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一種鐵皮石斛無糖組織培養方法.pdf

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一種 鐵皮 石斛 組織培養 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310029289.5

申請日:

20130127

公開號:

CN103039368B

公開日:

20140205

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 云南天泉生物科技股份有限公司
發明人: 蔣娉,張國武,張國忠,張華明,張銀生
地址: 650500 云南省昆明市昆明經開區昆明中豪新冊產業城C14幢
優先權: CN201310029289A
專利代理機構: 昆明今威專利商標代理有限公司 代理人: 賽曉剛
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310029289.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供一種鐵皮石斛無糖組織培養方法,是將鐵皮石斛小段組織接種于石斛無糖組織培養初代培養基置于不銹鋼外殼植物生長箱進行培養,再將初代培養的無根苗切割為單苗接種于石斛無糖組織培養繼代培養基置于不銹鋼外殼植物生長箱進行培養。本發明可解決傳統組培過程中污染率高、生根率低、品質差的問題,提高鐵皮石斛組培苗的質量和產苗率,縮短培養周期,并且降低組培苗生產成本。

權利要求書

1.一種鐵皮石斛無糖組織培養方法,其特征在于包括以下步驟:(1)外植體準備:選擇典型性狀健康的鐵皮石斛種苗的莖,以莖芽為中心上下各留0.5cm剪下莖段作為鐵皮石斛無糖組織培養的外植體,將外植體浸泡在酒精體積百分含量70%的燒杯中2分鐘進行滅菌,然后用無菌水沖洗l?次;(2)初代無糖組織培養:將經步驟(1)處理的外植體接種至鐵皮石斛無糖組織培養初代培養基中,置于不銹鋼外殼植物生長箱進行初代培養;(3)無根苗篩選:將經過步驟(2)培養的無根苗進行篩選,選擇大小達3?-?4cm?的無根苗并用無菌水沖洗,將沖洗干凈的無根苗切割為單苗;(4)繼代無糖組織培養:將經步驟(3)處理的單苗接種至鐵皮石斛無糖組織培養繼代培養基中,置于不銹鋼外殼植物生長箱進行繼代培養;在步驟(2)所述鐵皮石斛無糖組織培養初代培養基中,a-萘乙酸的含量為0.1—0.5mg/L,?6-芐氨基腺嘌呤的含量為1—3mg/L,香蕉汁的含量為80—120g/L,活性炭的含量為200—300mg?/?L?,0.25毫米的沙粒的含量為8—10g/L,pH為5.6;在步驟(2)所述的初代無糖組織培養中,培養周期20—40天,CO濃度650±50μL/L,培養溫度20℃—26℃,光照強度1800—2100Lx,光照時間16—20小時/天;在步驟(4)所述鐵皮石斛無糖組織培養繼代培養基中,6-芐氨基腺嘌呤的含量為1—3mg/L,香蕉汁的含量為80—120g/L,活性炭的含量為300—600mg?/?L,?0.25毫米的沙粒的含量為8—10g/L,?pH為5.6;在步驟(4)所述的繼代無糖組織培養中,培養周期30—60天,CO濃度650±50μL/L,培養溫度20℃—26℃,光照強度1800—2100Lx,光照時間16—20小時/天。

說明書

技術領域

本發明涉及一種鐵皮石斛無糖組織培養方法,屬于農業技術領域。

背景技術

?鐵皮石斛,為蘭科多年生附生草本植物。生于海拔達1600米的山地半陰濕的巖石上,喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環境,不耐寒。一般均能耐-5℃的低溫。石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數十種,鐵皮石斛和金釵石斛為石斛之極品,鐵皮石斛因表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛具有獨特的藥用價值,以其莖入藥,中藥名:石斛,屬補益藥中的補陰藥,《中國藥典》:益胃生津,滋陰清熱。鐵皮石斛等少數品種之嫩莖,扭成螺旋狀或彈簧狀,曬干,商品稱為耳環石斛,又名楓斗。多年以來,商品石斛主要依靠野生藥用石斛資源,隨著藥用石斛開發利用的不斷深入和國內外需求量的逐年增加,我國野生藥用石斛資源遭到了嚴重破壞,有些地區甚至面臨枯竭。為了保護野生蘭科植物資源,各國都出臺了許多禁止采挖或銷售野生蘭科植物的法規和條例,如1975年生效的《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES),把所有蘭科植物全部列入附錄Ⅰ和Ⅱ中;于1987年國務院出臺的《野生藥材資源保護管理條例》中,環草石斛、黃草石斛、金釵石斛、馬鞭石斛和鐵皮石斛被列為國家三級珍稀瀕危保護植物。這些政策措施對野生藥用石斛資源的妥善保護起到了重要作用。傳統鐵皮石斛組織培養小植株主要依靠培養基中的糖作為碳源,極易引起微生物的污染。為了減少微生物的污染,必須使用封閉的、小的培養容器。培養容器小,并且由于培養基中糖的存在,導致葉片表層結構發育差,氣孔開閉功能不強,葉片小,葉綠素含量低,最終抑制和降低了小植株的光合作用能力。與植株自然生長差異懸殊的容器內環境,還導致植株生理、形態上的一定紊亂,難以適應的會生長發育延緩或死亡,有的會出現植株生長細弱,葉片舒展度差,生根不良,引起馴化階段植株較高的死亡率,為此必須使用植物生長調節劑,但是植物生長調節劑的使用又會導致畸形和變異。

發明內容

本發明的目的是提供一種鐵皮石斛無糖組織培養方法,可解決傳統組培過程中污染率高、生根率低、品質差的問題,可提高鐵皮石斛組培苗的質量和產苗率,縮短培養周期,并且降低組培苗生產成本。

本發明的目的是這樣實現的:

本發明的鐵皮石斛無糖組織培養方法包括以下步驟:

(1)外植體準備:選擇典型性狀健康的鐵皮石斛種苗的莖,以莖芽為中心上下各留0.5cm剪下莖段作為體皮石斛無糖組織培養的外植體,將外植體浸泡在酒精體積百分含量70%的燒杯中2分鐘進行滅菌,然后用無菌水沖洗l?次;

(2)初代無糖組織培養:將經步驟(1)處理的外植體接種至鐵皮石斛無糖組織培養初代培養基中,置于不銹鋼外殼植物生長箱進行初代培養;

(3)無根苗篩選:將經過步驟(2)培養的無根苗進行篩選,選擇大小達3?-?4cm?的無根苗并用無菌水沖洗,將沖洗干凈的無根苗切割為單苗;

(4)繼代無糖組織培養:將經步驟(3)處理的單苗接種至鐵皮石斛無糖組織培養繼代培養基中,置于不銹鋼外殼植物生長箱進行繼代培養。

在步驟(2)所述鐵皮石斛無糖組織培養初代培養基中,a-萘乙酸的含量為0.1—0.5mg/L,?6-芐氨基腺嘌呤的含量為1—3mg/L,香蕉汁的含量為80—120g/L,活性炭的含量為200—300mg?/?L?,0.25毫米的沙粒的含量為8—10g/L,PH為5.6。

在步驟(2)所述的初代無糖組織培養中,培養周期20—40天,CO2濃度650±50μL/L,培養溫度20℃—26℃,光照強度1800—2100Lx,光照時間16—20小時/天。

在步驟(4)所述鐵皮石斛無糖組織培養繼代培養基中,6-芐氨基腺嘌呤的含量為1—3mg/L,香蕉汁的含量為80—120g/L,活性炭的含量為300—600mg?/?L,?0.25毫米的沙粒的含量為8—10g/L,?PH為5.6。

在步驟(4)所述的繼代無糖組織培養中,培養周期30—60天,CO2濃度650±50μL/L,培養溫度20℃—26℃,光照強度1800—2100Lx,光照時間16—20小時/天。

本發明的這種鐵皮石斛無糖組織培養方法與傳統鐵皮石斛組織培養方法區別在于:

(1)碳源的改變:在傳統的植物組培快繁技術中,小植株以糖(如蔗糖、白砂糖、果糖等)作為主要碳源進行異養或兼養生長,糖被看作是植物組織培養中必不可少的物質。而本發明中則用?CO2替代糖作為小植株生長的唯一碳源,通過強制性換氣系統供給小植株生長所需CO2,使其在人工光照下,吸收?CO2?進行完全的自養生長,在一定程度上避免了微生物的污染。

(2)?培養基質的改變:在傳統的組織培養中,通常使用瓊脂作為培養基質,它的透氣性差,不利于水分、氣體和營養物質的移動和吸收。本發明使用沙粒作為培養基質,此基質具有良好的透氣性,可以極大地提高小植株的生根率和生根質量,?而且與瓊脂相比,此無機基質價格相對低廉,?節約了培養成本。

(3?)培養容器的改變:在傳統的組織培養中,由于培養基中糖的存在,為了防止污染,只能使用小的培養容器。本發明在培養過程中不使用糖及各類有機物質,極大地避免了污染的發生,因此選用不銹鋼外殼植物生長箱作為培養容器,既可以人工控制CO2濃度又可以人工控制光照強度。

具體實施方式

本發面詳細實施方式如下:

(1)外植體準備:選擇典型性狀健康的鐵皮石斛種苗的莖,以莖芽為中心上下各留0.5cm剪下莖段作為體皮石斛無糖組織培養的外植體,將外植體浸泡在酒精體積百分含量70%的燒杯中2分鐘進行滅菌,然后用無菌水沖洗l?次;

(2)初代無糖組織培養:將經步驟(1)處理的外植體接種至鐵皮石斛無糖組織培養初代培養基中,置于不銹鋼外殼植物生長箱進行初代培養,培養周期20—40天,CO2濃度(650±50)μL/L,培養溫度20℃—26℃,光照強度1800—2100Lx,光照時間16—20小時/天;所述鐵皮石斛無糖組織培養初代培養基包含以下成分:MS培養基,?a-萘乙酸的含量為0.1—0.5mg/L,?6-芐氨基腺嘌呤的含量為1—3mg/L,香蕉汁的含量為80—120g/L,活性炭的含量為?200—300mg?/?L?,0.25毫米的沙粒的含量為8—10g/L,PH為5.6;

(3)無根苗篩選:將經過步驟(2)培養的無根苗進行篩選,選擇大小達3?-?4cm?的無根苗并用無菌水沖洗,將沖洗干凈的無根苗切割為單苗;

(4)繼代無糖組織培養:將經步驟(3)處理的單苗接種至鐵皮石斛無糖組織培養繼代培養基中,置于不銹鋼外殼植物生長箱進行繼代培養,培養周期30—60天,CO2濃度(650±50)μL/L,培養溫度20℃—26℃,光照強度1800—2100Lx,光照時間16—20小時/天;所述鐵皮石斛無糖組織培養繼代培養基包含以下成分:MS培養基,?6-芐氨基腺嘌呤的含量為1—3mg/L,香蕉汁的含量為80—120g/L,活性炭的含量為300—600mg?/?L,?0.25毫米的沙粒的含量為8—10g/L,?PH為5.6。

實施例

選擇產于福建優質鐵皮石斛種苗的莖,經步驟(1)處理,接種至鐵皮石斛無糖組織培養初代培養基中,置于不銹鋼外殼植物生長箱進行初代培養,培養按照培養基配方和培養條件分8組進行。

? 組A 組B 組C 組D 組E 組F 組G 組H a-萘乙酸(mg/L) 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 2 3 3 2 3 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 120 100 120 活性炭(mg/L) 200 200 250 250 275 275 300 300 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 9 10 10 9 8 9 10 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 2000 2100 2100 培養溫度(℃) 20 24 24 26 26 22 24 24 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 18 20 18 培養周期(天) 40 35 30 25 20 30 35 30

將經過步驟(2)培養的無根苗進行篩選,選擇大小達3?-?4cm?的無根苗并用無菌水沖洗,將沖洗干凈的無根苗切割為單苗;

經步驟(3)處理的同組單苗,接種至鐵皮石斛無糖組織培養繼代培養基中,置于不銹鋼外殼植物生長箱進行繼代培養,培養按照培養基配方和培養條件再分5組進行。

?組A

? 組A1 組A2 組A3 組A4 組A5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 1 2 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 活性炭(mg/L) 200 250 274 300 250 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 10 10 9 8 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 培養溫度(℃) 20 24 26 24 20 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 培養周期(天) 30 40 50 55 60

組B

? 組B1 組B2 組B3 組B4 組B5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 1 2 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 活性炭(mg/L) 200 250 274 300 250 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 10 10 9 8 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 培養溫度(℃) 20 24 26 24 20 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 培養周期(天) 30 40 50 55 60

組C

? 組C1 組C2 組C3 組C4 組C5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 1 2 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 活性炭(mg/L) 200 250 274 300 250 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 10 10 9 8 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 培養溫度(℃) 20 24 26 24 20 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 培養周期(天) 30 40 50 55 60

組D

? 組D1 組D2 組D3 組D4 組D5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 1 2 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 活性炭(mg/L) 200 250 274 300 250 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 10 10 9 8 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 培養溫度(℃) 20 24 26 24 20 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 培養周期(天) 30 40 50 55 60

組E

? 組E1 組E2 組E3 組E4 組E5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 1 2 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 活性炭(mg/L) 200 250 274 300 250 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 10 10 9 8 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 培養溫度(℃) 20 24 26 24 20 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 培養周期(天) 30 40 50 55 60

組F

? 組F1 組F2 組F3 組F4 組F5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 1 2 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 活性炭(mg/L) 200 250 274 300 250 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 10 10 9 8 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 培養溫度(℃) 20 24 26 24 20 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 培養周期(天) 30 40 50 55 60

組G

? 組G1 組G2 組G3 組G4 組G5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 1 2 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 活性炭(mg/L) 200 250 274 300 250 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 10 10 9 8 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 培養溫度(℃) 20 24 26 24 20 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 培養周期(天) 30 40 50 55 60

組H

? 組H1 組H2 組H3 組H4 組H5 6-芐氨基腺嘌呤(mg/L) 1 2 3 1 2 香蕉汁(g/L) 80 80 100 100 120 活性炭(mg/L) 200 250 274 300 250 0.25毫米的沙粒(g/L) 8 10 10 9 8 光照強度(LX) 1800 1800 1800 2000 2000 培養溫度(℃) 20 24 26 24 20 光照時間(小時/天) 16 18 20 18 16 培養周期(天) 30 40 50 55 60

通過上述實驗顯示:本發明40組實施例基本都能在3個月培養周期達到莖高8㎝,根數3根,葉片數6片可以用于種植的合格組培苗,其中以組E3生長最為顯著,到達組平均莖高8.5㎝,組平均根數3.7根,組平均葉片數7.4片。

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