鬼佬大哥大
  • / 10
  • 下載費用:30 金幣  

酶法水解酪蛋白的方法及水解產物.pdf

關 鍵 詞:
水解 蛋白 方法 產物
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201010268478.4

申請日:

20100830

公開號:

CN102379359A

公開日:

20120321

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A23J3/10,A23J3/34 主分類號: A23J3/10,A23J3/34
申請人: 內蒙古伊利實業集團股份有限公司
發明人: 王彩云,云戰友,石丹,荊瑩
地址: 010110 內蒙古自治區呼和浩特市金山開發區金山大道1號
優先權: CN201010268478A
專利代理機構: 北京三友知識產權代理有限公司 代理人: 韓蕾
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201010268478.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種酶法水解酪蛋白的方法,其中是利用復合酶技術水解酪蛋白降低其過敏原含量,所述的方法包括步驟:將欲進行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液,先添加堿性蛋白酶進行水解,然后再添加胰蛋白酶進行水解,控制最終水解產物的水解程度為10%~20%。本發明還提供了按照所述的方法制備得到的酪蛋白水解產物。按照本發明的方法所得酪蛋白水解產物中分子量在180~1000Dal的寡肽含量為50~90%,該水解產物吸收性好,且過敏原含量低,與原料相比過敏原含量降低99%以上。

權利要求書

1.一種酶法水解酪蛋白的方法,該方法包括步驟:將欲進行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液,先添加堿性蛋白酶進行水解,然后再添加胰蛋白酶進行水解,控制最終水解產物的水解程度為10%~20%。2.根據權利要求1所述的方法,其中,堿性蛋白酶和胰蛋白酶的總添加量為10000~20000U/100mL。3.根據權利要求1或2所述的方法,其中,堿性蛋白酶與胰蛋白酶的添加比例為9~0.5∶1。4.根據權利要求1所述的方法,其中,所述酪蛋白溶液的濃度為5%~12%。5.根據權利要求1所述的方法,其中,先添加堿性蛋白酶進行水解,當水解程度為5%~10%時,再添加胰蛋白酶進行水解。6.根據權利要求1所述的方法,其中,水解初始pH值8.0~10.0,先添加堿性蛋白酶50℃~60℃進行水解1~4小時,然后再添加胰蛋白酶50℃~60℃進行水解1~4小時,且控制水解時間共2~5小時。7.根據權利要求1所述的方法,該方法還包括熱滅活蛋白酶以終止水解的步驟;所述滅活溫度80℃~98℃,時間5min~15min。8.根據權利要求1所述的方法,該方法包括步驟:將酪蛋白溶解,配制5%~12%的酪蛋白溶液;將酪蛋白溶液的pH值調節到8.0~10.0;在50℃~60℃條件下,于酪蛋白溶液中添加堿性蛋白酶進行水解1~4小時,待水解度達到5%~10%時,再向酶解液中添加胰蛋白酶進行復合酶水解1~4小時;當水解度達到要求時,熱滅活蛋白酶,滅活溫度為80℃~98℃,時間5min~15min。9.一種酪蛋白水解產物,其是按照權利要求1~8中任意一項所述酶法水解酪蛋白的方法得到的水解產物。10.根據權利要求9所述的酪蛋白水解產物,該水解產物中分子量大于5000Dal的肽<2%,分子量180~1000Dal的寡肽含量在50%~90%,分子量小于180Dal的游離氨基酸<5%;過敏原含量與酪蛋白原料相比降低至少99%。

說明書

技術領域

本發明是關于一種酶法水解酪蛋白的方法及水解產物,具體是關于一種利用復合酶技術水解酪蛋白以降低其過敏原含量的方法,以及根據該方法制備得到的水解產物。

背景技術

牛乳是優秀的營養食品,蛋白含量為3.0%~3.5%,其中酪蛋白(CN)含量較高,約占總蛋白的80%。酪蛋白主要有αs、β-、κ-CN,牛乳中酪蛋白與乳清蛋白的含量比為80∶20,而人乳中酪蛋白與乳清蛋白的含量比為60∶40,且人乳中不含αs-CN。由于牛乳與人乳中的蛋白組成不同,有很多人飲用了牛乳后會引起消化不良,甚至會產生過敏現象。

眾所周知,自然界的蛋白質大多是由一條或者多條多肽鏈組成的,有的再與其它物質結合形成復合形式的蛋白質。在動物體的消化過程中,通過消化道中不同的蛋白水解酶將其分解成肽和氨基酸。肽的分子量一般在10000以下,分子量段在5000~10000之間的稱為大肽,分子量段在1000~180之間的稱為小肽、寡肽、低聚肽或稱為小分子活性多肽。從消化吸收的角度考慮,理想的酶解產物以寡肽含量較多為宜,即目標產物是分子量在1000~180的肽。

最早的嬰兒抗過敏食品是以乳酪蛋白為蛋白源,通過酶的處理將其水解為分子量在1000以下的肽和氨基酸的混合物,但是由于酶法水解過程很難按照人的設計去發展,酶解時并不是按照從大到小的順序去切割蛋白,所以有的水解物中有時游離氨基酸很高,而寡肽的含量卻很少。此外,研究表明,過敏原含量高低與分子量的大小并沒有直接的關系,并非分子量越小,過敏原含量就低。

目前在酶法水解酪蛋白的研究中,可以通過選擇合適的蛋白酶、控制酶解工藝條件等措施來實現不同的目的,比如降低水解產物的致敏性,獲得目標功能性肽等,使水解產物具有所期望的性能及組成。

CN1011008027A公開了一種利用堿性蛋白酶對牛乳酪蛋白進行水解制備磷酸肽和非磷酸肽的方法,以獲得功能性原料;CN1566152A公開了一種利用胰蛋白酶水解酪蛋白制備多種功能活性肽的方法;CN1105818A公開了一種利用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶復合水解乳蛋白降低其抗原含量的方法,該方法水解底物為乳清蛋白和酪蛋白混合物,其中乳清蛋白占到50%以上。

孫浩等人在“堿性蛋白酶對酪蛋白水解的最適宜條件”(《大連輕工業學報》,2003,Vol.22,No.1)中公開了以Folin-酚法測定OD值間接表征水解度,優化出堿性蛋白酶水解酪蛋白最優工藝條件為:水解溫度55℃,pH值為8.0,酪蛋白底物濃度為6%,堿性蛋白酶與酪蛋白最適質量比為7%;但是該正交實驗結果中并沒有包含最優方案,且未對其水解結果及水解物特征進行詳細描述。

孔芳等人對枯草桿菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的條件進行了研究(“枯草桿菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的條件研究”,《湖南農業科學》,2009,No.6),枯草桿菌堿性蛋白酶(Alacalase)是一種堿性內切酶,能較專一切斷由芳香族氨基酸形成的肽鍵,而使芳香族氨基酸游離于肽鏈的末端。孔芳等人的研究是以水解度為指標得出水解優化工藝,并未描述其得到的水解產物的特性。

唐寧等人采用胃蛋白酶、胰蛋白酶對嬰兒配方奶粉進行水解,通過動物實驗得出經過水解的樣品對小鼠的致敏作用均有所降低(“牛奶大分子蛋白的水解及其過敏原含量變化”,《中國臨床藥理學與治療學》,2004年第9卷第12期);張嘉芷等采用胰蛋白酶水解法改性酪蛋白的研究中所得酪蛋白分子量分布與乳清蛋白接近,因此可推斷其寡肽含量并未達到50%(“酶法改性酪蛋白及嬰兒配方乳粉的研究”,《食品工業科技》,1997年第2期)。

可以看出,目前酶解酪蛋白的研究主要集中在獲得功能性活性肽以及獲得較好的消化吸收效果等方面,而在深度水解酪蛋白并最大限度地降低其過敏原含量方面效果并不顯著。在現有的酶法水解蛋白的過程中,除非采用膜濾的方法除掉水解物中部分游離氨基酸或者除掉部分大分子未水解的部分來達到低分子量物質含量高、游離氨基酸含量低的效果,其他的方法很難平衡以下幾項:1、水解度適中;2、寡肽含量高,吸收性好;3、過敏原含量低,致敏性低;4、游離氨基酸含量低,滲透壓低。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種酶法水解酪蛋白的方法,以使水解產物寡肽的含量較多,游離氨基酸含量較低,易于消化吸收,并最大限度地降低了過敏原含量。

本發明的另一目的在于提供一種酶法水解酪蛋白的水解產物,其中寡肽含量高、易于消化吸收,且具有低致敏性。

一方面,本發明提供了一種酶法水解酪蛋白的方法,主要利用堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合使用,在保證最低的酶用量的前提下,可對酪蛋白進行深度水解,并最大限度地降低了水解產物中過敏原含量,使水解產物與未被水解的酪蛋白原料相比過敏原含量降低了99%以上。

本發明所提供的酶法水解酪蛋白的方法,主要包括步驟:將欲進行酶解的酪蛋白溶解成酪蛋白溶液,先添加堿性蛋白酶進行水解,然后再添加胰蛋白酶進行水解,控制最終水解產物的水解程度為10%~20%。

本發明中所用酪蛋白可以是通過本領域已知的方法得到的食品級酪蛋白,如酶凝酪蛋白、酸凝酪蛋白等。在本發明優選的實施方案中,可利用水,也可以利用緩沖溶液,優選利用緩沖溶液將酪蛋白溶解為5%~12%(w/w,按總固形物的含量計算)的蛋白溶液進行酶解,優選的酪蛋白溶液的濃度為8%~10%(除特別注明外,本發明中所述含量與比例均為重量含量與比例)。

根據本發明的具體實施方案,本發明是采用微生物蛋白酶對酪蛋白進行水解,更具體地,所述蛋白酶包括:堿性蛋白酶和胰蛋白酶。這些蛋白酶均可商購獲得。

在確定所用蛋白酶之后,適合蛋白酶水解的pH值范圍即可獲知。本發明中即可將欲進行酶解的酪蛋白溶液的pH值調節到適合所用蛋白酶水解的值,適合堿性蛋白酶水解的pH值為8~10。調節pH值的調節劑可以采用所屬領域中常用的調節劑,如NaOH溶液、HCl溶液等。

將酪蛋白溶液調節至適合酶解的溫度,即可加入蛋白酶進行酶解。本發明中優選的酶解溫度為50℃~60℃。

向酪蛋白水溶液中加入的蛋白酶的量一般根據所用酶的活性和酪蛋白溶液的性狀來確定。本發明中,蛋白酶的活性以U(Unit)表示。一個U表示在最佳條件下,單位時間內(每分鐘)水解酪蛋白釋放出1g酪氨酸所需要的酶量。根據本發明的具體實施方案,復合蛋白酶的總添加量為每100mL酪蛋白溶液中添加酶活單位為10000~20000U,優選的實施方案中,添加的復合酶為12000~15000U/100mL酪蛋白溶液。

根據本發明的具體實施方案,本發明的方法中是采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶依次添加進行水解,具體是先用堿性蛋白酶進行第一階段水解,而后加入胰蛋白酶共同進行第二階段水解。發明人在研究中發現,本發明所加入的復合酶中,堿性蛋白酶添加量及水解時間占優勢的情況下,酪蛋白溶液的抗原含量降低的更為顯著,同時水解后寡肽的含量也更多,利于消化吸收。根據本發明的優選實施方案,本發明中,堿性蛋白酶與胰蛋白酶的添加比例為9~0.5∶1(以酶活單位計),優選為9~1∶1,更優選為8~1∶1。本發明中,胰蛋白酶的添加可以縮短整個酶解反應時間,并有利于控制水解度在適中的范圍內。本發明以堿性蛋白酶和胰蛋白酶單酶水解酪蛋白試驗結果為依據,以水解度作為第二階段胰蛋白酶的添加標準,發現當堿性蛋白酶水解酪蛋白水解度控制在5%~10%左右時,再添加胰蛋白酶共同水解,此時水解效果最佳,抗原含量與酪蛋白原料相比降低了99%以上,并且酶添加量最少。本發明最終控制水解度在10%~20%左右(最終水解度大于堿性蛋白酶單獨水解階段的水解度)時,終止整個酶解過程。本發明在具體實施時,是先添加堿性蛋白酶50℃~60℃進行水解1~4小時(達到水解度5%~10%的要求),然后再添加胰蛋白酶50℃~60℃進一步水解1~4小時(達到水解度10%~20%的要求),且控制兩個階段水解時間共2~5小時。

根據本發明的具體實施方案,復合蛋白酶優選控制水解度達到10%~20%時,熱滅活蛋白酶,終止酶解的進行。本發明中具體的熱滅活溫度為可控制為80℃~98℃,優選為85℃~95℃;熱滅活時間5min~15min,優選為5min~10min。

滅活后迅速冷卻到室溫,即得到本發明的水解產物溶液,可將該水解產物溶液按照本領域的常規操作例如通過納濾膜進行脫鹽處理,最后通過噴霧干燥技術將水解產物制成水解粉的形式。

本發明中,采用高效液相色譜法對水解產物的分子量分布進行了測定。本發明的酪蛋白水解產物,其中分子量180~1000Dal的寡肽含量為50%~90%,游離氨基酸含量<5%,本發明的水解產物易于消化吸收。

本發明中,水解產物的剩余抗原含量用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)確定。將未被水解的酪蛋白與特異性抗體結合,其濃度落入該試驗中確定的線性劑量-反應范圍內;水解產物制劑也類似的被結合,后續用酶標記物結合固定好的酪蛋白,添加TMB底物,根據顏色變化來判斷是否有抗原性可識別的酪蛋白存在。以質量為基礎將用水解產物得到的結果與用未被水解的酪蛋白原料得到的結果進行比較,然后計算水解產物的抗原性降低百分比。本發明水解產物的過敏原含量降低99%以上。在使水解產物具有良好吸收性的同時使其抗原性顯著降低正是本發明的優點之一。

另一方面,本發明還提供了一種酪蛋白水解產物,其是按照本發明所述酶法水解酪蛋白的方法得到的水解產物。

根據本發明的具體實施方案,本發明的酪蛋白水解產物中,分子量大于5000Dal的肽<2%,分子量180~1000Dal的寡肽含量在50%~90%,分子量小于180Dal的游離氨基酸<5%;過敏原含量與酪蛋白原料相比降低至少99%。

綜上所述,利用本發明的酶解方法,可使水解產物同時實現水解度適中,寡肽含量高,游離氨基酸低,致敏性低,易于消化吸收。

具體實施方式

本以下通過具體實施例詳細說明本發明的技術及特點,旨在幫助閱讀者更好地理解本發明的技術實質和所能產生的有益效果,不能理解為對本發明實施范圍的限定。

實施例1

將酪蛋白用水溶解配制成8%的酪蛋白溶液,并用氫氧化鈉將pH值調至8.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為9000U/100mL酪蛋白溶液,在50℃下水解1.0h后,水解度達到6.98%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為1000U/100mL酪蛋白溶液,在50℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解1.0h,然后在95℃水浴滅酶活10min,制得本實施例的水解物。

對本實施例的水解物進行分析得出:最終水解度達到11.23%,抗原含量由577663ppm降低到2835ppm,過敏原含量與酪蛋白原料相比降低99%以上;水解物分子量分布結果如表1。

表1??酶解產物的分子量分布

實施例2

將酪蛋白用水溶解配制成10%的酪蛋白溶液,并將pH值調至8.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為14400U/100mL酪蛋白溶液,在60℃下水解2.0h后,水解度達到6.12%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為3600U/100mL酪蛋白溶液,在60℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解1.0h,然后在98℃水浴滅酶活10min,制得本實施例的水解物。

對水解物分析得出:水解度為13.37%,抗原含量由721913ppm降低到3533.1ppm;水解物分子量分布結果如表2。

表2??酶解產物的分子量分布

實施例3

將酪蛋白用磷酸鹽緩沖液溶解配制成8%的酪蛋白溶液,并將pH值調至9.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為9100U/100mL酪蛋白溶液,在55℃下水解3.5h后,水解度達到9.89%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為3900U/100mL酪蛋白溶液,在55℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解1.0h,然后在98℃水浴滅酶活10min,制得本實施例的水解物。

對水解物分析得出:水解度達到18.81%,抗原含量由577663ppm降低到1064.2ppm;水解物分子量分布結果如表3。

表3??酶解產物的分子量分布

實施例4

將酪蛋白用水溶解配制成5%的酪蛋白溶液,并將pH值調至8.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為10500U/100mL酪蛋白溶液,在50℃下水解3.5h后,水解度達到8.21%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為4500U/100mL酪蛋白溶液,在50℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解1.5h,然后在98℃水浴滅酶活10min,制得本實施例的水解物。

對水解物分析結果如下:水解度達到15.67%,抗原含量由358076ppm降低到1271.9ppm;水解物分子量分布結果如表4。

表4??分子量分布結果

實施例5

將酪蛋白用水溶解配制成12%的酪蛋白溶液,并將pH值調至8.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為12000U/100mL酪蛋白溶液,在55℃下水解2.0h后,水解度達到8.97%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為8000U/100mL酪蛋白溶液,在55℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解1.5h,然后在95℃水浴滅酶活10min,制得本實施例的水解物。

對水解物進行分析結果如下:水解度達到16.79%,抗原含量從854029ppm下降到3280.1ppm;肽分子量分布如表5。

表5??分子量分布結果

實施例6

將酪蛋白用水溶解配制成6%的酪蛋白溶液,并將pH值調至9.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為7200U/100mL酪蛋白溶液,在60℃下水解1.5h后,水解度達到5.45%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為4800U/100mL酪蛋白溶液,在60℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解1.5h,然后在95℃水浴滅酶活10min,制得本實施例的水解物。

對水解物進行分析結果如下:水解度達到10.23%,抗原含量從430048ppm下降到2265.2ppm;肽分子量分布如表6。

表6??分子量分布結果

實施例7

將酪蛋白用水溶解配制成8%的酪蛋白溶液,并將pH值調至9.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為7000U/100mL酪蛋白溶液,在60℃下水解2.5h后,水解度達到9.17%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為7000U/100mL酪蛋白溶液,在60℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解2h,然后在95℃水浴滅酶活10min,制得本實施例的水解物。

對水解物進行分析結果如下:水解度達到17.56%,抗原含量從577663ppm下降到1163.4ppm;肽分子量分布如表7。

表7??分子量分布結果

實施例8

將酪蛋白用水溶解配制成9%的酪蛋白溶液,并將pH值調至10.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為8500U/100mL酪蛋白溶液,在60℃下水解4h后,水解度達到7.86%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為8500U/100mL酪蛋白溶液,在60℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解1h,然后在95℃水浴滅酶活10min,制得本實施例的水解物。

對水解物進行分析結果如下:水解度達到14.98%,抗原含量從639871ppm下降到1931.5ppm;肽分子量分布如表8。

表8??分子量分布結果

從以上實施例1~8的過敏原含量降低情況來看,利用本發明的方法酶解酪蛋白溶液,過敏原含量可以降低到酪蛋白原料的99%以上,過敏原含量降低十分顯著。

對比例1:復合蛋白酶水解試驗結果

將酪蛋白用水溶解配制成8%的酪蛋白溶液,并將pH值調至9.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶,堿性蛋白酶和胰蛋白酶的添加量分別為7000U/100mL酪蛋白溶液,在60℃下水解4.5h,然后在95℃水浴滅酶活10min,制得本對比例的水解物。

對該水解物進行檢測,水解度為5.57%,抗原含量從577663ppm下降到70993.7ppm。

對比例2

將酪蛋白用水溶解配制成9%的酪蛋白溶液,并將pH值調至10.0;向上述酪蛋白溶液中加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶的添加量為3400U/100mL酪蛋白溶液,在60℃下水解4h后,水解度達到6.79%;然后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶添加量為13600U/100mL酪蛋白溶液,在60℃、胰蛋白酶與先前添加的堿性蛋白酶共同作用下繼續水解1h,然后在95℃水浴滅酶活10min,制得本對比例的水解物。

對該水解物進行檢測,水解度為10.23%,抗原含量從639871ppm下降到41950.0ppm。

對比例3

將酪蛋白用水溶解配制成12%的酪蛋白溶液,并將pH值調至8.0;向上述酪蛋白溶液中加入胰蛋白酶,胰蛋白酶的添加量為12000U/100mL酪蛋白溶液,在55℃下水解2.0h后,水解度達到4.31%;然后加入堿性蛋白酶,堿性蛋白酶添加量為8000U/100mL酪蛋白溶液,在55℃、堿性蛋白酶與先前添加的胰蛋白酶共同作用下繼續水解1.5h,然后在95℃水浴滅酶活10min,制得本對比例的水解物。

對該水解物進行檢測,水解度為8.51%,抗原含量從854029ppm下降到47509.2ppm。

關于本文
本文標題:酶法水解酪蛋白的方法及水解產物.pdf
鏈接地址:http://www.wwszu.club/p-6952557.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
鬼佬大哥大