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活化白血球調節上清液以及用于傷口愈合的用途.pdf

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活化 白血球 調節 上清液 以及 用于 傷口 愈合 用途
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摘要
申請專利號:

CN201180043457.5

申請日:

20110908

公開號:

CN103209682A

公開日:

20130717

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/00,A61K35/14,A61L15/32,A61P17/02 主分類號: A61K9/00,A61K35/14,A61L15/32,A61P17/02
申請人: 馬克羅柯爾有限公司
發明人: M.施爾文,E.貝恩,M.布比斯,I.吉尼斯
地址: 以色列佩塔提科瓦
優先權: 61/381,296
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 關立新;梁謀
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201180043457.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開治療性活化白血球調節上清液、它們的制備方法,以及使用所述調節上清液來修復傷口或促進傷口愈合的方法。

權利要求書

1.用于治療傷口的大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中如下制備所述ALCS:a)獲得活化白血球;b)使所述活化白血球與孵育培養基接觸以形成孵育組合物;c)在足以提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的溫度和時間下孵育所述孵育組合物;以及d)從所述孵育組合物去除白血球以產生大致上無細胞ALCS活化白血球調節上清液(ALCS)。2.用于治療傷口的大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中所述組合物包含至少約1000pg/mL人IL-8、至少約10-20pg/mL人IL-6,和至少約20pg/mL人TNFα。3.用于治療傷口的大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中如下制備所述ALCS:a)在活化所述白血球的時間和溫度條件下孵育人白血球;b)使所述白血球經受低滲透壓休克;c)以恢復等滲性的量向步驟b)的所述白血球加入鹽溶液,接著從所得溶液中分離所述白血球;d)混合步驟c)的所述白血球與血清以形成孵育組合物;e)在提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的時間和溫度條件下孵育所述組合物;以及f)從e)的所述孵育組合物中分離所述白血球和其它細胞物質以產生大致上無細胞ALCS。4.如權利要求1、2或3中任一項所述的ALCS,其中所述傷口是褥瘡性潰瘍、壓迫性潰瘍、下肢潰瘍、腱炎、深胸骨傷口、手術后傷口、軀體區域的難愈合的手術后傷口、在采集大隱靜脈后的大隱靜脈傷口、靜脈曲張性潰瘍、燒傷、戰場傷口或肛裂。5.如權利要求4所述的ALCS,其中所述下肢潰瘍是在糖尿病患者中。6.如權利要求4所述的ALCS,其中所述傷口是靜脈曲張性潰瘍、壓迫性潰瘍或手術后潰瘍。7.用于抑制傷口開始感染的大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中如下制備所述ALCS:a)獲得活化白血球;b)使所述活化白血球與孵育培養基接觸以形成孵育組合物;c)在足以提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的溫度和時間下孵育所述孵育組合物;以及d)從所述孵育組合物去除白血球以產生大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS)。8.用于抑制傷口開始感染的大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中所述ALCS包含至少約1000pg/mL人IL-8、至少約10-20pg/mL人IL-6,和至少約20pg/mL人TNFα。9.用于抑制傷口開始感染的大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中如下制備所述ALCS:a)在活化所述白血球的時間和溫度條件下孵育人白血球;b)使所述白血球經受低滲透壓休克;c)以恢復等滲性的量向步驟b)的所述白血球加入鹽溶液,接著從所得溶液中分離所述白血球;d)混合步驟c)的所述白血球與血清以形成孵育組合物;e)在提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的時間和溫度條件下孵育所述組合物;以及f)從e)的所述孵育組合物中分離所述白血球和其它細胞物質以產生大致上無細胞ALCS。10.如權利要求7、8或9中任一項所述的ALCS,其中所述傷口是由外傷導致。11.如權利要求10所述的ALCS,其中所述外傷是由手術導致。12.如權利要求1、2、3、7、8或9中任一項所述的ALCS,其中所述ALCS被注入所述傷口中。13.如權利要求1、2、3、7、8或9所述的ALCS,其中所述ALCS被注入包圍所述傷口的組織中。14.如權利要求1、2、3、7、8或9所述的ALCS,其中所述ALCS被涂覆到所述開放性傷口中。15.如權利要求14所述的ALCS,其中所述ALCS經由敷料涂覆于所述開放性傷口。16.如權利要求15所述的ALCS,其中所述敷料是干敷料、障壁敷料或生物活性敷料。17.如權利要求1、2、3、7、8或9中任一項所述的ALCS,其中所述ALCS來源于自體血樣。18.如權利要求1、2、3、7、8或9中任一項所述的ALCS,其中所述ALCS來源于同種異體血樣。19.用于治療傷口的方法,所述方法包括向所述傷口施用大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中如下制備所述ALCS:a)獲得活化白血球;b)使所述活化白血球與孵育培養基接觸以形成孵育組合物;c)在足以提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的溫度和時間下孵育所述孵育組合物;以及d)從所述孵育組合物去除白血球以產生大致上無細胞ALCS活化白血球調節上清液(ALCS)。20.用于治療傷口的方法,所述方法包括向所述傷口施用大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中所述組合物包含至少約1000pg/mL人IL-8、至少約10-20pg/mL人IL-6,和至少約20pg/mL人TNFα。21.用于治療傷口的方法,所述方法包括向所述傷口施用大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中如下制備所述ALCS:a)在活化所述白血球的時間和溫度條件下孵育人白血球;b)使所述白血球經受低滲透壓休克;c)以恢復等滲性的量向步驟b)的所述白血球加入鹽溶液,接著從所得溶液中分離所述白血球;d)混合步驟c)的所述白血球與血清以形成孵育組合物;e)在提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的時間和溫度條件下孵育所述組合物;以及f)從e)的所述孵育組合物中分離所述白血球和其它細胞物質以產生大致上無細胞ALCS。22.如權利要求19、20或21中任一項所述的方法,其中所述傷口是褥瘡性潰瘍、壓迫性潰瘍、下肢潰瘍、腱炎、深胸骨傷口、手術后傷口、軀體區域的難愈合的手術后傷口、在采集大隱靜脈后的大隱靜脈傷口、靜脈曲張性潰瘍、燒傷、戰場傷口或肛裂。23.如權利要求22所述的方法,其中所述下肢潰瘍是在糖尿病患者中。24.如權利要求22所述的方法,其中所述傷口是靜脈曲張性潰瘍、壓迫性潰瘍或手術后潰瘍。25.用于抑制傷口開始感染的方法,所述方法包括向所述傷口施用大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中如下制備所述ALCS:a)獲得活化白血球;b)使所述活化白血球與孵育培養基接觸以形成孵育組合物;c)在足以提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的溫度和時間下孵育所述孵育組合物;以及d)從所述孵育組合物去除白血球以產生大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS)。26.用于抑制傷口開始感染的方法,所述方法包括向所述傷口施用大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中所述ALCS包含至少約1000pg/mL人IL-8、至少約10-20pg/mL人IL-6,和至少約20pg/mL人TNFα。27.用于抑制傷口開始感染的方法,所述方法包括向所述傷口施用大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS),其中如下制備所述ALCS:a)在活化所述白血球的時間和溫度條件下孵育人白血球;b)使所述白血球經受低滲透壓休克;c)以恢復等滲性的量向步驟b)的所述白血球加入鹽溶液,接著從所得溶液中分離所述白血球;d)混合步驟c)的所述白血球與血清以形成孵育組合物;e)在提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的時間和溫度條件下孵育所述組合物;以及f)從e)的所述孵育組合物中分離所述白血球和其它細胞物質以產生大致上無細胞ALCS。28.如權利要求25、26或27中任一項所述的方法,其中所述傷口是由外傷導致。29.如權利要求28所述的方法,其中所述外傷是由手術導致。30.如權利要求19、20、21、25、26或27中任一項所述的方法,其中所述ALCS被注入所述傷口中。31.如權利要求19、20、21、25、26或27中任一項所述的方法,其中所述ALCS被注入包圍所述傷口的組織中。32.如權利要求19、20、21、25、26或27中任一項所述的方法,其中所述ALCS被涂覆到所述開放性傷口中。33.如權利要求32所述的方法,其中所述ALCS經由敷料涂覆于所述開放性傷口。34.如權利要求33所述的方法,其中所述敷料是干敷料、障壁敷料或生物活性敷料。35.如權利要求19、20、21、25、26或27中任一項所述的方法,其中所述ALCS來源于自體血樣。36.如權利要求19、20、21、25、26或27中任一項所述的方法,其中所述ALCS來源于同種異體血樣。37.制備大致上無細胞ALCS活化白血球調節上清液(ALCS)的方法,所述方法包括:a)獲得活化白血球;b)使所述活化白血球與孵育培養基接觸以形成孵育組合物;c)在足以提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的溫度和時間下孵育所述孵育組合物;以及d)從所述孵育組合物去除白血球以產生大致上無細胞ALCS活化白血球調節上清液(ALCS)。38.制備大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS)的方法,所述方法包括以下步驟:a)在活化所述白血球的時間和溫度條件下孵育人白血球;b)使所述白血球經受低滲透壓休克;c)以恢復等滲性的量步驟b)的所述白血球加入鹽溶液,接著從所得溶液中分離所述白血球;d)混合步驟c)的所述白血球與血清以形成孵育組合物;e)在提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的時間和溫度條件下孵育所述孵育組合物;以及f)從e)的所述孵育組合物中分離所述白血球和其它細胞物質以產生大致上無細胞ALCS。39.如權利要求38所述的方法,其中步驟a)的所述孵育在約12℃至約28℃的溫度下發生,持續約8小時至約20小時的時間范圍。40.如權利要求39所述的方法,其中步驟a)的所述孵育在約18℃至約24℃的溫度下發生,持續約8小時至約12小時的時間范圍。41.如權利要求38所述的方法,其中步驟a)的所述孵育在約12℃至約28℃的溫度下發生,持續約90分鐘、超過2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時或12小時至約20小時的時間范圍。42.如權利要求38所述的方法,其中步驟a)的所述孵育在最高約37℃的溫度下發生并且持續5小時至約24小時的時間范圍。43.如權利要求38所述的方法,其中步驟a)在白血球粘著和/或含有包含白血球激動劑或粘著分子的支架的容器中進行。44.如權利要求38所述的方法,其中步驟b)包括使所述白血球與水或低滲鹽溶液接觸約25秒至約45秒。45.如權利要求38所述的方法,其中a)的所述白血球和d)的所述血清獲自同一供體。46.如權利要求38所述的方法,其中a)的所述白血球和d)的所述血清獲自不同供體。47.如權利要求38所述的方法,其中d)的所述血清是通過g)使單獨的人血漿樣本與凝結劑接觸,其中a)的所述血漿和所述白血球可以獲自同一供體或不同供體;和h)去除凝結的固體,其中g)中的所述接觸與a)的所述孵育大致上同時進行。48.如權利要求47所述的方法,其中g)的所述血清在接觸白血球之前冷凍。49.如權利要求47所述的方法,其中所述血漿獲自AB+供體。50.如權利要求47所述的方法,其中所述凝結劑是CaCl2。51.如權利要求37或38所述的方法,其中所述孵育組合物在室溫下持續約8小時至約18小時至72小時的時間。52.如權利要求37或38所述的方法,其中所述孵育組合物在約37℃下孵育約1小時至約5小時的時間。53.如權利要求37或38所述的方法,所述方法進一步包括冷凍、凍干或冷凍干燥所述ALCS。54.如權利要求38所述的方法,所述方法進一步包括i)混合步驟f)的所述白血球與第二血清以形成第二孵育組合物;j)在提高所述孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的時間和溫度條件下孵育所述第二孵育組合物,因而產生所述ALCS的第二樣本;以及k)從j)的所述第二孵育組合物分離所述白血球和其它細胞物質,以便產生所述大致上無細胞ALCS的第二樣本。55.大致上無細胞活化白血球調節上清液,其通過如權利要求37或權利要求38所述的方法產生。56.大致上無細胞活化白血球調節上清液,其包含至少約1000pg/mL人IL-8、至少約10-20pg/mL人IL-6,和至少約20pg/mL人TNFα。57.制品,所述制品包含如權利要求55或56所述的大致上無細胞活化白血球調節上清液以及敷料、支架或基質。58.如權利要求57所述的制品,其中所述敷料是紗布、繃帶、非粘著性網狀物、膜、箔、泡沫或組織粘著劑。59.如權利要求57所述的制品,其中所述敷料是選自以下的保水障壁:糊劑、乳膏、軟膏、非滲透性或半滲透性膜或箔、水狀膠體、水凝膠或其組合。60.如權利要求57所述的制品,其中所述敷料是抗微生物敷料。61.如權利要求57所述的制品,其中所述支架或基質在植入之前是固體。62.如權利要求57所述的制品,其中所述支架或基質是在植入之后固化的凝膠。

說明書

相關申請的交叉引用

本申請要求2010年9月9日提交的臨時申請序列No.61/381,296的權益,所述臨時申請的公開內容以引用的方式并入本文中。

發明背景

傷口愈合過程涉及白細胞的參與,白細胞又名白血球。白血球包括粒細胞、單核細胞和淋巴細胞。不同類型的粒細胞包括嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞。單核細胞分化成巨噬細胞,所述巨噬細胞負責吞噬組織碎片或侵入性外來物質。三種常見淋巴細胞類型為T細胞、B細胞和自然殺傷細胞。T細胞和B細胞在識別身體內抗原中起到重要作用(Parkin,2001)。自然殺傷(NK)細胞通過改變主要組織相容性復合物(MHC)的水平來鑒別受感染細胞,并且破壞受感染細胞(Moretta,2008)。

傷口愈合過程以三個重疊階段發生。(Li,2007;Broughton,2006;Tsirogianni,2006;Singer,1999;Martin,1997)。第一階段為發炎階段。所述發炎階段的特征在于嗜中性粒細胞募集,接著是單核細胞募集到傷口部位,在傷口部位所述嗜中性粒細胞和所述單核細胞殺死并吞噬細菌(Agaiby,1999)。

稱為增殖階段的第二傷口愈合階段涉及形成新肉芽組織。纖維母細胞增殖并遷移到傷口空間中,并且合成膠原蛋白以及細胞外基質的其它組分(Greiling,1997)。同時,發生血管生成,從而向代謝活性新肉芽組織提供養分和氧(Tonnesen,2000)。來自完整表皮的角質細胞開始在臨時基質上遷移并且開始增殖,從而為新上皮組織引路(Kim,1992)。

重塑是傷口愈合中的第三階段以及最終階段。其特征在于纖維母細胞分化成肌纖維母細胞,肌纖維母細胞使傷口邊緣收縮并閉合在一起(Tomasek,2002)。通過降解和再合成來重塑膠原蛋白纖維使傷口通過膠原蛋白纖維再定向來獲得強度(由生長因子密切控制的過程)(Werner,2003)。

白血球在愈合過程的參與在很大程度上與它們的細胞因子和生長因子的產生相關(Keen,2008)。白血球子集的募集由化學引誘物細胞因子(趨化因子)調節,所述化學引誘物細胞因子如為活化并選擇性引導各種白血球子集來到傷口的介白素(IL)-8、生長調節蛋白α(GRO-a)和單核細胞趨化性蛋白-1(MCP-1)(Rossi和Zlotnik,2000)。粒細胞產生蛋白酶并且活性氧中間體巨噬細胞(Macrophage)產生促炎細胞因子和生長因子(Riches,1996)。促炎細胞因子(包括介白素1-α和1-β(IL-1-α和IL-1-β)、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α)在傷口修復的發炎階段和增殖階段都起到重要作用。這些細胞因子還調節免疫反應。血管生成由低氧、氧化氮(NO)、VEGF和纖維母細胞生長因子2(FGF-2)加強(Liekens,2001)。TGF-β通過募集纖維母細胞以及刺激它們的膠原蛋白I、III和V、蛋白聚糖、纖連蛋白和其它ECM組分的合成來促進纖維變性過程。TGF-β同時抑制蛋白酶(C.U.Niesler和M.WJ.Ferguson,2001)。PDGF由血小板以及活化巨噬細胞、內皮細胞和纖維母細胞釋放,其在調節纖維母細胞和平滑肌細胞募集和增殖室中起主要作用(C.H.Heldin和B.Westermark,1999)。類似地,淋巴細胞除為免疫學效應細胞之外還產生生長因子(Blotnik,1994),并且在傷口愈合晚期促進組織重塑。

治療傷口的挑戰經常由患有多種病理(如糖尿病、冠狀動脈病和高血壓)的患者加重。這些疾病因各種生理條件而具有加重血管并發癥的常見作用。傷口引發的并發癥可引起發病率和死亡率提高(Doshi,2008)。

常規傷口治療包括手術清創術、抗生素療法和各種敷料(Moran,2008;Fonder,2008)。對常規治療具有抗性的傷口也稱為難愈合傷口。這些傷口導致生活質量降低并且可導致發病率和死亡率提高。因此,需要持續用于傷口愈合的有效組合物和方法。

發明概述

本發明的一個方面涉及用于制備由活化白血球調節的大致上無細胞上清液(活化白血球調節上清液(“ALCS”))的方法。在一些實施方案中,方法包括以下步驟:a)在活化白血球的時間和溫度條件下(例如在約室溫至約37℃的溫度下持續約90分鐘至約24小時,并且在一些實施方案中在室溫下持續約8小時至約20小時)孵育人白血球(在本文中也稱為第一次孵育);b)使白血球經受低滲透壓休克(例如通過使白血球與生理學上可接受的水溶液(如蒸餾水)接觸來實現);c)以有效恢復等滲性的量向步驟b的白血球中添加生理學上可接受的鹽溶液;d)混合步驟c的白血球與培養基如血清(其可與白血球獲自同一血樣或不同血樣)以形成孵育組合物;e)在調節培養基的時間和溫度條件下孵育組合物,因此產生ALCS(在本文中也稱為第二次孵育);以及f)從e)的孵育組合物分離至少一些白血球和其它細胞物質,以便產生大致上無細胞ALCS。

在另一實施方案中,本發明涉及制備大致上無細胞活化白血球調節上清液(ALCS)的方法,所述方法包括以下步驟:a)在活化白血球的時間和溫度條件下孵育人白血球;b)使白血球經受低滲透壓休克;c)以恢復等滲性的量向步驟b)的白血球中添加鹽溶液,接著從所得溶液分離白血球;d)混合步驟c)白血球與血清以形成孵育組合物;e)在提高孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的時間和溫度條件下孵育所述孵育組合物;以及f)從e)的孵育組合物分離白血球和其它細胞物質,以便產生大致上無細胞ALCS。

在一些實施方案中,步驟a)的孵育在約12℃至約28℃的溫度下發生,持續約8小時至約20小時的時間范圍。在其它實施方案中,步驟a)的孵育在約18℃至約24℃的溫度下發生,持續約8小時至約12小時的時間范圍。在又其它實施方案中,步驟a)的孵育在12℃至約28℃的溫度下發生,持續約90分鐘、超過2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時或12小時至約20小時的時間范圍。在另其它實施方案中,步驟a)的孵育在最高約37℃的溫度下發生并且持續5小時至約24小時的時間范圍。

在一些實施方案中,在白血球粘著和/或含有包含白血球激動劑或粘著分子的支架的容器中進行步驟a)。

在一些實施方案中,步驟b)包括使白血球與水或低滲鹽溶液接觸約25秒至約45秒。

在一些實施方案中,a)的白血球和d)的血清獲自同一供體。在其它實施方案中,a)的白血球和d)的血清獲自不同供體。

在一些實施方案中,如下獲得d)的血清:g)使單獨的人血漿樣本與凝結劑接觸,其中a)的血漿和白血球可獲自同一供體或不同供體,以及h)去除凝結的固體,其中g)中的接觸與a)的孵育大致上同時進行。在某些情況下,g)的血清在接觸白血球之前被冷凍。此外,在某些實施方案中,血漿獲自AB+供體。在某些實施方案中,凝結劑是CaCl2。

在又其它實施方案中,本發明涉及制備大致上無細胞ALCS活化白血球調節上清液(ALCS)的方法,所述方法包括:a)獲得活化白血球;b)使活化白血球與孵育培養基接觸以形成孵育組合物;c)在足以提高孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的溫度和時間下孵育所述孵育組合物;以及d)從孵育組合物去除白血球以產生大致上無細胞ALCS活化白血球調節上清液(ALCS)。

在涉及制備ALCS的方法的任一實施方案中,可在室溫下孵育孵育組合物約8小時至約18小時至72小時的時間。或者,可在約37℃下孵育孵育組合物約1小時至約5小時的時間。

另外,在涉及制備ALCS的方法的任一實施方案中,方法可進一步包括冷凍、凍干或冷凍干燥ALCS。

同樣地,在涉及制備ALCS的方法的任一實施方案中,方法可進一步包括混合在制備第一ALCS后剩余的白血球與第二血清或其它生理學培養基以形成第二孵育組合物;在提高孵育組合物中至少一種細胞因子或生長因子的濃度的時間和溫度條件下孵育第二孵育組合物,因此產生第二ALCS樣本;以及從第二孵育組合物分離白血球和其它細胞物質,以便產生大致上無細胞ALCS的第二樣本。

在利用血清的那些實施方案中,血清可獲自血漿樣本,血漿樣本可獲自已在約37℃下與凝結劑接觸的同一或不同全血樣本(即,來自同一人或不同人)。在一些實施方案中,接觸可在與a)中白血球孵育大致上同時的時間,接著從凝結血漿樣本分離血清。在其它實施方案中,血清或血漿獲自商業性或非盈利性供應商,并且可為新鮮的或者呈存放相容形式,如被冷凍。

在一些實施方案中,由活化白血球調節上清液是在一般介于約1小時至約18小時的范圍內并且在約22℃至約37℃下的時間和溫度條件下進行。

另一方面,本發明涉及通過本發明方法產生的大致上無細胞活化白血球調節上清液。

又一方面,本發明涉及大致上無細胞活化白血球調節上清液,所述上清液包含至少約1000pg/mL人IL-8、至少約10-20pg/mL人IL-6,以及至少約20pg/mL人TNFα。

在其它方面,本發明涉及用于治療傷口的本發明的大致上無細胞活化白血球調節上清液。在一些實施方案中,傷口是褥瘡性潰瘍、壓迫性潰瘍、下肢潰瘍、腱炎、深胸骨傷口、手術后傷口、軀體區域的難愈合的手術后傷口、在采集大隱靜脈后的大隱靜脈傷口、靜脈曲張性潰瘍、燒傷、戰場傷口或肛裂。在一些實施方案中,下肢潰瘍是在糖尿病患者中。在一些實施方案中,傷口是靜脈曲張性潰瘍、壓迫性潰瘍或手術后潰瘍。

在其它方面,本發明涉及任一用于抑制傷口開始感染的本發明的大致上無細胞活化白血球調節上清液。在一些實施方案中,傷口由外傷導致。在某些實施方案中,外傷由手術導致。

本發明的另一方面涉及治療傷口(也稱為促進傷口愈合)的方法,所述方法包括向傷口施用或以其它方式涂覆如本文所述的大致上無細胞活化白血球調節血清(ALCS)(包括通過本文所述的制備方法產生的ALCS),或包含ALCS和敷料、支架或基質的制品。因此,本發明還涉及如本文所述的大致上無細胞ALCS(包括通過本文所述的制備方法產生的ALCS)或包含ALCS和敷料、支架或基質的制品在治療傷口或促進傷口愈合的方法中的用途。

在一些實施方案中,傷口是褥瘡性潰瘍、壓迫性潰瘍、下肢潰瘍、腱炎、深胸骨傷口、手術后傷口、軀體區域的難愈合的手術后傷口、在采集大隱靜脈后的大隱靜脈傷口、靜脈曲張性潰瘍、燒傷、戰場傷口或肛裂。在一些實施方案中,下肢潰瘍是在糖尿病患者中。在一些實施方案中,傷口是靜脈曲張性潰瘍、壓迫性潰瘍或手術后潰瘍。

本發明的另一方面涉及抑制傷口開始感染的方法,所述方法包括向傷口施用或以其它方式涂覆如本文所述的大致上無細胞活化白血球調節血清(ALCS)(包括通過本文所述的制備方法產生的ALCS),或包含ALCS和敷料、支架或基質的制品。因此,本發明還涉及如本文所述的大致上無細胞ALCS(包括通過本文所述的制備方法產生的ALCS)或包含ALCS和敷料、支架或基質的制品在抑制傷口開始感染的方法中的用途。

在一些實施方案中,傷口由外傷導致。在某些實施方案中,外傷由手術導致。

在任一涉及向傷口涂覆本發明ALCS的實施方案中,可將ALCS注入傷口中、注入包圍傷口的組織中、涂覆于開放性傷口或經由敷料涂覆于傷口。另外,在任一涉及向傷口涂覆本發明ALCS的實施方案中,ALCS可來源于自體血樣或來源于同種異體血樣。

在其它方面,本發明針對一種制品,所述制品包含本發明的大致上無細胞活化白血球調節上清液以及敷料、支架或基質。在一些實施方案中,敷料是紗布、繃帶、非粘著性網狀物、膜、箔、泡沫或組織粘著劑。在其它實施方案中,敷料是選自以下的保水障壁:糊劑、乳膏、軟膏、非滲透性或半滲透性膜或箔、水狀膠體、水凝膠或其組合。在其它實施方案中,敷料是抗微生物敷料。

在那些涉及支架或基質的實施方案中,支架或基質在植入之前可為固體。或者,支架或基質可為在植入后固化的凝膠。

本文所用的術語上清液“調節(conditioning)”和“調節上清液”是指細胞因子(至少IL-8)和生長因子濃度大于正常生理學水平并且有效用于傷口愈合的上清液。分離白血球的步驟f)可經由離心或重力沉降進行,所述離心或重力沉降使得白血球以可容易地從液體部分分離的細胞團塊形式聚集,以制備大致上無細胞活化白血球調節上清液的一個實施方案。

本發明提供若干優勢,包括例如有效愈合傷口的組合物,所述組合物含有高濃度細胞因子和生長因子,但大致上無細胞。這種特征允許協調使用麻醉劑與適用于傷口愈合的其它藥物,所述其它藥物可能另外不利地與白血球相互作用。組合物的大致上無細胞性質還進一步降低由免疫細胞(如粒細胞和淋巴細胞)導致的有害副作用的可能性。因此,可使用較高濃度的白血球以調節上清液,從而提高其中生物學上活性激動劑的量。組合物可就起始物質來說在無供體-患者匹配的嚴格準則下制備。組合物受到冷凍或凍干,因此提供較長保存期限和就用途來說的多功能性。舉例來說,一批的一部分可被冷凍并且用于其它施用,因此避免從同一供體獲得額外血液的需要。這種特征還提供較均一并且較安全的產品。此外,在從液體部分去除后,即刻或在短暫存放之后,活化白血球可用以調節新一份血清。因此,方法允許再使用活化白血球來制備其它批調節血清。

附圖簡述

圖1示意性描繪用于產生本發明的ALC組合物的代表性系統的第一部分,所述第一部分包括袋A-C(第1組),其為血液存放袋或容器,其中袋A含有從供體采集的濃縮的紅細胞;袋B含有血漿;并且袋C含有白血球(其從全血初始分離之后形成通常稱為白細胞層(buffy?coat)的層)。

圖2A示意性描繪用于產生本發明的ALC組合物的代表性系統的第二部分,在含RBC的袋A從系統去除并且來自圖1的袋B和袋C與袋1-5(第2組)密接(weld)后,所述第二部分包括7袋之組;并且圖2B展示6袋之組,其可代替圖2A中的袋1-5加以使用。

詳述

血液在本文中定義為全血或任一其構成部分(例如血漿、白血球、血小板或紅細胞)。可存在于本發明ALCS中的可溶性因子的量可低于或高于完全血液中的可溶性因子的量。

本文關于任何并且所有值(包括數值范圍的下端和上端)所用的術語“約”表示任何值都具有+/-0.5%至+/-20%(以及其間的值,例如±1%、±1.5%、±2%、±2.5%、±3%、±3.5%、±4%、±4.5%、±5%、±5.5%、±6%、±6.5%、±7%、±7.5%、±8%、±8.5%、±9%、±9.5%、±10%、±10.5%、±11%、±11.5%、±12%、±12.5%、±13、±13.5%、±14%、±14.5%、±15%、±155%、±16%、±165%、±17%、±175%、±18%、±185%、±19%、±19.5%和±20%)的可接受偏差范圍。

除非上下文另外明確規定,否則本文以及隨附權利要求中所用的單數形式“一個”、“一種”、“或”以及“所述”包括復數指示物。

實踐本發明方法的起始物質可獲自若干來源。全血或其一種或多種組分(例如白血球和血漿)可獲自自體來源或同種異體來源。在本發明的一個實施方案中,從最終將用ALCS治療的患者采集血樣,所述血樣在本文中稱為自體血樣或來源。在來源(即,血液或它的組分)獲自除預定ALCS接受者之外的個體(其稱為同種異體血樣或來源)的實施方案中,這些起始物質可方便地獲自血庫。可通過血庫針對紅細胞抗原的不規則抗體以及可輸血傳播的疾病對樣本進行篩選。更具體來說,篩選可用抗體使用Abbott?PRISM儀器針對以下來進行:B型肝炎、C型肝炎、HIV1/2、HTLV和梅毒(Syphilis)(-HCV;HbsAg;抗HIV1/2O+;以及抗HTLV?I/II)。也可通過分子方法(NAT-核酸測試)針對HIV、HCV和HBV來篩選樣本。分子篩選可使用可商購獲得的儀器配置(例如Chiron的TIGRIS系統)實現。

在那些涉及同種異體來源的實施方案中,樣本可獲自具有相同血型的作為預定ALCS接受者的供體。在其它實施方案中,樣本可獲自具有任何血型的供體,所述任何血型包括不同于預定ALCS接受者的血型。舉例來說,因為白血球在制備ALCS的過程中大致上被去除,所以當使用血漿或血清時,血漿或血清可獲自替代性來源,如具有AB+血液的供體,其為血漿和血清的通用供體。血漿和/或血清可為新鮮的、被存放(例如在1-6℃下存放小于24小時)、被干燥或以其它方式預處理(例如病原體減少的血漿和/或血清和溶劑/清潔劑(SD)處理的血漿和/或血清)。用以制備本發明的一些實施方案的血漿可為新鮮的或存放在1-6℃下小于24小時,或為新鮮冷凍血漿或干燥血漿,或病原體減少的血漿,或溶劑/清潔劑(SD)處理的血漿。白血球可獲自具有任何血型的患者。與來源無關,樣本的所有必需處理都可在無需高度專業化儀器的情況下進行。

現參考圖1和圖2來描述制備本發明的ALCS組合物的示例性實施方案,圖1和圖2說明含有兩組互連無菌袋的系統。密封系統以便不會暴露于外部環境。具體地說,連接兩組的管密接在一起,也即接合,以形成一個使用無菌連接裝置的系統(例如Terumo的-II目錄號ME-203AH)。更具體來說,為確保與無菌性標準的順應性,管的密接和切割是通過通常在約300℃(但無菌性可通過在較低或甚至較高溫度下預熱來有效達到)下預熱特別圓片(wafer)來進行。這種高溫提高密接程序的無菌性。為進一步確保無菌性,密接可在100,000級別容積區域內的100級別生物安全柜(Biological?Safety?Cabinet)中進行。

如這些圖中說明,系統含有兩個無菌袋組。含有袋A、袋B和袋C的第1組是常用于輸血的標準的可商購獲得的三個一組的袋組。經由靜脈穿刺在血庫中采集體積通常為約400ml至約550ml的人血樣,并且放入袋A中,接著使用標準技術分級分離成它的組分部分,裝入袋A、袋B和袋C中。舉例來說,離心含有血樣的袋A。離心之后,例如使用Baxter制造的血液組分提取器來分離血液組分。將含有白血球的白細胞層放入袋C中,血漿放入袋B中并且紅血球保留在袋A中。因此,由于這個過程,因此袋A含有濃縮的紅血球;袋B含有血漿;并且袋C含有白細胞層,所述白細胞層含有白血球(以及可能殘余血漿和紅血球)。或者,血液組分可經由本領域中已知的機采技術(apheresis?technique)從全血分離。

接著使袋A與三袋組斷開。如圖2所說明,接著密接袋B和袋C以定做輸注袋1-5(第2組)以形成用以依次制備活化白血球混懸液和ALCS的系統。如這些實施方案中所述,袋1-5的體積分別是500ml、50ml、50ml、100ml和500ml。如上文所公開,用無菌連接裝置進行密接。

用于白血球的第一次孵育和第二次孵育的袋1含有200ml無菌過濾空氣。如果袋1能透氣,那么不需要氣袋。也可處理或另外改進透氣袋以使它們變得對白血球具有粘著性。舉例來說,袋可含有支架,如粘著性珠粒和/或白血球激動劑,如補體蛋白、干擾素-α、干擾素-γ和介白素-12。白血球對袋表面的粘著性可能益于它們釋放可溶性激動劑的能力。袋可由粘著性塑料或正規塑料制成,所述塑料以如變得粘著的方式處理(電暈放電、液氣等離子體等),或用細胞外基質蛋白涂布或被化學修飾。支架可呈不同形狀,并且具體來說可為生物可降解微珠或生物不可降解微珠。支架或珠粒可為生物可降解或生物不可降解,例如由膠原蛋白或PLA、PGA(聚乳酸、聚乙醇酸)或類似合成聚合物、透明質酸、海藻酸鹽或纖維蛋白密封層制成。珠粒可為合成水凝膠珠粒、明膠珠粒、用粘著受體涂布的珠粒、活化刺激物或刺激性抗體。接著可離心出具有粘著性細胞的支架或珠粒以及所有其它細胞。而且,產品中另外不需要的刺激物將連同支架或珠粒一起消除。

袋2含有溶液(例如20ml緩沖氯化鈉溶液(8.91%NaCl,USP),或任何其它生理學上可接受的含有無機離子、有機滲透物(如蔗糖)的溶液,或一些其組合,如乳酸林格氏(Ringer′s)(哈特曼氏(Hartmann′s))溶液),所述溶液用以使白血球在低滲透壓休克后恢復等滲性。當將氯化鈉溶液加入200ml蒸餾水(在袋5中)中時,其變成0.9%NaCl溶液。袋3含有20ml無菌過濾空氣。袋4含有溶液(例如約60ml緩沖氯化鈣溶液(1.17%CaCl2二水合物,USP),其用于凝結袋B中的血漿,并且幫助分離成血小板和血清。袋5含有約200ml水。

在一個替代實施方案中,可使用圖2B中說明的6袋組來代替圖2A中說明的袋1-5。其它額外的袋幫助維持清潔室制備位置的無菌性。在本發明方法的這個實施方案中,在分離成白細胞層、血漿和RBC后,將如先前所述的白血球從袋C轉移到無菌袋1,并且將血漿放入也無菌的第六袋中,接著使6袋系統從原始三個一組的袋組分離。

所述組被包裝成單一單元并且使用高壓蒸汽滅菌,從而極大降低患者繼發性感染的風險。

接著將白血球從袋C轉移到袋1中,并且在袋維持在垂直或平坦位置時并且在使白血球變活化的活化條件(包括時間和溫度)下孵育。

出于本發明的目的,在本發明的各個方面和實施方案中,“白血球活化”定義為涉及至少一個階段的過程,通過所述階段,細胞(白血球)經歷從靜止狀態到功能活性狀態的過渡,伴隨有生物活性物質的合成或預合成物質(例如細胞因子,如IL-8)從細胞質移位到細胞膜或它們被釋放到細胞外培養基中。

“上清液”是已通過離心、重力沉降、過濾或其它細胞去除方法變得大致上無細胞的細胞外培養基。

出于本發明的目的,在本發明的各個方面和實施方案中,“大致上無細胞”上清液定義為每毫升含有少于約1×106個白血球的上清液。在一些實施方案中,大致上無細胞上清液每毫升含有少于約1×105個、約1×104個、約1×103個、約1×102個或約1×101個白血球。在一些實施方案中,大致上無細胞上清液是檢測不到白血球的上清液。

白血球活體內活化可涉及細胞靠近血管壁遷移并沿血管壁遷移(由P-選擇蛋白(以及CD42b表達提高)介導)、白血球對內皮壁的粘著性提高、散布和外滲(由與內皮配體ICAM-1和ICAM-2相互作用的活化CD11b以較大程度介導);經由與細胞外基質蛋白(例如層粘連蛋白)相互作用遷移到炎癥中心,以及對發炎刺激物的功能反應,如呼吸爆發、脫顆粒、吞噬作用以及釋放細胞因子。

出于本發明的目的,白血球活化由至少一個,但經常是兩個或更多個以下若干指標指示。白血球活化的一個指標是白血球群體(包括粒細胞、單核細胞和淋巴細胞)上活化形式CD11b受體的表達提高,和/或CD62L表達水平較低,CD62L是一種選擇蛋白粘著受體,其從白血球表面脫落,從而促進白血球經由CD11b對內皮細胞的堅固粘著性。在一些實施方案中,白血球也可顯示CD69(一種淋巴細胞特異性活化標記)水平提高、表達血小板標記42B(由于活化粒細胞和單核細胞與白細胞層中殘余血小板之間經由p-選擇蛋白的相互作用),和/或IL-8產量提高。白血球活化的其它標志可包括以下一者或多者的產量提高:蛋白質或多肽、脂質、糖、氧自由基和用作粘著分子的其它生物化學部分、除IL-8外的細胞因子、生長因子、酶、轉錄因子以及細胞信號轉導受體和介質。由未經受孵育的“新鮮白細胞層”(如本文所述)中所含的白血球的觀點來評估這些分子中任一者的改變的表達水平。一旦白血球活化,它們便保持活化,并且如本文所述可達到較高活化水平,例如CD11b表達水平甚至更高;CD69表達水平更高或甚至更高,以及CD62L表達水平甚至更低。另外,白血球一旦活化便可進一步提高它們產生細胞因子(如IL-8、IL-6、TNF-α和VEGF)的能力。實施例中提供指示白血球活化的細胞表面標記和所分泌可溶性因子的其它實例。因此,“活化白血球組合物”是包含顯示至少一個活化標志的白血球的組合物。在一些實施方案中,活化白血球進一步包含血小板。

在一些實施方案中,通過使白血球在室溫下靜置來簡單孵育白血球。出于本發明的目的,室溫是指在約12℃至約28℃,并且在一些實施方案中在約16℃至約25℃,約18-25℃以及約20-25℃的范圍內的溫度。孵育時期可視溫度而變化并且一般從約30分鐘至約24小時變化。活化白血球需要的孵育時間將粗略地與進行孵育所處的溫度成反比。因此,溫度越高,孵育時間越短。舉例來說,在使白血球在室溫下靜置的實施方案中,孵育時間一般在自約90分鐘、以及超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小時或超過24小時的范圍(以及其子范圍,包括例如最少時間為自90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時或以上的任何時間)內。在優選實施方案中,孵育時間在約3小時、4小時、5小時、6小時、7小時或8小時至約20小時的范圍內。在一個更優選實施方案中,白血球孵育在約18℃至約24℃下發生,持續約8小時至約12小時。在其它實施方案中,白血球孵育涉及使其暴露于熱,例如在高于室溫并且最高約37℃的溫度下。在高溫下的孵育時期一般是在30分鐘、45分鐘、60分鐘或90分鐘至約2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時或12小時(以及甚至更多,呈小時增量)至約24小時的范圍(以及其子范圍,包括例如最少時間為自30分鐘、45分鐘、60分鐘或90分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時等的任何時間)內的任何時間。

孵育之后,一般使白血球混懸液經受低滲透壓休克。在優選實施方案中,即刻(即,在完成前述步驟后未經任何插入步驟或不必要的延遲,通常小于2分鐘)進行低滲透壓休克。舉例來說,在圖中所述的系統中,低滲透壓休克可通過將蒸餾水從袋5轉移到含有白血球的袋1中來起始。低滲透壓休克處理通常進行約25-45秒。因為據信損失較少CD4+T細胞,所以優選這范圍內的更短時間。已知CD4+T細胞產生各種可益于傷口愈合的細胞因子(例如IFNγ、IL-2、IL-4、IL-17)。在這個步驟之后,并且優選地在其后即刻,白血球恢復等滲性。再次參考圖中所述的系統,作為一個示例性實施方案,這通過將氯化鈉溶液從袋2轉移到袋1來實現。氯化鈉溶液與水中細胞混懸液的體積比一般是約1∶10。

在恢復等滲性的處理之后,離心整個系統。這個過程去除在兩個先前步驟過程中添加的水和鹽溶液,并且防止白血球暴露于(紅血球)溶血產物。由于離心結果,因此白血球形成團塊。離心之后,將上清液從袋1轉移到袋C中,并且將袋1中因離心而形成的白血球團塊重懸于血清中或用于通過白血球進行調節的其它培養基中。

在一個實施方案中,血清通過一系列分離步驟獲得,所述一系列分離步驟可與第一次白血球孵育同時進行,所述第一次白血球孵育要求血漿與如CaCl2的凝結劑接觸。這個過程引起形成主要是纖維蛋白鏈與血小板聚集體的血塊。由于這種處理,所得血清的殘余血小板水平一般在每μL約0個至約0.2×103個的范圍內。因此,在這個實施方案中,將CaCl2從袋4轉移到袋B中。通常使現含有血漿與CaCl2的組合物的袋B在約37℃的溫度下凝結。盡管在這個實施方案中血漿保持與凝結劑接觸與孵育白血球大致上相同時期以達到活化目的,但血漿可保持與凝結劑接觸不同時間和大致上較短的時間,例如約90分鐘至約24小時。

使袋1中在恢復等滲性和離心后獲得的白血球團塊與約20ml至約200ml或更多的袋B血清(其可與白血球獲自相同或不同血樣)混合以形成在這種情況下包含血清的孵育組合物。

盡管已描述了使用示例性袋系統制備的活化白血球,但可使用如下制備的任何組合物以提供用于制備活化白血球調節上清液的活化白血球:孵育白血球一段時間以使白血球從靜止狀態過渡到功能活性狀態、使白血球經受低滲透壓休克,以及恢復白血球組合物的等滲性。

另外,盡管在孵育組合物中經常使用血清(具體來說是人血清),但也可使用其它培養基,只要所述其它培養基是支持從活化白血球釋放細胞因子、生長因子和/或其它可溶組分的生理學培養基。舉例來說,可使用血漿來代替血清。也可使用的其它孵育培養基包括可能添加有糖和對于細胞生存力和功能來說必需的其它組分(如氨基酸)的培養基,或鹽水或緩沖鹽水溶液(例如乳酸林格氏溶液(Lactated?Ringer′s?solution)、乙酸林格氏溶液、漢克氏平衡鹽溶液(Hank′s?balanced?salt?solution;HBSS)、厄爾氏平衡鹽溶液(Earle′s?balanced?salt?solution;EBSS)、標準鹽水檸檬酸鹽(SSC)、HEPES緩沖鹽水(HBS)、格氏平衡鹽溶液(Gey′s?balanced?salt?solution;GBSS))。鹽水溶液和培養基可補充有人血清或臨床級血清,或血清取代物。孵育組合物可選地或另外地含有血清蛋白,如人白蛋白或牛白蛋白、γ-球蛋白、轉鐵蛋白或來自不同組織的其它蛋白質、植物蛋白或植物提取物。此外,如干擾素-γ的激動劑可加入孵育組合物中以促進可溶性激動劑從細胞釋放。

孵育組合物是在調節上清液的時間和溫度條件下孵育,因此產生活化白血球調節上清液。這些條件包括約室溫的溫度(即,在約12℃至約28℃,并且在一些實施方案中約16℃至約25℃、約18-25℃以及約20-25℃的范圍內)至約37℃。孵育時間一般是在30分鐘、45分鐘、60分鐘或90分鐘至約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、36、48、60小時至約72小時或甚至更長時間的范圍內的任何值。在一些實施方案中,在室溫下孵育組合物約1小時至約48小時,例如在約18℃至約24℃下約8小時至約18小時,或約1小時、約24小時或約48小時。在其它實施方案中,在約37℃下孵育組合物約1小時至約5小時,或約30分鐘、約60分鐘,或約5小時。因此,因為白血球分泌到上清液中,眾多細胞因子、生長因子和其它可溶性生物學上活性分子在所述過程結束時以超標準濃度(即,高于從正常非病原性供體分離的血清中的濃度,并且在自體血清的情況下,高于具有傷口的患者的血清中的濃度)存在于上清液中,所以上清液變得被調節。為刺激產生和分泌細胞因子,可將如干擾素-γ的激動劑加入孵育組合物中。如工作實施例中所示,由于第二次孵育,因此白血球達到較高活化水平,例如CD11b和具體來說CD69的表達水平甚至更高、CD62L的表達水平甚至更低,以及IL-8和其它細胞因子和生長因子的產量提高。

在這第二次孵育之后,白血球例如通過離心、重力沉降、過濾或其它細胞去除方法大致上去除。在一些實施方案中,完全去除白血球以提供無細胞ALCS。舉例來說,在那些利用袋系統的實施方案中,再次離心整個袋系統(以使袋1中白血球團塊從ALCS分離)。或者,使具有白血球和調節血清的袋1在離心之前與系統分離,使新的空袋(圖2中未顯示)與袋1密接(即接合),接著離心這兩個袋以從ALCS分離白血球團塊。在離心之后,將袋1的液體部分轉移到系統中的剩余空袋中或轉移到新袋中。

在那些通過離心去除白血球的實施方案中,離心力一般在300g-10,000g的范圍內并且離心時間在5分鐘-60分鐘之間。在那些需要減少或消除殘余血小板的實施方案中,使用1000g以上的重力(g-force)以使血小板也將是團塊。較高速度(約10,000g)可用于那些需要減少或消除殘余紅血球、RBC殘留物和其它碎片的實施方案中。

根據本發明的一個方面,ALCS的至少一種細胞因子、生長因子或可溶性介質(選自IL-8、PDGF、Ang-1、VEGF、IL-6、TNFα或IL-1β)的濃度為用以制備產生所述ALCS的孵育組合物,但在使培養基與活化白血球組合物接觸之前的相同培養基中所述相同細胞因子、生長因子或可溶性介質的濃度的至少約1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。舉例來說,在一些實施方案中,ALCS的至少一種細胞因子、生長因子或可溶性介質(選自IL-8、PDGF、Ang-1、VEGF、IL-6、TNFα、IL-1β,或其組合或子組合)的濃度為表7中所述的未調節血清的IL-8、PDGF、Ang-1、VEGF、IL-6、TNFα或IL-1β水平的至少約1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍(包括或不包括標準偏差)。在一些實施方案中,較高濃度是相對于至少IL-8、至少PDGF、至少Ang-1、至少VEGF、至少IL-6、至少TNFα或至少IL-1β來說。在其它實施方案中,較高濃度是相對于IL-8、PDGF、Ang-1、VEGF、IL-6、TNFα或IL-1β中至少兩者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者或所有七者來說。

在這個程序之后,大致上無細胞ALCS可被冷凍,或凍干或冷凍干燥。從維持細胞因子和生長因子活性的觀點來看,添加劑,如防腐劑(例如抗氧化劑、糖(如海藻糖)、氯化鈉)可能有益。也可存放白血球團塊,由此允許再用以調節其它培養基以提供額外的ALCS。

在那些利用血清和/或血漿的實施方案中,應注意盡管用于本發明的各個方面的血清和/或血漿可與活化白血球組合物(從相同或不同血樣)同時制備,但在替代實施方案中,血清和/或血漿與活化白血球組合物獨立地制備。舉例來說,血清和/或血漿可獲自商業性或非盈利性血液產品供應商。血清和/或血漿可新近獲自一個或多個供體,或它可已存放一段時間并且可冷凍存放。此外,因為用以制備血清和/或血漿的血樣無需與用以制備活化白血球的血樣相同(無論它們來自相同供體與否),所以它們的制備無需與活化白血球組合物的制備在相同實際地點或同時發生。

在那些在使用之前存放ALCS的實施方案中,其可存放在室溫下、冷藏或冷凍。在那些在室溫下存放ALCS的實施方案中,其保存期限范圍是它產生之后最多約5天,例如在它產生之后約12小時、24小時、48小時、72小時或更多小時。

在那些冷藏存放ALCS的實施方案中,其保存期限為至少約7天或更多天,例如至少約1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周,或約1-2周、約1-3周、約1-4周、約1-5周、約1-6周、約1-7周或約1-8周。

在那些冷凍存放ALCS的實施方案中,其可冷凍存放,接著在需要時解凍。在一些實施方案中,冷凍ALCS的保存期限為至少約1周至1個月,或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個月或11個月至1年,或至少約1年、至少約2年或至少約3年。

在其它實施方案中,ALCS組合物可從較小體積的血樣制備,所有溶液的體積以及較小袋的使用都相稱地減少。此外,使用這些不同尺寸的袋和不同體積的血清得到具有不同濃度可溶性物質的ALCS。甚至在這些實施方案中,同種異體血樣或自體血樣可用作起始物質。如在緊急情況下,在治療具有否則健康免疫系統但罹患一些類型的外傷傷口(例如戰場病狀和戰斗病狀)的患者時,使用較小體積向臨床醫師提供自主進行血液采集,而不使用外部血庫的能力。在這些實施方案中,可省去對可傳播疾病和抗原的測試。然而在這些情況下,具有難愈合傷口的患者不是用于有效ALCS制備的臨床上可接受的獻血者。當產生這種情況時,ALCS將通過本文所述的手段從同種異體供體產生。

罹患傷口的患者可能受到生理損害或否則是健康的。舉例來說,由于代謝系統已受損,因此糖尿病和其它醫學上受損的患者是來源于異源血液的ALCS的候選者,這是因為他們自己的白血球對于所述程序來說可能不是最優的。然而,否則健康的患者(如在外傷患者的實例中)也是本發明的ALCS組合物的良好候選者。

本發明適用于治療和促進任何類型傷口的愈合。在一些實施方案中,將ALCS,例如大致上無細胞ALCS作為唯一的活性傷口愈合劑施用至傷口。在其它實施方案中,其與其它治療藥征(modality)組合使用。例如用標準注射器或類似涂覆裝置的涂覆容易性使得本發明的ALCS組合物安全并易于使用。

適于用本發明進行的治療的傷口通常呈活組織的燒傷、刺傷、割傷或撕傷的形式。皮膚傷口可穿透表皮、真皮或在完整厚度傷口的情況下穿透皮下組織。因此,適于用本發明組合物和方法進行的治療的傷口的代表類型包括燒傷(例如由暴露于火或對皮膚高度腐蝕的試劑導致)、潰瘍(例如褥瘡性潰瘍或任何其它壓迫性潰瘍、靜脈曲張性潰瘍和糖尿病性潰瘍)、腱炎、深胸骨傷口(例如在開心臟術之后);在冠狀動脈重建術以及采集大隱靜脈后的大隱靜脈手術傷口;以及在腹部手術和任何其它類型手術后的手術后傷口。其它傷口是由外傷引起的傷口,如在戰斗或其它暴力活動期間產生的傷口,包括由槍擊、刀或任何能導致皮膚切傷或撕傷的其它物件導致的傷口。口腔(例如牙齒)傷口,以及作為醫藥副作用或作為各種病理的癥狀(例如與卡波氏肉瘤(Kaposi′s?Sarcoma)相關的痛處)出現的傷口,以及內部傷口(例如肌肉組織破裂,如肛裂),和胃腸道傷口或病變,如胃部或腸部潰瘍)也可適于用本發明進行的治療。

ALCS也可用以治療任何由血管機能不全而加重的傷口。出于本發明的目的,血管機能不全是指血液循環不充分,從而導致對患病區域的灌注不足。這機能不全可由外傷(例如與骨折相鄰的血管結構的損傷)或各種病理(例如糖尿病和動脈粥樣硬化)導致。在任一情況下(外傷誘發或疾病誘發),血管機能不全都降低有效傷口愈合的可能性。ALCS可適用于改善這些患者的傷口愈合結果并且應根據本文所述的方法來施用。另外,治療方案(treatment?algorithm)不應受限于傷口嚴重度或傷口類型,或血管機能不全的程度。在呈現最嚴重傷口和血管機能不全的患者中,ALCS可能較有效。

活化白血球調節上清液特別適用于治療糖尿病性足潰瘍和褥瘡性潰瘍。褥瘡性潰瘍是由臥床不起患者體表的長期壓力和血流量受阻導致的皮膚和深部組織的慢性壓迫性潰瘍(Berlowitz,2007)。褥瘡性潰瘍導致老年人發病和死亡。至少48%IV期壓迫性潰瘍在治療一年之后仍未愈合。(Girouard,2008)。罹患褥瘡的患者通常還患有共病態病理,如糖尿病和高血壓。這些病理進一步使褥瘡的成功治療復雜化。

在其它方面,本發明涉及抑制傷口開始感染的方法,所述方法包括向傷口施用本發明組合物。在一個實施方案中,傷口由外傷導致。在另一實施方案中,傷口由手術導致。

在那些涉及治療傷口的方法的方面,傷口也可通過向傷口施用包含本發明組合物的制品來治療。

一般來說,涂覆活化白血球調節血清是借助于一次或多次將ALCS直接注入傷口或包圍傷口的組織中來實現。ALCS可直接涂覆到開放性傷口中。注射器中的全部樣本可配置,并且如果依據臨床參數確定其它ALCS為必需的,那么臨床醫師可選擇施用所述額外的ALCS。

可將ALCS注入各種位置的傷口。在一個實施方案中,對于傷口的全部長度,約每一厘米至約每三厘米進行注射。在各注射部位,注射0.1-0.3ml?ALCS。在其它實施方案中,整個注射器可一次性注入傷口內的單一部位。

為了注入傷口中,優選的是使用魯爾鎖(Luer-Lock)注射器或在注射器與針之間具有鎖定機構的任何其它可商購獲得的注射器。傷口(具體來說是壓傷)的生物間隔經常受限。當注入傷口中時,有導致注射器與針分離的壓力風險。使用鎖定注射器消除這種風險。如果將18G或更大針用于抽吸,那么將其與在22-35G尺寸范圍內的針交換以便注入傷口中。

當不可能注入傷口組織中時,ALCS可直接涂覆到傷口空腔中。這種方法中的涂覆可用注射器或管進行直接涂覆來進行。

ALCS可借助于敷料涂覆于傷口部位或其周圍。干敷料包括紗布和繃帶、非粘著性網狀物、膜和箔、泡沫以及組織粘著劑。保水障壁敷料包括糊劑、乳膏和軟膏、非滲透性或半滲透性膜或箔、水狀膠體、水凝膠,以及組合產品。生物活性敷料包括抗微生物敷料、相互作用性敷料、單組分生物敷料和組合產品(例如軟膏、凝膠劑、纖維蛋白密封劑、生長因子和血管生成因子(例如PDGF、VEGF、膠原蛋白)。在一些實施方案中,用浸泡在ALCS中的無菌紗布填充傷口。敷料(例如無菌紗布墊)可充滿組合物,如乳酸林格氏(哈特曼氏)溶液、含海藻酸鹽的敷料、聚氨基甲酸酯敷料或羧甲基纖維素敷料,涂覆所述敷料來覆蓋傷口,接著涂覆干敷料。如果主題傷口被高度感染,那么可涂覆銀敷料,如Silverlon。注射后敷料的選擇是依據臨床醫師的決定。商業可得性、既往臨床成功史和患者耐受性是在選擇傷口敷料中考慮的所有因素。敷料可定期去除,例如通常在約24小時之后去除以例如用無菌水和肥皂沖洗傷口。

在另一實施方案中,使ALCS在施用之前與生理惰性和/或可再吸收的基質或支架組合。基質或支架可由適于植入人中的任何材料形成。舉例來說,基質或支架可包含任何生物相容性材料,包括膠原蛋白、透明質酸或明膠、泡沫或其組合。膠原蛋白可獲自任何來源,包括從人組織或其它產生膠原蛋白的哺乳動物的組織制備的膠原蛋白。ALCS與基質/支架材料的組合可形成借助于壓力配合或通過注射向人施用的泡沫、凝膠或油灰。這允許將ALCS持續遞送到有利于患者的部位。泡沫可包含纖維蛋白密封劑。在一些實施方案中,ALCS與基質/支架材料的混合物是以商業方式制備并且預混合著提供給健康保健提供體。在其它實施方案中,健康保健提供體在向人施用之前混合ALCS與基質/支架。

ALCS可涂覆于傷口一次,或一旦臨床醫師確定是否必需再涂覆一次,便可涂覆于傷口多于一次,例如在4周之后涂覆。可考慮的因素包括傷口尺寸(寬度、長度和深度)增大、化膿、發熱或指示頑固傷口感染的任何其它跡象或癥狀,其使得再治療得到批準。除再治療外,可在臨床醫師認為適當的任一點指示轉診以便手術清創術。

ALCS可與任何其它常規傷口治療結合使用,所述常規傷口治療如為溫熱(治療熱)、電刺激、磁、激光光線療法、擺線振動療法和超聲波。它也可與生物學療法一起使用,生物學療法如為幼體療法、皮膚取代物、培養角質細胞(Epicel,Genzyme?biosurgery)、人皮膚替代法(Dermagraft,Smith?and?Nephew?Inc.)、尸源性處理真皮(Alloderm,Life?Cell?Corporation)、雙層皮膚等效物(Apligraf,Organogenesis?Inc.)、TransCyte(Smith?and?Nephew?Inc.)、生長因子(PDGF是目前唯一許可表面使用的生長因子),以及纖維蛋白密封劑。在一些實施方案中,ALCS與VAC結合使用,VAC是一種由KCI制造的可商購獲得的傷口療法。VAC通過向傷口施加負壓來促進傷口愈合。在這些實施方案中,ALCS在VAC療法之前優選地涂覆于傷口。在又其它實施方案中,ALCS與高壓療法結合使用(Thackham,2008)。舉例來說,ALCS可就在患者接受高壓療法之前涂覆于傷口。ALCS也可與低能沖擊波療法(例如脈沖為每厘米傷口長度約0.1mJ/mm2;5Hz)結合使用。參見例如Dumfarth等,Ann.Thorac.Surg.86:1909-13(2008)。

在治療后,可評估傷口的長度、寬度和高度測量值。通常,當這些參數的所有測量值都可忽略時,認為傷口愈合。ALCS也可提供止痛作用。

現將根據以下非限制性實施例來描述本發明的方面。

實施例1-細胞活化分析。

通過分析各種白血球群體(粒細胞、單核細胞和淋巴細胞)上的細胞表面標記(即CD11b、CD62L和CD69)來表征根據本發明的用于調節血清的優選實施方案制備的活化白血球組合物。

CD11b是ICAM-1(CD54)和其它配體的粘著受體。它主要在粒細胞和單核細胞/巨噬細胞上表達,但也在淋巴細胞上以較低水平表達。在白血球活化時,CD11b在細胞表面上的表達增高。另外,CD11b改變構形。活化形式的CD11b由抗體CBRM1/5識別。非活化形式的CD11b由不同抗體(D12)識別。

CD62L是來自選擇蛋白家族的粘著受體。它在所有類別的白血球(包括粒細胞、單核細胞和淋巴細胞)上都組成型表達。在活化時,白血球表面快速脫落CD62L。

CD69是淋巴細胞活化抗原。在活化時,淋巴細胞表面上CD69表達很早就增高。

在以下三個時間點對白血球取樣:在制備方法開始之前即刻(新鮮白細胞層(FBC);就在第一次孵育之后(孵育的白細胞層(IBC));以及在活化過程結束時(EAP),意思是在低滲透壓休克之后,接著在37℃下與血清一起第二次孵育90分鐘。在各時間點,用針對相應活化標記的特異性單克隆抗體標記白血球,接著通過流式細胞測量術分析。

對于抗體染色來說,以PBS/0.02%疊氮化鈉洗滌來自各時間點的細胞,并且以0.5×106/100μl重懸于FACS染色液(PBS,2%正常小鼠血清;0.02%疊氮化鈉)中。將100μl細胞混懸液的等分試樣與適當單克隆抗體在+4℃下在黑暗中一起孵育30分鐘。在孵育之后,用紅血球溶解緩沖液處理細胞、洗滌、重懸于PBS中,并且在FACSCalibur流式細胞儀(Becton?Dickinson)上分析。使抗-CD11b和抗-CD62L抗體與藻紅素(PE)綴合,并且使CD69抗體與異硫氰酸螢光素(FITC)綴合。為了更好地區分白血球群體,用CD11b標記的細胞也用針對單核細胞標記CD14的與別藻藍蛋白(allophycocyanin;APC)綴合的抗體雙標記,并且用CD62L抗體標記的細胞也用粒細胞標記CD15-APC雙標記。為了鑒別T淋巴細胞和B淋巴細胞,用CD69抗體染色的細胞也用抗-CD3-APC抗體和抗CD19-APC抗體雙染色。將在相同條件下用不相關但同型匹配的抗體(以及抗-CD14或抗-CD15,或抗-CD3/CD19抗體)染色的細胞用作陰性對照。單核細胞確定為CD14鮮明陽性細胞,并且粒細胞鑒別為CD14微暗陽性細胞或CD15鮮明陽性細胞(具有高側光散射性質(SSC))。T淋巴細胞確定為CD3陽性細胞并且B淋巴細胞確定為CD19陽性細胞。4-6個這些實驗的結果概述于表1、表2和表3中。數據是以染色細胞+/-標準偏差的平均螢光強度形式呈現。

表1中所示的數據證明,在所有白血球群體上與新鮮白細胞層(FBC)相比,由一般(D12)與抗活化形式(CBRM1/5)抗體兩者都識別的CD11b的表達水平在活化過程結束時(EAP)顯著增高。活化形式CD11b的上調較顯著。

表1:白血球群體上指示白血球活化的CD11b表達。

表2:白血球群體上指示白血球活化的CD62L表達。

表3:T淋巴細胞和B淋巴細胞上指示它們活化的CD69表達。

制備方法的不同階段的CD62L表達的比較證明,它已在經過孵育的白細胞層(IBC)的階段在所有白血球群體上都大幅并且顯著地降低。在活化過程結束時(EAP),CD62L水平可忽略(表2)。

如表3中所示,CD11b上調和CD62L下調符合特異性淋巴細胞活化標記CD69的表達,所述CD69的表達從幾乎無表達增高到適度但顯著水平。

實施例2-在血清中孵育期間由活化白血球分泌細胞因子的分析。

根據本發明的一個優選實施方案,離心含有10×106個細胞的活化白血球組合物,并且將細胞團塊重懸于5ml血清中。在不同孵育時間點在37℃下使用R&D系統的最優化ELISA板來測量IL-8和其它細胞因子的濃度。平行測量用于白血球重懸的血清(無白血球)中細胞因子的濃度(pg/ml),并且從在活化白血球存在下產生的值中減去。IL-8的五個實驗的結果以平均值±標準偏差的形式概述于表4中。各種細胞因子和生長因子(GF)的其它實驗的結果概述于表5中(n>10)。

表4.由活化白血球釋放到血清中的IL-8的濃度(pg/ml)。

表5.由活化白血球釋放到血清中的細胞因子和生長因子的濃度(pg/ml)

表4和表5中呈現的數據證明活化白血球支持IL-8和與傷口愈合有關的其它細胞因子和生長因子持續釋放到上清液中至少5小時的能力。

實施例3.從原料(新鮮白細胞層)和從中間體以及在制備方法結束階段取樣的白血球釋放細胞因子和生長因子的能力的比較。

在以下三個時間點對白血球取樣:在制備方法開始之前即刻(新鮮白細胞層(FBC));就在第一次孵育之后(孵育的白細胞層(IBC));以及在活化過程結束時(EAP),意思是在低滲透壓休克之后,接著在37℃下與血清一起第二次孵育90分鐘。根據本發明的一個優選實施方案,在各時間點,離心含有10×106個細胞的白血球組合物,并且將細胞團塊重懸于5ml培養基(RPMI)或對應于各樣本的原始培養基(血漿對應于新鮮白細胞層,并且血清對應于孵育的白細胞層和最終產物)中。在37℃下,各樣本的白血球在RPMI中孵育1小時,并且在血漿/血清中孵育5小時,并且使用R&D系統的最優化ELISA板來測量在這些時期內釋放的各種細胞因子的濃度。盡管RPMI不含有任何細胞因子,但平行測量用于白血球重懸的相應血漿或血清(無白血球)中細胞因子的濃度(pg/ml),并且從在活化白血球存在下產生的值中減去。結果以平均值±標準偏差(n=3-6)的形式概述于表6中。

表6.在制備方法的不同階段取樣的白血球的細胞因子和生長因子釋放的比較。

表6中呈現的數據證明,盡管原料(白細胞層)的白血球具有較低的釋放細胞因子的能力,但白血球的細胞因子釋放在制備方法期間增大并且在制備結束時最大。根據本發明的一個優選實施方案,當在制備結束時將活化白血球重懸于血清中時,與RPMI中的釋放相比,細胞因子釋放要高2-3倍。

實施例4.最終產物中細胞因子含量的分析。

測量在室溫下與活化白血球一起孵育1小時、24小時和48小時后的最終產物(在細胞通過離心沉淀之后)的液體部分中與傷口愈合有關的各種細胞因子和生長因子的濃度。使用eBioscience的最優化ELISA板進行測定。結果以平均值±標準偏差(n>10)的形式概述于表7中。

表7.在制備結束后的各種時刻的細胞因子含量

表7中所示的數據證明在制備結束時,ALCS含有顯著量的相關細胞因子和生長因子。當根據本發明的一個優選實施方案使活化白血球與血清一起預孵育的時間延長時,細胞因子濃度增大。在由活化白血球調節之前使用的血清中各自細胞因子和生長因子(除Ang-1以外)的含量顯著較低,是1/3-1/2。

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說明書中引用的所有出版物(包括專利出版物和非專利出版物兩者)都指示本發明所屬領域的技術人員的技能水平。所有這些出版物都以引用的方式并入本文中,引用程度如同各個別出版物特定地并且個別地被指示以引用的方式并入一樣。

盡管本文中已參考具體實施方案描述了本發明,但應了解這些實施方案僅說明本發明的原理和應用。因此應了解,可對說明性實施方案進行眾多改進,并且可設計其它安排而不背離本發明的精神和范疇,本發明的精神和范疇由隨附權利要求界定。

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