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ERYNGIOLIDEA在治療急性痛風藥物中的應用.pdf

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ERYNGIOLIDEA 治療 急性 痛風 藥物 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201210411765.5

申請日:

20121025

公開號:

CN103768049A

公開日:

20140507

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/365,A61P19/06 主分類號: A61K31/365,A61P19/06
申請人: 南京大學
發明人: 黃蓉,龔霞,馮怡,吳俊華
地址: 210093 江蘇省南京市漢口路22號
優先權: CN201210411765A
專利代理機構: 江蘇銀創律師事務所 代理人: 何震花
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210411765.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了EryngiolideA在醫學中的新用途,具體地說是EryngiolideA在制備治療急性痛風藥物中的應用。經實驗研究結果表明EryngiolideA對尿酸鹽致人血管內皮細胞損傷的急性痛風模型具有保護作用,并抑制ICAM-1表達,因此,EryngiolideA可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。本發明涉及的EryngiolideA在制備治療急性痛風藥物中的用途屬于首次公開,由于骨架類型屬于全新的骨架類型,而且其對于急性痛風的防治活性強得意想不到,不存在由其他化合物給出任何啟示的可能,具備突出的實質性特點,同時用于急性痛風的防治顯然具有顯著的進步。

權利要求書

1.Eryngiolide?A在治療急性痛風藥物中的應用,所述化合物Eryngiolide?A結構如所示:

說明書

技術領域

本發明涉及Eryngiolide?A在醫學中的新用途,具體地說是涉及Eryngiolide?A在制備治療急性痛風藥物中的應用。?

背景技術

痛風(gouty),又稱痛風性關節炎(gouty?arthritis),是體內嘌呤代謝紊亂所致的疾病,表現為血中尿酸過多,易于使尿酸鹽(MSU)在關節等組織析出結晶。痛風的急性發作是由于沉積在關節的MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應。?

西藥在痛風急性發作期選用三種藥:秋水仙堿、非甾體抗炎藥和腎上腺皮質激素。秋水仙堿的作用機制是與中性粒細胞的微管蛋白結合,從而妨礙粒細胞的活動,抑制粒細胞浸潤。非甾體抗炎藥如吲哚美辛,抑制環氧酶(COX)活性而發揮抗炎作用,以及選擇性COX2抑制藥。它們雖然消炎止痛作用快,但毒副作用也相當明顯,如秋水仙堿的有效劑量與產生腹瀉等胃腸道癥狀的劑量相近,非甾體抗炎藥在有活動性消化性潰瘍、胃腸道出血情況下絕對禁用,而保泰松用藥短至3周也可致嚴重的粒細胞減少癥或再生障礙性貧血。?

本發明涉及的化合物Eryngiolide?A是一個2012年發表(Wang,?S.?J.?et?al.,?2012.?Eryngiolide?A,?a?Cytotoxic?Macrocyclic?Diterpenoid?with?an?Unusual?Cyclododecane?Core?Skeleton?Produced?by?the?Edible?Mushroom?Pleurotus?eryngii.?Organic?Letters?14?(14),?3672–3675.)的新骨架化合物,該化合物擁有全新的骨架類型,目前的用途僅僅涉及癌細胞的細胞毒活性(Wang,?S.?J.?et?al.,?2012.?Eryngiolide?A,?a?Cytotoxic?Macrocyclic?Diterpenoid?with?an?Unusual?Cyclododecane?Core?Skeleton?Produced?by?the?Edible?Mushroom?Pleurotus?eryngii.?Organic?Letters?14?(14),?3672–3675.),對于本發明涉及的Eryngiolide?A在制備治療急性痛風藥物中的用途屬于首次公開,由于骨架類型屬于全新的骨架類型,而且其對于急性痛風的防治活性強得意想不到,不存在由其他化合物給出任何啟示的可能,具備突出的實質性特點,同時用于急性痛風的防治顯然具有顯著的進步。?

發明內容

本發明用MSU致人血管內皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示,對MSU致HUVEC損傷具有保護作用,并抑制ICAM-1表達,可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。?本發明的目的在于提供Eryngiolide?A在醫學中的新用途,具體地說是涉及Eryngiolide?A在制備治療急性痛風藥物中的應用。?

本發明的目的是通過以下的技術方案來實現的:?

現代醫學病理研究說明,痛風性關節炎是MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應,急性痛風產生的本質是中性粒細胞(PMN)-血管內皮細胞(HUVEC)黏連增強(Terkeltaub?R,et?al.?The?murine?homolog?of?the?interleukin-8?receptorcxcr-2?is?essential?for?the?occurrence?of?neutrophilic?inflammation?in?air?pouch?model?of?acute?urate?crystal-induced?gouty?synovitis.Arthritis?Rheum,1998,41(5):?900-909.),HUVEC損傷,其分子生物學基礎在于PMN與HUVEC表面黏附分子的相互作用(FujiwaraY,et?al.Interleukin-8?stimulates?leukocyte?migration?across?amonolayer?of?cultured?rabbit?NF-α,IL-1β,IL-8,and?IL-1?rain?Monosodium?Urate?Crystal?induced?rabbit?arthritis.?Labinvest,19998,78(5):?559-569.),其中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)與粘附功能關系最密切,是急性痛風炎癥的重要指標之一(張春,唐怡,劉軍,等.?痛風靈方對尿酸鈉致大鼠模型關節軟組織ICAM-1表達的影響,重慶醫學,2002,31(12):1211-1213.)。?

因此,針對急性痛風MSU致HUVEC損傷,ICAM-1表達增多的病理特征,本發明用MSU致HUVEC損傷的體外急性痛風模型(楊妍華,尹蓮,王明艷,等.尿酸鈉誘導HUVEC損傷的急性痛風模型研究,中華中醫藥學刊,2010,28(3):592-594.),評價Eryngiolide?A抗急性痛風炎癥活性。MSU致人血管內皮細胞(HUVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示,對MSU致HUVEC損傷具有保護作用,并抑制ICAM-1表達。?

所述化合物Eryngiolide?A結構如式(Ⅰ)所示:?

有益效果?

研究結果表明,用MSU致HUVEC損傷的急性痛風模型評價顯示,Eryngiolide?A可保護MSU致HUVEC損傷,減少細胞凋亡,提高細胞活性,抑制ICAM-1表達,具有抗急性痛風炎癥的活性,Eryngiolide?A可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。?

本發明涉及的Eryngiolide?A在制備治療急性痛風藥物中的用途屬于首次公開,由于骨架類型屬于全新的骨架類型,而且其對于急性痛風的防治活性強得意想不到,不存在由其他化合物給出任何啟示的可能,具備突出的實質性特點,同時用于急性痛風的防治顯然具有顯著的進步。?

具體實施方式

?本發明所涉及化合物Eryngiolide?A的制備方法參見文獻(Wang,?S.?J.?et?al.,?2012.?Eryngiolide?A,?a?Cytotoxic?Macrocyclic?Diterpenoid?with?an?Unusual?Cyclododecane?Core?Skeleton?Produced?by?the?Edible?Mushroom?Pleurotus?eryngii.?Organic?Letters?14?(14),?3672–3675.)。?

以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明,但本發明的保護范圍不受具體實施例的?任何限制,而是由權利要求加以限定。?

實施例1:本發明所涉及化合物Eryngiolide?A片劑的制備:?

取20克化合物Eryngiolide?A,加入制備片劑的常規輔料180克,混勻,常規壓片機制成1000片。?

實施例2:本發明所涉及化合物Eryngiolide?A膠囊劑的制備:?

取20克化合物Eryngiolide?A,加入制備膠囊劑的常規輔料如淀粉180克,混勻,裝膠囊制成1000片。?

下面通過藥效學實驗來進一步說明其藥物活性。?

Eryngiolide?A抗急性痛風炎癥實驗:?

1?溶液配制?

5g尿酸加1000ml蒸餾水煮沸,加5%NaOH溶液調PH?7.4,攪拌,冷卻析晶制成尿酸鈉結晶(MSU)。將制好的MSU?10mg高壓滅菌,加不含血清的DMEM培養液10ml,研磨配成1mg/ml的DMEM溶液。實驗時,此溶液再加DMEM培養液配成不同濃度DMEM的MSU溶液。?

Eryngiolide?A?2.5mg,用二甲基亞砜(DMSO)溶解,DMSO終濃度<0.02%,再加無血清的DMEM培養液,配制成濃度2.5ug/ml、25ug/ml、250ug/ml。?

陽性藥吲哚美辛2.0mg,方法同Eryngiolide?A,配制濃度20ug/ml。?

2?血管內皮細胞的體外培養?

人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC株由南京中醫藥大學基礎醫學院提供,細胞經支原體檢測,無支原體污染,細胞經0.25%胰蛋白酶消化,含10%小牛血清的DMEM培養液中和,離心(1000r/min×6min),去上清液,加含10%小牛血清的DMEM培養液,移入細胞培養瓶中,放37℃、5%CO2培養箱中傳代培養。?

3?對MSU刺激HUVEC活力的影響?

HUVEC在培養瓶中培養,待生長至70%~80%融合時,以0.25%胰蛋白酶消化、離心,10%小牛血清DMEM培養液洗滌3次,用10%小牛血清DMEM培養液調成4×104/ml細胞懸液,植入96孔板(每孔200ul),培養24小時后輕吸出原培養液,進行以下實驗,每組各8孔,具體分組及加液如下:對照組(200ulDMEM培養液)、模型組(100ug/ml?MSU溶液)、?干預A組(100ug/ml?MSU溶液+2.5ug/ml?Eryngiolide?A)、干預B組(100ug/ml?MSU溶液+25ug/ml?Eryngiolide?A)、干預C組(100ug/ml?MSU溶液+250ug/ml?Eryngiolide?A),加液后繼續放37℃、5%CO2培養箱中培養24小時,收集上清液,剩余的HUVEC用于測定細胞活性,每孔再加5mg/ml?MTT液20ul,繼續放37℃、5%CO2培養箱中培養4小時后,棄MTT液,加入二甲基亞砜200ul溶解,震蕩,于酶標儀讀取吸光度值,波長490nm。?

陽性藥組加液(100ug/ml?MSU溶液+20ug/ml吲哚美辛),其他方法同上。?

數據統計學處理,細胞活力(%)=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%,結果見表1。?

與對照組相比,模型組細胞活力顯著減小(P<0.01,P<0.05),陽性藥吲哚美辛及Eryngiolide?A干預后細胞活力顯著提高(P<0.01,P<0.05),并強于對照組,其中,Eryngiolide?A各濃度組的細胞活力強于陽性藥吲哚美辛。?

表1??Eryngiolide?A對MSU刺激的血管內皮細胞活力的影響(?)?

注:與模型組相比,**P<0.01;與對照組相比,△△P<0.01,△P<0.05?

4?對ICAM-1表達影響?

將處于對數生長期的HUVEC用0.25%的胰蛋白酶消化,輕輕吹打,制成細胞懸液,調整細胞密度為5×109/L,接種于細胞培養瓶中。待細胞長滿后(約24h),棄去上清液,分為下列組:對照組、模型組(100ug/ml?MSU溶液)、Eryngiolide?A組(100ug/ml?MSU溶液+25ug/ml?Eryngiolide?A),繼續培養24小時,PBS收集細胞,離心去上清,加入CD54單克隆抗體,30min后,PBS洗滌,重懸細胞,應用流式細胞儀檢測其陽性細胞百分率(n=10000),重復3次,結果見表2。?

表2??Eryngiolide?A對MSU刺激的血管內皮細胞ICAM-1表達的影響(?)?

注:與模型組相比,**P<0.01;與對照組相比,△△P<0.01,△P<0.05?

結果顯示,空白組HUVEC幾乎無ICAM-1表達,模型組ICAM-1的表達最高,與模型組相比,Eryngiolide?A對ICAM-1的表達有較強的抑制作用。?

結論:用MSU致HUVEC損傷的急性痛風模型評價顯示,Eryngiolide?A可保護MSU致HUVEC損傷,減少細胞凋亡,提高細胞活性,抑制ICAM-1表達,具有抗急性痛風炎癥的活性,Eryngiolide?A可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。?

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