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一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養及再生體系建立的方法.pdf

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一種 金邊 龍舌蘭 培養 再生 體系 建立 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310033326.X

申請日:

20130129

公開號:

CN103039370B

公開日:

20140319

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所
發明人: 張燕梅,周文釗,李俊峰,陸軍迎,林映雪
地址: 524000 廣東省湛江市麻章區湖秀路1號
優先權: CN201310033326A
專利代理機構: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 代理人: 劉廣生
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310033326.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養及再生體系建立的方法,包括以下步驟:(1)無菌苗培養:以珠芽苗莖尖為外植體,消毒后接種于叢芽誘導培養基上誘導無菌苗;(2)愈傷組織誘導:以無菌苗莖尖為外植體,縱切后接種在愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導;(3)愈傷組織繼代培養:將誘導的愈傷組織轉入繼代培養基中進行愈傷組織繼代培養;(4)不定芽誘導及植株再生:將繼代培養獲得的塊狀或球狀愈傷組織接種到不定芽誘導培養基上進行不定芽誘導和植株再生;(5)繼代培養和生根:將再生植株轉入繼代培養基中進行繼代培養,成苗后生根;(6)再生植株移栽;本方法簡單,為金邊弧葉龍舌蘭的離體快繁和遺傳改良打下了良好的基礎。

權利要求書

1.一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養及再生體系建立的方法,其特征在于:包括如下步驟:????(1)外植體表面消毒及無菌苗培養以金邊弧葉龍舌蘭珠芽苗為材料,將外層老葉剝離,流水沖洗,用0.3%高錳酸鉀溶液處理20~40?min,然后在超凈工作臺上用75%酒精處理1~2?min,再用0.1%氯化汞溶液處理15~30?min,最后用無菌水沖洗3-5次,晾干后縱切,接種于基本培養基上誘導無菌苗;培養條件為光照12?h,暗培養12?h,光照強度為1500-2000?Lux,培養溫度為26±2?℃;所述的基本培養基為:硝酸鉀2500?mg/L,磷酸二氫銨300?mg/L,二水氯化鈣200?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅1?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L,?6-芐氨基腺嘌呤6-BA?2.0-5.0?mg/L,HS培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/L,卡拉膠濃度為8?g/L;????(2)愈傷組織的誘導????取步驟(1)培養的無菌苗莖尖,縱切后置于愈傷組織誘導培養基中進行愈傷組織誘導,愈傷組織誘導培養基為MS基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA和萘乙酸NAA;其中6-芐氨基腺嘌呤6-BA的濃度為1.0-3.0?mg/L,萘乙酸NAA的濃度為0.1-1.0?mg/L;培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L,卡拉膠濃度為8?g/?L;培養條件為黑暗24?h,溫度26±2?℃;?????(3)愈傷組織繼代培養????將步驟(2)誘導的愈傷組織接種在愈傷組織繼代培養基中進行繼代培養,繼代培養基為MS基本培養基,MS基本培養基添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚-3-丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;?NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L;培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/L,卡拉膠濃度為8?g/L;繼代培養條件為:光照12?h,黑暗12?h,光照強度1000?lux,溫度26±2?℃;??????(4)不定芽誘導將步驟(3)得到的淺黃綠色愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基中進行不定芽誘導,不定芽誘導培養基為HS1基本培養基,培養基添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚-3-丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L,培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/l,卡拉膠濃度為8?g/?L;光照12h,黑暗12h,光照強度為1000?lux,溫度26±2℃;所述的HS1基本培養基為:硝酸鉀2250?mg/L,磷酸二氫鉀400?mg/L,硫酸銨150?mg/L,二水氯化鈣400?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅5?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L;???(5)繼代和生根培養????待步驟(4)得到的不定芽成苗后轉接到繼代培養基中進行繼代培養,繼代培養所用培養基為HS基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚-3-丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L;待繼代培養的再生植株長到5-8cm時轉入生根培養基中進行生根培養,生根培養所用培養基為不加激素的MS基本培養基,培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L,卡拉膠濃度為8?g/?L;培養條件為:光照12h,黑暗12h,光照強度為1500?lux,溫度26±2℃;所述的HS基本培養基為:硝酸鉀2500mg/L,磷酸二氫銨300?mg/L,二水氯化鈣200?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅1?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L;???(6)?再生植株移栽待再生植株生根4周,長出4-8條壯根時,將其置于自然條件下煉苗1周,然后將其移出,洗凈基部殘留的培養基,用3%高錳酸鉀浸泡1-3min后移植到基質為火燒土、椰糠和河沙的塑料遮光大棚中,大棚遮光度75%,每天早晚各澆透水1次,再生植株的成活率在90%以上。

說明書

技術領域

本發明涉及一種龍舌蘭麻離體培養及植株再生體系建立的方法,特別涉及一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養及再生體系建立的方法,屬于組織培養育苗技術領域。

背景技術

金邊弧葉龍舌蘭麻為龍舌蘭科龍舌蘭屬多年生草本植物,主要分布在熱帶、亞熱帶地區,葉長橢圓形,叢生,呈螺旋狀排列于基部,葉緣有黃白色條紋,葉片堅挺美觀,四季常青,是主要的園林觀賞植物之一,有重要的觀賞價值,常用于盆栽或庭院觀賞。

金邊弧葉龍舌蘭2-3年開一次花,開花后便整株死亡,因此多用珠芽繁殖。國內外對龍舌蘭麻的組織培養和植株再生做了一定的探索。目前已成功建立了亞洲馬蓋麻(A.?cantala?Robx)、灰葉劍麻(A.?fourcroydes?Lem)、普通劍麻(A.?sisalana?Perrine)、藍劍麻(A.?tequilana?Weber?cultivar?azul)、A.?parrasana?Berger、?A.?tequilana、A.?crassispina、?A.?duranguensisA.?vera-cruz?Mill.、?A.?atrovirens、A.?arizonica和普通劍麻、H.11648等體外再生體系并獲得了完整的再生植株;目前有關金邊弧葉龍舌蘭麻離體培養與植株再生的研究還未見報道,因此,建立金邊弧葉龍舌蘭的離體培養和植株再生體系,不僅為快速繁殖提供有效途徑,同時為龍舌蘭麻誘變育種、單倍體育種以及基因工程育種打下良好的基礎,為遺傳改良提供有效途徑。

發明內容

本發明的目的是建立一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養和植株再生的方法,為了解決上述問題,本發明所采用的技術方案是:

??一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養和植株再生的方法,包括如下步驟:

????(1)外植體表面消毒及無菌苗培養

以金邊弧葉龍舌蘭珠芽苗莖尖為材料,先將外層老葉剝離,流水沖洗后用0.3%高錳酸鉀溶液處理30min,在超凈工作臺上用75%酒精處理1~2?min,再用0.1%氯化汞溶液處理15~30?min,最后用無菌水沖洗3-5次,晾干后縱切,接種于叢芽誘導培養基HS?(硝酸鉀2500mg/L,磷酸二氫銨300?mg/L,二水氯化鈣200?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅1?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L)上,HS基本培養基添加6-芐氨基腺嘌呤6-BA濃度為2.0-5.0?mg/L,培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L,卡拉膠濃度為8?g/?L,培養條件為每天光照12?h,暗培養12?h,光照強度1500?lux,培養溫度為26±2℃;

????(2)愈傷組織的誘導

?????取步驟(1)培養的生長健壯的無菌苗莖尖縱切后連同嫩葉一起接種于愈傷組織誘導培養基中培養2-4周,剝離外層葉片后轉入相同培養基上進行愈傷組織誘導培養,愈傷組織誘導培養基為MS基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA和萘乙酸NAA;6-芐氨基腺嘌呤6-BA的濃度為1.0-3.0?mg/L,萘乙酸NAA的濃度為0.1-1.0?mg/L;培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L,卡拉膠濃度為8?g/?L;培養條件為:黑暗24?h,溫度26±2?℃;??

????(3)愈傷組織繼代培養

????取步驟(2)誘導的淡黃綠色愈傷組織接種在繼代培養基中進行繼代培養,繼代培養基為MS基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L;培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L,卡拉膠濃度為8?g/?L;繼代培養條件為:光照12?h,黑暗12?h,光照強度1000?lux,溫度26±2?℃;

????(4)不定芽誘導

取步驟(3)繼代培養的淺黃綠色愈傷組織切成黃豆大小后接種到不定芽誘導培養基中進行不定芽誘導,不定芽誘導培養基為HS1(硝酸鉀2250?mg/L,磷酸二氫鉀400?mg/L,硫酸銨150?mg/L,二水氯化鈣400?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅5?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L)基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L,培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L,卡拉膠濃度為8?g/?L;光照12?h,黑暗12?h,光照強度為1000?lux,溫度26±2℃;

???(5)繼代和生根培養

待步驟(4)得到的不定芽成苗后轉接到繼代培養基中進行繼代培養,繼代培養所用培養基為HS基本培養基?(硝酸鉀2500mg/L,磷酸二氫銨300?mg/L,二水氯化鈣200?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅1?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L)。添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L,培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L?l,卡拉膠濃度為8?g/?L;光照12?h,黑暗12?h,光照強度為1500?lux,溫度26±2℃;

待繼代培養的再生植株長到5-8?cm時轉入生根培養基中進行生根培養,生根培養所用培養基為不加激素的MS基本培養基,培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L,卡拉膠濃度為8?g/?L;培養條件為:光照12?h,黑暗12?h,光照強度為1500?lux,溫度26±2℃。

(6)?再生植株移栽

待再生植株生根4周,長出4-8條壯根時,將其置于自然條件下煉苗1周,然后將其移出,洗凈基部殘留的培養基,用3%高錳酸鉀浸泡1-3?min后移植到基質為火燒土:椰糠:河沙(2:1:1)的塑料遮光大棚中,大棚遮光度75%,每天早晚各澆透水1次,再生植株的成活率在90%以上。

本發明相對于現有技術的有益效果是:

本發明建立了一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養及植株再生的方法,該方法實施步驟簡單、實施條件寬松,效果顯著。不僅可在短期內獲得再生植株,同時為金邊弧葉龍舌蘭種質創新奠定了良好的基礎。

附圖說明

圖1?金邊弧葉龍舌蘭離體培養及叢芽誘導;

圖2?金邊弧葉龍舌蘭無菌苗莖尖愈傷組織的誘導;

圖3?愈傷組織培養;

圖4愈傷組織誘導不定芽;

圖5不定芽繼代培養;

圖6再生植株生根培養。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明,這些實施例僅用來說明本發明,并不限制本發明的范圍。

一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養及再生體系建立的方法,包括如下步驟:

(1)外植體表面消毒及無菌苗培養

以金邊弧葉龍舌蘭珠芽苗為材料,將外層老葉剝離,流水沖洗,用0.3%高錳酸鉀溶液處理20~40?min,然后在超凈工作臺上用75%酒精處理1~2?min,再用0.1%氯化汞溶液處理10~30?min,最后用無菌水沖洗3-5次,晾干后縱切,接種于HS基本培養基上誘導無菌苗,所述的HS基本培養基為:硝酸鉀2500mg/L,磷酸二氫銨300?mg/L,二水氯化鈣200?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅1?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L,?6-芐氨基腺嘌呤6-BA?2.0-5.0?mg/L,培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/L,卡拉膠濃度為8?g/L;培養條件:光照12?h,暗培養12?h,光照強度為1500-2000?Lux,培養溫度為26±2?℃;

????(2)愈傷組織的誘導

?????取步驟(1)培養的無菌苗莖尖,縱切后接種于愈傷組織誘導培養基中進行愈傷組織誘導,愈傷組織誘導培養基為MS基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA和萘乙酸NAA;6-芐氨基腺嘌呤6-BA的濃度為1.0-3.0?mg/L,萘乙酸NAA的濃度為0.1-1.0?mg/L;培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/?L,卡拉膠濃度為8?g/?L;培養條件為黑暗24?h,溫度26±2?℃;?

????(3)愈傷組織繼代培養

????將步驟(2)誘導的愈傷組織接種在愈傷組織繼代培養基中進行繼代培養,繼代培養基為MS基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;?NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L;培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/L,卡拉膠濃度為8?g/L;繼代培養條件為:光照12?h,黑暗12?h,光照強度1000?lux,溫度26±2?℃;??

????(4)不定芽誘導

將步驟(3)培養的淺黃綠色愈傷組織接種到不定芽誘導培養基中進行不定芽誘導,不定芽誘導培養基為HS1基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L,培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/l,卡拉膠濃度為8?g/l;所述的HS1基本培養基為:硝酸鉀2250?mg/L,磷酸二氫鉀400?mg/L,硫酸銨150?mg/L,二水氯化鈣400?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅5?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L;培養條件為:光照12?h,黑暗12?h,光照強度為1000?lux,溫度26±2℃;

???(5)繼代和生根培養

????待步驟(4)培養的不定芽成苗后轉接到繼代培養基中進行繼代培養,繼代培養所用培養基為HS基本培養基,添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA;其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L;NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L,IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L;待繼代培養的再生植株長到5-8cm時轉入生根培養基中進行生根培養,生根培養所用培養基為不加激素的MS基本培養基。繼代和生根培養所用培養基的pH值為5.8,蔗糖濃度為30?g/l,卡拉膠濃度為8?g/l。培養條件為:光照12h,黑暗12h,光照強度為1500?lux,溫度26±2℃;所述的HS基本培養基為:硝酸鉀2500mg/L,磷酸二氫銨300?mg/L,二水氯化鈣200?mg/L,七水硫酸鎂400?mg/L,一水硫酸錳10?mg/L,七水硫酸鋅1?mg/L,硼酸5?mg/L,碘化鉀1?mg/L,二水鉬酸鈉0.1?mg/L,五水硫酸銅0.2?mg/L,六水氯化鈷0.1?mg/L,七水硫酸鐵27.8?mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L,鹽酸硫胺素0.5?mg/L,鹽酸吡哆醇0.5?mg/L,煙酸0.5?mg/L,肌醇100?mg/L,甘氨酸2?mg/L;

???(6)?再生植株移栽

待再生植株生根4周,長出4-8條壯根時,將其置于自然條件下煉苗1周,然后將其移出,洗凈基部殘留的培養基,用3%高錳酸鉀浸泡1-3min后移植到基質為火燒土、椰糠和河沙的塑料遮光大棚中,大棚遮光度75%,每天早晚各澆透水1次,再生植株的成活率在90%以上。

實施例1

2011年6月14日,從中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所劍麻種質圃取5株金邊弧葉龍舌蘭珠芽苗,經過0.1%的升汞消毒15分鐘后,用無菌水洗三次,接種于HS+?6-芐氨基腺嘌呤6-BA?5.0?mg/?L的培養基上,每4周繼代一次,24周后獲得金邊弧葉龍舌蘭無菌苗238株。

實施例2

2012年3月14日,取實施例1中的無菌苗15株,取莖尖縱切后連同未成熟葉片一起接種于MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?1.0?mg/?L培養基中暗培養,2周后將莖尖外層未成熟葉片剝離,將莖尖接種于MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?1.0?mg/?L培養基中繼續暗培養,4周后愈傷組織誘導率為93.33%,將愈傷組織在MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?0.1?mg/?L?+IBA?0.1?mg/?L培養基中繼代一次后取30塊黃豆大小的愈傷組織轉入HS1+6-BA?5.0?mg/?L?+NAA?0.1?mg/?L?+IBA?0.1?mg/?L培養基,4周后觀察統計不定芽為283株,不定芽誘導率為100%。

實施例3

?2012年4月9日,取實施例1中的無菌苗10株,取莖尖縱切后接種于MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?0.2?mg/?L培養基中暗培養,4周后觀察統計愈傷組織誘導率為86.67%,將愈傷組織轉于MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?0.1?mg/?L?+IBA?0.1?mg/?L培養基中培養4周后,取20塊黃豆大小的愈傷組織轉入HS1+6-BA?3.0?mg/?L?+NAA?0.5?mg/?L?+IBA?0.5?mg/?L培養基,4周后觀察統計不定芽為190株,不定芽誘導率為90.0%。

實施例4

2012年4月9日,取實施例1中的無菌苗10株,取莖尖縱切后連同未成熟葉片接種于MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?0.5?mg/?L培養基中暗培養,4周后將莖尖外層未成熟葉片剝離,將莖尖接種于MS+6-BA?2.0?mg/l+NAA?0.5?mg/l培養基中繼續暗培養,4周后觀察統計愈傷組織誘導率為90.0%,將愈傷組織轉于MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?0.1?mg/?L?+IBA?0.1?mg/?L培養基中培養2周后取20個黃豆大小的愈傷組織轉入HS1+6-BA?3.0?mg/?L?+NAA?0.5?mg/?L?+IBA?0.1?mg/?L培養基,4周后觀察統計不定芽為173株,不定芽誘導率為90.0%。

實施例5

2012年5月8日,取實施例1中的無菌苗10株,取莖尖縱切后接種于MS+6-BA?1.0?mg/?L?+NAA?0.2?mg/?L培養基中暗培養,4周后觀察統計愈傷組織誘導率為60.0%,將愈傷組織轉于MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?0.1?mg/?L?+IBA?0.1?mg/?L培養基中培養2周后取20個黃豆大小的愈傷組織轉入HS1+6-BA?1.0?mg/?L?+NAA?0.5?mg/?L?+IBA?1.0?mg/?L培養基,4周后統計不定芽為154株,不定芽誘導率為80.0%。

實施例6

2012年6月4日,取實施例1中的無菌苗10株,取莖尖縱切后連同未成熟葉片接種于MS+6-BA?1.0?mg/?L?+NAA?1.0?mg/?L培養基中暗培養,4周后將莖尖外層葉片剝離,將莖尖接種于MS+6-BA?1.0?mg/?L?+NAA?1.0?mg/?L培養基中繼續暗培養,4周后觀察統計愈傷組織誘導率為70.0%,將愈傷組織轉于MS+6-BA?2.0?mg/?L?+NAA?0.1?mg/?L?+IBA?0.1?mg/?L培養基中培養4周后取20個黃豆大小的愈傷組織轉入HS1+6-BA?1.0?mg/?L?+NAA?1.0?mg/?L?+IBA?0.1?mg/?L,4周后統計不定芽為186株,不定芽誘導率為85.0%.

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