g絞股藍提取物、1-5g澤蘭提取物、1-5g三棱提取物、1-5g山藥提取物和1-3g水飛薊提取物。

其中,絞股藍清熱,補虛,解毒;澤蘭活血化瘀,利水消腫,解毒消癰,有利于改善血液微循環;三棱破血行氣,消積止痛,可直接破壞腫瘤細胞,對人肺癌細胞的凋亡有誘導作用;山藥補脾,養肺,固腎,益精;水飛薊清熱解毒,保肝,利膽,保腦,抗X射線,可使肝臟病患者自覺癥狀和某些生化指數如血清膽紅素、白朊及球朊系數、凝血酶原、丙氨酸氨基轉移酶等迅速改善;上述各提取物的添加有效增強轉移因子溶液的功能和應用效果。

步驟(7)中,所述產品用無菌瓶分裝后在2-8℃或-20℃下冷藏保存。

本發明簡單易行,生產時間短,成本低,采用健康雞的新鮮脾臟制得的轉移因子,能夠有效地抑制病毒,保護正常機體細胞免受病毒的感染,從根本上預防病毒病的發生,提供抗病力,增強機體免疫力,具有很好的應用前景。

(四)具體實施方式

實施例1:轉移因子的制備

(1)原材料選材:要求雞群嚴格按特別定制的免疫程序免疫、45日齡以上健康畜禽,從源頭上確保能生產出高含量、高活性的新一代多肽制劑。(免疫程序要求:1、全部采用進口疫苗;2、必須最少免疫:馬立克免1次,新城疫免3次,法氏囊免2次,新流免2次)。

(2)原材料的制備及預處理:取健康雞的新鮮脾臟及淋巴結組織,用冷三蒸水洗凈雞脾,去其表面的筋膜、脂肪等組織,再用滅菌生理鹽水反復沖洗。

(3)組織破碎:采用多頻超聲波正交破壁技術。

提取收得率高低主要取決于有效成分脫離胞膜、胞漿的吸附,合理有效的細胞膜破碎技術是利用機械物理方法。將洗干凈的雞脾臟剪碎,加入2倍體積的冷生理鹽水,采用國際先進超聲技術研磨,以3000r/min搗碎3次,每次3min,制得勻漿液;通過空化效應破壁(與常規破壁法比)時間短(時間縮至原來的3/8)、操作簡單、破壁率提高30%以上,核糖提高25.3-54.4%,大分子雜質全部清除。

(4)反復凍融:將勻漿液置于-30℃快速冷凍,水浴30-37℃中融化,交替凍融6次,每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎;

凍融:-30℃、6天實驗數據。

數據可得反復凍融6次,有效物質含量最高,活性最高。選凍融6次最佳。

(5)離心提取:采用低溫高速大通量管道式離心機離心技術。

凍融后的勻漿液(加入0.2%甲醛37℃進行滅活24小時)加入3倍體積的冷生理鹽水,置于低溫高速大通量管式連續流離心機于4℃以19000-21000r/min離心30分鐘,取濾液;與常規臺式離心機相比,時間短、操作簡單、效率高、效果好、成本低。

離心:低溫高速大通量連續流管式離心。

開始用杯式離心機,濾液回收率低,殘渣無法回收,環境處理費用高。后改用低溫連續流離心機離心,濾液回收率提高12%,殘渣利用率98%(給飼料公司作為蛋白原料使用),無需環境處理,降低成本,節約資源,增加產量。

(6)抽濾:將離心回收濾液置于布氏漏斗,用0.45μm濾膜加壓抽濾。

(7)透析:采用德國薩克森公司最新透析技術.

采用高通量聚醚砜中空纖維膜透析器(孔徑0.22μm)透析(治療尿毒癥等血液透析所用),清除率185-192ml/min。4℃連續循環4次,時間縮短,有效物質含量由60mg/ml增加至102.6mg/ml,提高了58%,成本低(一般采用透析袋一次性在冰箱透析,時間長、成本高、含量低)。

透析:德國進口透析器連續循環4次,時間縮短,有效物質含量高。

(8)超濾濃縮:將上述濾液用進口中空纖維超濾膜包(孔徑0.1μm)加壓超濾,棄液可反復回流利用,通過更換不同孔徑的膜包得到不同濃度的濾液;超濾技術的優點是操作簡便,成本低廉,不需增加任何化學試劑,尤其是超濾技術的實驗條件溫和,與蒸發、冷凍干燥相比沒有相的變化,而且不引起溫度、pH的變化,因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。在生物制劑的制備技術中,超濾主要用于生物分子的脫鹽、脫水和濃縮等。從而達到高產能、高質量、高濃縮的轉移因子。活力測定玫瑰花結率由12.4%,增至21.2%,提高了71%,大大高于質量標準中活力不得低于10%的規定。

(9)除菌:在無菌條件下將超濾得到的濾液用孔徑為0.05μm的濾膜抽濾除菌;

(10)凈化:在保證產品高生物活性的前提下,率先采用納米膜純化。將高活性轉移因子包藏于低聚殼聚糖的空穴結構內,形成微囊化包合物,有效保護產品生物活性,提高藥物穩定性,確保良好口服效果。工藝收率由3.846mg/ml增至6.472mg/ml,提高了68%。

每100ml轉移因子溶液中添加有1-3g絞股藍提取物、1-5g澤蘭提取物、1-5g三棱提取物、1-5g山藥提取物和1-3g水飛薊提取物,得到最終產品。

(11)分裝:用無菌瓶分裝后在2-8度或-20度冷藏保存。

(12)全程經過11道工序全部萬級無菌處理.生產工藝改進以后,不僅提高了轉移因子的收率、含量及活性,而且為利用超濾技術制備高含量制劑提供了基礎,降低了生產成本,提高了經濟效益。

實施例2:產品臨床試驗證明

聊城獸醫站在肉食雞、蛋雞通過對照組、試驗組做對比試驗,結果顯著。

聊城張某處選擇3棚1日齡AA雛雞,分別編號1號棚、2號棚、3號棚,其中1、2號棚為實驗組,3號棚為對照組。2號棚又分為a組和b組,其中a組為實驗組,b組為對照組。

1號棚在1、2、3日齡全群使用藍盾,1000羽/瓶。2號棚a組雞群使用藍盾,b組雞群作為相同飼養環境下的對照組。3號棚使用安慰劑作為對照組。

在第7日齡,首免新城疫時,藍盾配合疫苗使用,1000羽/瓶藍盾。

在第10和20日齡,分別于1號和3號取5只雞,取其法氏囊、胸腺和脾臟,分別稱重,并記錄。在2號棚分別于實驗組和對照組取5只雞,取其法氏囊、胸腺和脾臟,分別稱重并記錄30日齡肉雞免疫器官質量結果。

1號棚在1、2、3日齡全群使用轉移因子溶液,1000羽/瓶。2號棚a組雞群使用轉移因子溶液,b組雞群作為相同飼養環境下的對照組。3號棚使用安慰劑作為對照組。

60日齡蛋雞抗體水平檢測結果(同時檢測1號、2號和3號)

自30日齡后記錄各組臨床數據。

采食量,傷亡率,呼吸道癥狀,消化道癥狀,出欄率,平均體重及料肉比等等。

實施例3:脾源轉移因子溶液的臨床試驗數據:

選1日齡雛雞200羽,飼養至6日齡時選優150羽隨機分為5組,每組30羽。

各組7日齡首免新城疫Lasota株;10日齡剖檢部分雞,測其胸腺、脾臟、法氏囊重量;10日齡測白細胞介素Ⅱ水平;

對脾臟重量的影響:10日齡

對法氏囊重量的影響:10日齡

對胸腺重量的影響:10日齡

對新城疫抗體水平的影響:14日齡抗體抑制價Log2

實施例3:使用實例

(1)臨沂蒙陰某養殖場飼養白羽肉雞1.8萬羽,共兩個雞舍,每棟9000羽。據場主回憶,當時由于雞苗在運輸過程中保溫措施沒做好,同時雞苗的整體狀況也較差,到場接苗時已經有些死苗,雞群扎堆嚴重。用脾源轉移因子溶液,從一日齡開始,1000羽/瓶,連用了三天之后,兩個棚的雞群整體狀況很好,采食增料都非常好。在7日齡、14日齡、21日齡防疫時把轉移因子溶液配合著疫苗使用,。最后40天雞群出欄時,平均體重達到了2.6公斤,料肉比1.66,場主非常認可,準備重新考慮養殖用藥程序,把轉移因子加到程序中去。

(2)濰坊壽光某養殖戶,養殖肉鴨15000羽,每批用轉移因子溶液兩次,分別在10日齡和30日齡,500羽/瓶,連用2天。直至出欄未有病毒病發生。在36日齡剖檢驗證,脾臟發育較大、鮮亮、無壞死斑駁;胸腺和法氏囊發育較大,成粉紅色。

(3)威海蓬萊某養殖場張老板,有多年的肉雞飼養管理經驗,據他反應,21日齡是整個養殖過程中的關鍵時期,疫苗免疫成功,皆大歡喜;如果免疫失敗,雞群出現呼吸道副反應,導致抵抗力下降,再繼發其他細菌感染,30日齡后的免疫空白期感染其他病毒病,損失不可估量。所以,每次養雞到21天時,張老板都是心驚膽戰,糾結于是否要進行二次免疫新城疫。

今年9月份,張老板再次補欄時,用了脾源轉移因子藍盾,二免新城疫時配合疫苗和替代疫苗使用:配合疫苗使用,可以減少由于應激引起的的呼吸道副反應;替代疫苗使用,免疫前若雞群出現輕微呼吸道癥狀時,用轉移因子替代疫苗。

在場里隨機選出兩個棚做對比試驗。一個棚在1、2、3日齡育雛壯苗,21日齡配合疫苗,30日齡預防病毒病三個階段分別使用藍盾;一個棚按原有正常的程序飼養。結果42日齡回訪時,用轉移因子的一棚已經成功提前兩天出欄,沒有用轉移因子的一棚由于21日齡免疫后出現了呼吸道副反應,導致后期感染H9、大腸桿菌,傷亡將近10%,損失不可估量。

關于本文
本文標題:一種轉移因子的制備方法.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6952174.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大