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用于遞送生物分子的包含陶瓷粒子的粒狀物質.pdf

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用于 遞送 生物 分子 包含 陶瓷 粒子 粒狀 物質
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摘要
申請專利號:

CN201180049680.0

申請日:

20110815

公開號:

CN103209688A

公開日:

20130717

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/14,A61K38/00,A61K48/00,A61K31/70,A61K47/02,C01B33/18 主分類號: A61K9/14,A61K38/00,A61K48/00,A61K31/70,A61K47/02,C01B33/18
申請人: 澳大利亞核能科技組織
發明人: 克里斯托夫·吉思·亞歷山大·巴布,金·蘇珊娜·芬尼,塞繆爾·奈特利,托賓·約翰斯頓·帕賽羅
地址: 澳大利亞新南威爾士州盧卡斯高地
優先權: 2010903683
專利代理機構: 北京友聯知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 尚志峰;汪海屏
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201180049680.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

一種粒狀物質,其包含帶有官能團的陶瓷基質的粒子,所述官能團能夠促進所述粒子滲入到細胞中;以及設置在所述粒子的孔隙內的生物分子,所述生物分子通過所述陶瓷基質的溶出而可從所述粒子釋放。

權利要求書

1.一種粒狀物質,包含:帶有官能團的陶瓷基質的粒子,所述官能團能夠促進所述粒子滲入細胞中;和設置在所述粒子的孔隙內的生物分子,所述生物分子通過溶解所述陶瓷基質從所述粒子是可釋放的。2.根據權利要求1所述的粒狀物質,其中在沒有溶解所述陶瓷基質下,所述生物分子通過浸出從所述粒子是基本上不可釋放的。3.根據權利要求2所述的粒狀物質,其中所述官能團與所述生物分子化學相互作用以基本上防止浸出。4.根據權利要求1至3中任一項所述的粒狀物質,其中帶有官能團的所述陶瓷基質包括官能化的二氧化硅基質。5.根據權利要求1至4中任一項所述的粒狀物質,其中所述陶瓷基質的官能團包括氨基烷基烷基。6.根據權利要求1至5中任一項所述的粒狀物質,其中所述生物分子包括RNA、反義核苷酸、反義引物、適體、DNA、蛋白質、糖蛋白、多肽、碳水化合物或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。7.根據權利要求1至6中任一項所述的粒狀物質,其中聚乙二醇鏈偶聯于所述粒子的表面。8.根據權利要求1至7中任一項所述的粒狀物質,其中定位基團偶聯于所述粒子的表面。9.根據權利要求1至8中任一項所述的粒狀物質,其中所述粒子的平均粒度為約0.1至10微米,優選為約0.1至1微米。10.根據權利要求1至9中任一項所述的粒狀物質,其中所述粒子的平均粒度為約20至約100nm。11.根據權利要求1至10中任一項所述的粒狀物質,其中所述粒子的孔徑為約1至約50nm。12.根據權利要求1至11中任一項所述的粒狀物質,其中所述粒子的生物分子的加載為約1至約20%w/w。13.根據權利要求1至12中任一項所述的粒狀物質,其中聚合物或絡合劑與所述生物分子一起設置在所述粒子的孔隙中。14.根據權利要求13所述的粒狀物質,其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚賴氨酸或聚組氨酸,或者提供質子海綿效應的物質。15.一種用于制備粒子的方法,所述粒子在其孔隙中設置有生物分子,所述方法包括:a)組合:包含疏水液體、第一陶瓷前體和表面活性劑的疏水相;和包含親水液體、第二陶瓷前體和所述生物分子的親水相,以形成包含分散在所述疏水相中的所述親水相的液滴的乳液;和b)隨著所述粒子在所述液滴內形成時攪拌所述乳液;其中所述第一陶瓷前體包含能夠促進所述粒子滲入細胞中的官能團。16.根據權利要求15所述的方法,包括以下步驟:組合所述表面活性劑與所述疏水液體;和添加所述第一陶瓷前體,以形成所述疏水相,所述這些步驟在步驟a)之前進行。17.根據權利要求15或16所述的方法,其中所述第一陶瓷前體的官能團能夠與所述生物分子發生化學相互作用,例如發生靜電相互作用。18.根據權利要求15至17中任一項所述的方法,其中所述第一陶瓷前體是氨基官能陶瓷前體。19.根據權利要求18所述的方法,其中所述氨基官能陶瓷前體是氨基官能烷氧基硅烷。20.根據權利要求18或19所述的方法,其中所述氨基官能陶瓷前體包含氨基烷基烷基。21.根據權利要求20所述的方法,其中所述氨基官能陶瓷前體是3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷,或者這些中的任意兩種以上的混合物。22.根據權利要求15至21中任一項所述的方法,其中所述表面活性劑的HLB為約8至約16。23.根據權利要求15至22中任一項所述的方法,其中所述疏水液體的粘度為約0.5至約15000mPa.s。24.根據權利要求15至23中任一項所述的方法,其中所述疏水液體包括石蠟油、植物油或礦物油。25.根據權利要求15至24中任一項所述的方法,其中所述第一陶瓷前體是堿并且所述親水相的pH低于所述第一陶瓷前體的pK。26.根據權利要求25所述的方法,包括以下步驟:組合所述親水液體和所述第二陶瓷前體;將所述pH調節至低于所述第一陶瓷前體的pK;和添加所述生物分子,以形成所述親水相,所述這些步驟在步驟a)之前進行。27.根據權利要求26所述的方法,其中調節所述pH的步驟包括將所述第二陶瓷前體在所述親水液體中的溶液暴露于陽離子交換樹脂,接著一旦所述溶液的pH已達到低于所述第一陶瓷前體的pK的期望pH時將所述溶液與所述樹脂分離。28.根據權利要求15至27中任一項所述的方法,其中所述親水液體是水性的。29.根據權利要求15至28中任一項所述的方法,其中所述第二陶瓷前體包括水玻璃或膠體二氧化硅或者預先水解的烷氧基硅。30.根據權利要求15至29中任一項所述的方法,其中所述生物分子帶負電或足夠大以至它不能通過所述粒子的孔隙。31.根據權利要求30所述的方法,其中所述生物分子包括RNA、反義核苷酸、和反義引物、適體、DNA、蛋白質、糖蛋白、多肽、碳水化合物或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。32.根據權利要求31所述的方法,其中所述生物分子包括siRNA。33.根據權利要求15至32中任一項所述的方法,另外包括:c)在形成所述粒子后向所述乳液中添加表面處理劑以對所述粒子進行表面處理。34.根據權利要求33所述的方法,其中所述表面處理劑包括偶聯至結合基團的聚乙二醇鏈,所述結合基團能夠將所述聚乙二醇鏈結合至所述粒子的表面。35.根據權利要求34所述的方法,其中所述表面處理劑是PEG-硅烷,如三烷氧基甲硅烷基-PEG。36.根據權利要求33至35中任一項所述的方法,其中所述表面處理劑包含用于靶向患者中的靶標的定位基團。37.根據權利要求36所述的方法,其中所述表面處理劑包括包含在所述PEG距離所述三烷氧基硅烷基的遠端處的定位基團的三烷氧基甲硅烷基-PEG。38.根據權利要求15至37中任一項所述的方法,其中添加聚合物或絡合劑以使其與生物分子設置在所述粒子的孔隙內。39.根據權利要求38所述的方法,其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚賴氨酸、或聚組氨酸,或提供質子海綿效應的物質。40.一種用于制備包含設置在孔隙中的生物分子的粒子的方法,所述方法包括:a)組合:包含疏水液體和表面活性劑的疏水相;和包含親水液體和催化劑的親水相,以形成包含分散在所述疏水相中的所述親水相的液滴的乳液;b)向所述乳液中添加陶瓷前體并水解所述陶瓷前體;c)將所述親水相的pH調節至適合所述生物分子的范圍;d)將所述生物分子和官能化的陶瓷前體添加到所述乳液中;和e)在所述粒子在所述液滴內形成時攪拌所述乳液,其中所述官能化的陶瓷前體包含能夠促進所述粒子滲入細胞中的官能團。41.根據權利要求40所述的方法,其中所述官能化的陶瓷前體的所述官能團能夠與所述生物分子發生化學相互作用,例如發生靜電相互作用。42.根據權利要求40或41中任一項所述的方法,其中所述官能化的陶瓷前體是氨基官能陶瓷前體。43.根據權利要求42所述的方法,其中所述氨基官能陶瓷前體是氨基官能烷氧基硅烷。44.根據權利要求42或43所述的方法,其中所述氨基官能陶瓷前體包含氨基烷基烷基。45.根據權利要求44所述的方法,其中所述氨基官能陶瓷前體是3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷,或者這些中的任意兩種以上的混合物。46.根據權利要求40至45中任一項所述的方法,其中所述表面活性劑的HLB為約8至約16,如壬基酚聚氧乙烯醚。47.根據權利要求40至46中任一項所述的方法,其中所述疏水相另外包含輔助表面活性劑,如醇,例如1-戊醇。48.根據權利要求40至47中任一項所述的方法,其中所述疏水液體包含烷烴如己烷(C6)至十二烷(C12),環烷烴如環己烷,芳烴如甲苯和苯,以及摻混物如煤油。49.根據權利要求40至48中任一項所述的方法,其中所述親水液體包含水冰清所述催化劑是酸。50.根據權利要求40至49中任一項所述的方法,其中所述生物分子帶負電或者足夠大使得它不能通過所述粒子的孔隙。51.根據權利要求50所述的方法,其中所述生物分子包括RNA、反義核苷酸、和反義引物、適體、DNA、蛋白質、糖蛋白、多肽、烴或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。52.根據權利要求51所述的方法,其中所述生物分子包括siRNA。53.根據權利要求40至52中任一項所述的方法,包括在添加所述生物分子和所述官能化的陶瓷前體之前,將所述乳液的pH調節至大于4,例如通過加入堿,如NaOH、KOH和NHOH。54.根據權利要求40至53中任一項所述的方法,另外包括:f)在形成所述粒子后向所述乳液中加入表面處理劑以對所述粒子進行表面處理。55.根據權利要求54所述的方法,其中所述表面處理劑包含偶聯至結合基團的聚乙二醇鏈,所述結合基團能夠將所述聚乙二醇鏈結合至所述粒子的表面。56.根據權利要求55所述的方法,其中所述表面處理劑所述PEG-硅烷,如三烷氧基甲硅烷基-PEG。57.根據權利要求54至56中任一項所述的方法,其中所述表面處理劑包含用于靶向患者中的靶標的定位基團。58.根據權利要求57所述的方法,其中所述表面處理劑包括包含所述PEG距離所述三烷氧基硅烷基的遠端處的所述定位基團。59.根據權利要求40至58中任一項所述的方法,其中添加聚合物或絡合劑以使其與所述生物分子一起設置在所述粒子的孔隙內。60.根據權利要求59所述的方法,其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚賴氨酸或聚組氨酸,或者提供質子海綿效應的物質。61.通過權利要求15至60中任一項所述的方法制備的粒子。62.一種藥物組合物,包含根據權利要求1至11中任一項的粒狀物質,或根據權利要求61的粒子,以及藥用載體、稀釋劑或賦形劑。63.一種治療哺乳動物的疾病、障礙或病癥的方法,包括向所述哺乳動物給藥根據權利要求1至11中任一項所述的粒狀物質,或根據權利要求61的粒子或根據權利要求56所述的藥物組合物,從而治療所述疾病、障礙或病癥。64.根據權利要求1至11中任一項的粒狀物質或根據權利要求61的離子,用于治療哺乳動物的疾病、障礙或病癥。

說明書

技術領域

本發明涉及用于遞送生物分子的包含陶瓷粒子的粒狀物質,以及制備其的方法。更具體地,本發明涉及包含帶有官能團的陶瓷基質的粒子的粒狀物質,其具有設置在所述粒子的孔隙內的可釋放生物分子。

背景技術

siRNA和基因療法的使用代表衛生保健的一個潛在主要進步。它顯示治療一系列當前非可治愈疾病如囊性纖維化、一些癌癥以及免疫疾病如1型糖尿病、多發性硬化等的潛力。然而,對于保護siRNA在體內免于酶降解直至遞送至作用部位以提供有效療法存在需要。

目前,siRNA療法昂貴。對于這樣的昂貴療法的主要市場主要在更發達的國家。對于基因療法的全球市場估計為>US$5B。

開發siRNA療法至臨床使用的主要挑戰包括:

·保護活性材料免于酶降解;

·使活性材料能夠進入靶細胞(良好滲透);

·活性材料從包封劑中釋放到細胞質(內含體逸出);

·確保擊倒基因的能力(優選具有在nM濃度的效力);和

·實現低毒性(大治療窗)。

siRNA為中間尺寸化(約14kDa,3nm直徑,10nm長度)、親水性、帶強負電的分子。它們是化學和生物不穩定的,除非被修飾以增強穩定性。為了實現臨床效果,siRNA必須能夠越過細胞膜并且存在于靶細胞群的胞質中。

在過去,病毒載體已被開發以遞送RNA或DNA。然而,這些存在免疫反應的風險并且很難進行實踐。各種非病毒載體(例如脂質復合物,陽離子聚合物復合物,脂質體,樹枝狀聚合物,聚合物納米粒子)也已被開發。這些提供了一系列問題,包括用siRNA實施的困難,siRNA和載體之間的相互作用,以及siRNA暴露于體內降解。尤其是,設計各種系統用于將DNA或RNA吸附到納米粒子的表面上。然而,這些通常存在所吸附分子在遞送至作用位點之前經受酶攻擊,由此降低治療的有效性的缺點。

盡管上述討論主要涉及siRNA和DNA,但是所討論的問題不限于siRNA和DNA。它們潛在地應用于廣泛的期望進行細胞內遞送的生物分子,包括例如肽、蛋白質等。因此對于這些問題的方案可以更廣泛地適用。本發明的應用因此不應認為局限于siRNA。

有利地,本發明基本上克服或至少改善上述缺點中的一個或多個并且至少部分地滿足上述需要。

發明內容

根據本發明的一個方面,提供了一種粒狀物質,包含:

帶有官能團的陶瓷基質的粒子,上述官能團能夠促進所述粒子滲入細胞;和

設置在所述粒子孔隙內的生物分子,所述生物分子通過溶解所述陶瓷基質從所述粒子可釋放。

如本文中使用的,提及生物分子被“設置在粒子的孔隙內”用于在其范圍內包括其中有效形成固體多孔粒子的陶瓷基質具有分散在整個陶瓷基質的孔隙中或設置在陶瓷基質的孔隙中的生物分子的實施方式。這不用于包括其中生物分子附著或結合至粒子的外表面的情形。

通常,除了可能在相對極端條件下之外,生物分子在沒有溶解陶瓷基質下通過浸析基本上從所述粒子是不可釋放的。在該方面,如本文中使用的,提及生物分子“在沒有溶解陶瓷基質下通過浸析基本上從所述粒子是不可釋放的”用來在其范圍內包括在提出的儲存條件下浸析并使用粒狀物質。優選地,所述官能團與生物分子相互作用以基本上防止浸析。

優選地,所述官能團均勻地分布在整個粒子中。

根據本發明的一個實施方式,帶有官能團的陶瓷基質包括官能化的二氧化硅基質。然而,一系列金屬氧化物包括混合金屬氧化物可以是合適的,例如二氧化鈦、氧化鋁、氧化鋯、氧化鐵、二氧化鈰、氧化鋅等。所述官能團也可以通過有機二氧化鈦或有機-氧化鋁提供,或者通過將與另一種金屬前體共縮聚以形成有機二氧化鈦二氧化硅或有機-鋁-二氧化硅的有機-硅烷提供。進一步的實施方式從以下涉及粒子制備的討論將被理解。

陶瓷基質的官能團可以包括有效促進粒子滲入細胞的任何基團。例如,這可以包括氨基。在一個優選實施方式中,官能團包括氨基烷基烷基、伯烷氨基、仲烷氨基和叔烷氨基、烷基咪唑基、烷基酰胺基或烷基氨基酸基團、進一步的實施方式從以下涉及粒子制備的討論將被理解。

本發明涉及一種包含生物分子的粒狀物質。在此上下文中,術語“生物分子”可以指生物學起源或性質并且具有生物學活性的物質。該術語在其范圍內包括包含一種或多種分子(包括不同分子的混合物)的物質。它的分子量可以為約1至約1000kDa以上,或約1至約100,1至50,1至20,1至10,5至1000,10至1000,100至1000,500至1000,5至100,5至50,5至20或10至20kDa,例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000kDa。在一些情況下,它的分子可以低于1kDa或大于1000kDa。它的直徑可以為約0.5-20nm,或約1至20,2至20,5至20,10至20,0.5至10,0.5至5,0.5至2,0.5至1,1至10,2至10,1至5,5至10或10至20nm,例如約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20nm。

生物分子可以根據討論的具體應用進行選擇。為了實現將生物分子保持在粒子之中和/或之上,它可以帶負電。這可以使得生物分子能夠結合至陶瓷基質上的官能團,例如結合至氨基官能陶瓷基質的質子化胺基團。替代地或另外地,生物分子可以具有使其能夠結合至陶瓷基質的官能團的其他官能度。替代地或另外地,生物分子可以足夠大(即,具有足夠大的分子量或分子體積)以使其物理地被捕獲在粒子中。它可以足夠大使其不能通過粒子的孔隙。

在某些實施方式中,生物分子可以是核酸如RNA,例如siRNA(小干擾RNA)、miRNA(微小RNA)或核酶、ASODN(反義核苷酸或反義RNA)、DNA分子、適體、蛋白質包括多肽、肽、糖蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白(例如抗體和抗體片段)、碳水化合物、脂質或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。在一個特定實施方式中,生物分子是siRNA。生物分子可以指示用于預防性或治療性治療疾病、障礙或病癥。

在一些實施方式中將表明處理劑結合至粒子的表面將是有利的。在一個優選實施方式中,聚乙二醇(PEG)鏈偶聯至粒子的表面。替代地或另外地,定位基團(靶向基團,targeting?group)可以偶聯至粒子的表面以有利于在應用中將粒子靶向靶標,例如腫瘤或特定器官或其他靶標。在某些實施方式中,在其遠端具有定位基團的PEG鏈可以偶聯至粒子。

在某些實施方式中,可以優選粒狀物質的粒子的平均粒度為約0.1至約1微米。然然,它們的平均粒度可以為約0.1至10微米,或約0.1至5,0.1至2,0.1至1,0.1至0.5,0.2至10,0.5至10,1至10,2至10,5至10,0.2至2,0.2至1,0.2至0.5,0.5至2或0.5至1微米,例如約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10微米。

在一些實施方式中,可以優選所述平均粒度小于約0.1微米。例如,它可以為約20至100nm(0.1微米),或約20至50nm,或約50至100nm,例如約20、30、40、50、60、70、80或90nm。

注意的是,尺寸高于約1-2微米的粒子可能不適合細胞內遞送。然而,認為它們可以可用于在身體內其他地方遞送更大的蛋白質。在該方面,多達幾微米的粒子可以被內化,尤其通過專化吞噬細胞。

粒子可以基本上是單分散的或者可以存在一些聚集以形成粒度分布曲線中的第二峰。分布曲線可以為正態、高斯或一些其它分布。粒子可以具有寬粒度分布或中度或窄粒度分布。粒子可以為球形或大致球形,或可以為卵形或扁球形或多面體(具有例如8至約60邊)或可以為一些其它形狀。它們的形狀可以是不規則的。

粒子可以為中孔性的(即<100nm孔徑)。它們可以為微孔性的(即<1.7nm孔徑)。優選地,粒子的平均孔徑為約1至約50nm。例如,平均孔徑可以為約1至20,1至10,5至50,10至50,20至50,5至20,5至10或10至20nm,例如約1,2,3,4,5,10,15,20,25,30,35,40,45或50nm。

孔隙結構可以包括互連孔隙,或者可以包括通過相對較小互連通道結合的孔穴。孔徑可以足夠小以便通過從孔隙擴散而基本上防止生物分子釋放。替代地,如果孔徑使得生物分子可以逃逸,則生物分子可以通過吸引至孔隙表面上的官能團而被保留。官能團可以與促進粒子滲入細胞的那些官能團相同或不同。

粒子的生物分子的裝載量為約1至約20%w/w,例如,約1至10,1至5,1至2,2至20,5至20,10至20,2至10,2至5或5至10%,例如約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20%,盡管在一些情況下,它可以低于1%或可以大于20%。

使用中,生物分子有利地通過在基本上不降解生物分子的條件下溶解粒子而可釋放。例如,它可以通過基本上不降解生物分子的生物介質溶解粒子而可釋放。它可以替代地在適當釋放液體中稀釋時可釋放。

通常,生物分子在約0.5至約50小時時間內可釋放(例如基本上完全可釋放)。例如,約0.5至20,0.5至10,0.5至5,0.5至2,1至50,5至50,10至50,1至20,1至10,2至10或5至10小時,例如約0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45或50小時。由于溶解速率可能依賴于粒子的大小,所以此速率可以如在后面描述中討論的通過調節粒子的大小而進行調節。

最有利地,當粒子暴露于降解劑例如酶時,生物分子在其從粒子釋放之前被保護以免于降解,否則所述降解劑將能夠降解該生物分子。即,生物分子通過陶瓷基質被保護免于降解。

在一些實施方式中,考慮了聚合物或絡合劑可以與生物分子一起設置在粒子的孔隙中以促進內含體逃逸。通常該聚合物可以是聚乙烯胺、聚賴氨酸、或聚組氨酸或者提供質子海綿效應的任何物質。

微粒(>100nm)的形成

在一些實施方式中,可以有利地在微觀級上形成粒子。即,用于此描述的目的,粒子的平均粒度大于100nm。

根據本發明的另一方面,提供了一種用于制備包含設置在孔隙中的生物分子的粒子的方法,所述方法包括:

a)組合:

包含疏水液體、第一陶瓷前體和表面活性劑的疏水相;和

包含親水液體、第二陶瓷前體和生物分子的親水相,

以形成包含分散在疏水相中的親水相的液滴的乳液;以及

b)當粒子在所述液滴內形成時攪拌該乳液;

其中第一陶瓷前體包含能夠促進粒子滲入細胞的官能團。

如本文中使用的,術語“攪拌”在其范圍內包括任何形式的攪拌,包括但不必限于攪動、振蕩、渦旋、聲處理、剪切等,以及這些的任意組合。

在制備粒子中,通過組合疏水相和親水相而形成乳液。這可以是油包水(w/o)乳液,其中疏水相表示連續相而親水相表示分散或不連續相。

疏水相可以是親油相或親脂相。疏水相可以通過組合表面活性劑和疏水液體并添加第一陶瓷前體以形成疏水相而制備,或者它可以通過組合所有三種組分而制備,或者它可以通過組合第一陶瓷前體和疏水液體或表面活性劑之一然后添加另一種而制備。這些步驟優選在組合疏水相和親水相之前進行。每個組合步驟可以包括攪拌已經組合的組分。攪拌可以包括包括攪動、振蕩、渦旋、聲處理或這些的組合。對于這些組分它足以形成溶液。因此疏水相可以表示第一陶瓷前體和表面活性劑在疏水液體中的溶液。

疏水相包含3種組分:

疏水液體–這可以例如是植物油、石蠟油、礦物油或一些其它合適疏水液體。它可以包括疏水組分的混合物,例如植物油的混合物或植物油和石蠟油的混合物。它通常是中度粘度,例如約0.5至約1500mPa.s,或約0.5至1000,0.5至500,0.5至250,0.5至100,0.5至50,0.5至20,0.5至10,0.5至5,0.5至1,1至1500,10至1500,100至1500,250至1500,500至1500,1000至1500,10至1000,10至200,200至1000或200至500mPa.s,例如約0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,150,200,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400或1500mPa.s,呼和在一些情況下,大于1500mPa.s。疏水液體的粘度可以被使用以控制通過該方法制造的粒子的粒度。因此更粘稠的疏水液體通常將提供更粘性的疏水相,這通常又將提供更小的粒度。

表面活性劑–這可以是用于支持油包水乳液的合適表面活性劑。它可以在疏水液體中可溶或與其混溶。它可以是非離子表面活性劑或者它可以是陰離子表面活性劑或者它可以是兩性離子表面活性劑。它的HLB可以為約8至約16,或約8至12,10至16或8至10,例如約8,9,10,11,12,13,14,15或16。合適的表面活性劑包括(單月桂酸山梨醇酐酯)、(雙(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉)、混合物和混合物。使用混合表面活性劑通常提供非常細的乳液,但最終粒度通常不變。

第一陶瓷前體–這個組分包括能夠促進所得粒子滲入細胞的官能團。在某些實施方式中,第一陶瓷前體的官能團能夠與生物分子化學地相互作用,例如靜電地相互作用。

這個組分可以例如是氨基官能的。替代地,可以使用其他帶正電荷基團或可以導致帶正電荷的基團。它可以是每個分子具有至少一個胺基并且能夠轉化成氨基官能陶瓷基質的化合物。在疏水液體中或者在該疏水液體中的表面活性劑的混合物(可選地溶液)中,它可以是可溶的。

合適的陶瓷前體包括氨基官能硅烷,尤其是氨基官能烷氧基硅烷。這些硅烷的烷氧基可以例如是C1至C6烷氧基(如果C3以上,其可以是支化的),通常C1至C4烷氧基,例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基或丁氧基。在一些情況下,可以使用其他可水解基團,例如酰氧基、酮肟基、烯醇氧基等。氨基官能陶瓷前體每個分子可以具有多于一個的胺基,例如2,3,4或5個胺基/分子。本發明的發明人已發現二氨基-和三氨基-陶瓷前體通常產生在結合合適生物分子方面比相應單氨基-陶瓷前體更有效的粒子。每個胺基可以獨立地是伯、仲或叔的。在優選的前體中,氨基被連接基團分隔開,該連接基團通常是短亞烷基鏈如亞乙基(-CH2CH2-)、亞丙基(-CH2CH2CH2-)或亞丁基(-CH2CH2CH2CH2-)鏈。本發明的發明人認為亞丁基可以是特別有用的,因為這個基團出現在天然多胺多核苷酸配體如腐胺(N-4-N)、亞精胺(N-3-N-4-N)和精胺(N-3-N-4-N-3-N)中。涉及亞戊基和亞己基的各種組合也可以是有用的,然而生源構型極不相同的基團可能潛在地是有毒的。尤其是,本發明的發明人認為,亞乙基間隔物提供的胺基團之間的距離可接受地接近siRNA中的電荷間隔并且存在于可商購產品中,使得這種間隔物示于在生物分子是siRNA時使用。因此,合適的前體包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷及其任意兩種以上的混合物。可以用作第一陶瓷前體的其他化合物包括脲丙基三烷氧基硅烷、異氰酸酯官能烷氧基硅烷、羧基官能烷氧基硅烷、巰基官能烷氧基硅烷(例如巰丙基三烷氧基硅烷)、陽離子肽或接枝到烷氧基硅烷的碳水化合物或脂質等。也可以使用這些中的任意兩種以上的混合物,或任何其他合適第一陶瓷前體的混合物。

在一些情況下,第一陶瓷前體可以是混合物。它可以是硅烷陶瓷前體的混合物。它可以另外包含一種或多種非-硅烷陶瓷前體,例如氧化鋯前體、氧化鋁前體或二氧化鈦前體。這些可以例如分別是烷醇鋯、烷醇鋁和烷醇鈦。

通常表面活性劑對疏水液體的比率為約5至約25%w/v(即約5至約25g表面活性劑對100ml疏水液體)或約5至20,5至15,10至25,15至25或10至20%,例如約5,10,15,20或25%。

通常第一陶瓷前體對疏水液體的比率為約10至約1000ppm(基于v/v),或約10至500,10至200,10至100,10至50,20至1000,50至1000,100至1000,200至1000,500至1000,20至500,50至500,50至200,200至500或50至200ppm,例如約10,20,304,50,60,70,80,90,100,150,200,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900或1000ppm。

親水相可以是疏油相。它可以是含水相。親水相包含三種組分:

親水液體–這可以是疏脂的。它通常是含水的,例如,它可以是水,包括純水,或水溶液。它還可以包含溶解鹽。

第二陶瓷前體–這可以是水溶性硅酸鹽,特別是偏硅酸鹽。它可以是硅酸鹽本身(例如通過水解四烷基硅酸鹽如四甲基原硅酸鹽或四乙基原硅酸鹽),或者可以是具有式RSi(OR’)xOHySiz的物質,其中x+y+z=3(在本文中稱為烷基硅酸鹽,例如通過水解烷基三烷氧基硅烷例如甲基三甲氧基硅烷或乙基三甲氧基硅烷產生)。在烷基硅酸鹽的情況下,烷基R應足夠小或者足夠親水以使第二陶瓷前體是水溶性的。應理解,這可以例如用小R基團如甲基或乙基,或者具有親水或極性取代基如羥基、硝基、硫酸根等的較大R基團實現。

第二陶瓷前體可以例如是水玻璃。水玻璃是通常在水溶液中的具有經驗式約Na2SiO3的低聚或聚合硅酸鹽材料,具有變化的水合度。水玻璃的固含量可以為約1至約20%,或約1至10,1至5,1至2,2至20,5至20,10至20,2至10,2至5或5至10%,例如約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20%。這可以具有在水中的約25至約30%二氧化硅和約1至約20%氫氧化鈉。它可以在水中以約1:2至約1:10的因子稀釋,或約1:2至1:5,1:5至1:10或1:3至1:8,例如約1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9或1:10。

第二陶瓷前體也可以是烷醇鈦(例如乙醇化物,正丙醇化物或異丙醇化物,正丁醇化物、仲丁醇化物和叔丁醇化物)或醇化鋁或醇化鋯或改性金屬醇化物(例如用乙酰基丙酮或乙酸改性)。它還可以是混合金屬醇化物。它還可以另一種金屬鹽如鎂鹽、鋯鹽和鋁鹽以形成硅酸鎂、硅酸鋁等。它可以是預先水解的烷氧基硅。

第二陶瓷前體可以包括陶瓷膠體,例如膠體二氧化硅。陶瓷膠體的粒徑可以低于50nm,或低于約40,30,20或10nm,或為約5至約50nm或為約5至20,5至10,10至50,20至50或10至20nm。它的粒徑(通常是平均粒徑但可選地是最大粒徑)可以為約5,10,15,20,25,30,35,40,45或50nm。

在一些情況下,第二陶瓷前體可以包括以上選項的兩種以上的組合,例如它可以包括水硅酸鹽與膠體二氧化硅的混合物。

生物分子–對于生物分子的各種選擇如上所述。如注意到的,這可以帶負荷或者可以為中性電荷。它可以帶足夠負電荷以被吸引至,可選地結合至粒子的官能團(衍生自第一陶瓷前體)。它可以是或者它可以包括RNA,例如siRNA(小干擾RNA)、miRNA(微小RNA)、ASODN(反義核苷酸或反義RNA)、適體、DNA、蛋白質、糖蛋白、多肽、碳水化合物或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。

另外,可以添加聚合物或絡合劑以使其與生物分子一起設置在粒子的孔隙內以促進內含體逃逸。通常該聚合物可以是聚乙烯胺、聚賴氨酸或聚組氨酸或提供質子海綿效應的任何物質。

親水相可以是酸性的。它的pH可以抵御第一陶瓷前體的pKa(如果該陶瓷前體是堿,例如氨基官能陶瓷前體,則其共軛酸的pKa)。親水相的pH可以低于約10.5,或低于約10,9,8,7,6,5.5,5,4.5或4,或為約3至10.5,5至10.5,7至10.5,9至10.5,7至10,9至4,7至4,9至7,5至7,3至6,或約3至5,3至4,4至6,4至5或3.5至4.5,例如約3,3.5,4,4.5,5,5.5或6。

通常在制備親水相中,親水液體和第二陶瓷前體組合,可選地第二陶瓷前體溶解在親水液體中。所述方法可以隨后包括將pH調節至低于第一陶瓷前體的pKa的pH,例如低于約10.5的pH,或調節至酸性pH,例如至低于約7、或低于約5、或低于約4的pH,以及添加生物分子以形成親水相。例如,在第二陶瓷前體是水玻璃或膠體二氧化硅的情況下,這通常導致堿性溶液。因此所述方法大可以包括酸化這種溶液。

酸化可以通過將溶液暴露于陽離子交換樹脂而方便實現,其中在所述暴露之前,樹脂處于其酸(質子化)形式。暴露可以包括組合樹脂和溶液,可選地攪拌所得混合物,然后將樹脂與酸化溶液分離(例如通過過濾、傾析、離心等),或者它可以包括使溶液通過樹脂的床。樹脂對第二陶瓷前體的比率可以為使得期望pH(如上所述)被實現。替代地,第二陶瓷前體可以通過加入酸化劑(例如酸)或加入合適緩沖液進行酸化。

通常生物分子在親水相和疏水相組合之前不久添加到酸化溶液中。它可以在它們組合之前立即添加。它可以在它們組合之前少于約2分鐘,或者在它們組合之前少于約1分鐘,或少于約50,40,30,20,15或10秒添加。這減少了發生生物分子的不利化學反應的可能性。生物分子可以以足夠量存在于親水相中以實現最終粒子中的期望裝載量。親水相中生物分子的典型濃度為約1至約10mg/ml,或約1至5,5至10或2至8,例如約1,2,3,4,5,6,7,8,9或10mg/ml。生物分子可以溶液形式的添加到組合的親水液體/第二陶瓷前體中。用于這種溶液的溶劑應與親水液體混溶,并且通常與親水液體相同。生物分子可以添加到水溶液中。

在形成乳液過程中,疏水相和親水相組合,可選地在攪拌下。攪拌可以包括攪動、振蕩、渦旋和聲處理中的一種或多種。制備乳液的一種有效方式是制備如上所述的疏水相并在制備中使其同時攪動和聲處理以添加親水相。親水相然后通過組合生物分子與該組合的第二陶瓷前體和親水液體(例如酸化的水玻璃水溶液)制備,并且將所得親水相盡可能快速地添加到該聲處理、攪動的疏水相,同時維持聲處理。聲處理可以在添加后持續短時間,例如約10至約120秒,或約10至60,10至30,20至120,60至120,20至60或20至40秒,例如約10,20,30,40,50,60,90或120秒。聲處理通常在適當時間后關閉以防止乳液過熱。這樣的過熱例如可能不利地影響生物分子。聲處理可以以約200至2000W,或約200至1000,200至500,500至2000,1000至2000,500至1000或600至800W,例如約200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1200,1400,1600,1800或2000W的功率進行。

疏水相對親水相的比率可以為約10至約50(即約10:1至約50:1),或約10至40,10至30,10至20,20至50,30至50,40至50,20至40或25至25,例如約10,15,20,25,30,35,40,45或50。

第一陶瓷前體對第二陶瓷前體的摩爾比為約0.2至約20mol%,或約0.5至20,1至20,2至20,5至20,10至20,0.2至10,0.2至5,0.2至2,0.2至1,1至10,1至5或5至10,例如約0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20mol%可以是足夠的。在第一陶瓷前體是或包括氨基官能硅烷的情況下,第一陶瓷前體對第二陶瓷前體的比率可以變化以改變粒子上的電荷。因此如果該量低(例如相對于第二陶瓷前體為約1mol%),則粒子將大致為中性電荷,而如果該量更高(約10mol%),則它們將帶正電荷。如果沒有添加(或極低量,例如低于約0.5mol%)氨基官能硅烷,則粒子可能帶負電荷。

在如上所述制備的乳液中,親水相的液滴的平均直徑可以為約0.1至約10微米,或約0.1至5,0.1至2,0.1至1,0.1至0.5,0.2至10,0.5至10,1至10,2至10,5至10,0.2至2,0.2至1,0.2至0.5,0.5至2或0.5至1微米,例如約0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,6,7,8,9或10微米。該平均值可以是數均直徑或重均直徑。液滴可以基本上是單分散的或者可以有一些聚集以形成分布曲線中的第二峰。液體可以具有寬粒度分布或中度或窄粒度分布。

認為粒子通過第一和第二陶瓷前體的相互作用形成在液滴內部。前體縮合形成粒子通常非常快速(幾微秒至幾秒)。所述相互作用可以是反應。它可以是縮合。它可以包括水解第一陶瓷前體。已經觀察到,如果第一陶瓷前體是氨基官能的并且直接添加到親水相中,則發生快速凝膠化使得適當尺寸化粒子的形成被阻止。

組合的親水相和疏水相可以攪動或其他方式攪拌足夠時間以形成粒子。這可能至少部分地取決于反應溫度。粒子形成可以在任何合適溫度下進行,例如室溫,或約10至約35°C,或約10至30,10至25,10至20,15至35,20至35,25至35,15至30,15至20或20至25°C,例如約15,20,25,30或35°C。它可以在低于生物分子變性溫度的溫度下進行。粒子的形成可能花費約10至約120分鐘,盡管如果期望,組合的相可以攪動或其他方式攪拌比這更長的時間。合適的時間為約10至100,10至60,10至30,20至120,30至120,60至120,30至90或45至75分鐘,例如約10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,105,110,115或120分鐘。

一旦粒子已形成,它們可以被表面官能化。這可以原位實現,即不用分開或分離粒子。它可以包括在粒子形成之后向乳液中添加表面處理以表面處理粒子。表面官能化可以是PEG化(即向表面添加聚乙二醇鏈)。表面處理劑可以包括偶聯至結合基團的聚乙二醇(PEG)鏈。PEG鏈的分子量可以為約1至約20kDa,或約1至10,1至5,1至2,2至20,5至20,10至20,2至10,2至5或5至10kDa,例如約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20kDa。結合基團可以是三烷氧基硅烷,即表面處理劑可以是三烷氧基甲硅烷基PEG。合適的烷氧基包括甲氧基、乙氧基或丙氧基。其他可水解甲硅烷基也可以使用,例如三乙酰氧基、三肟基、三烯醇氧基、三酰胺基等。粒子的表面可以通過使表面與具有官能團的PEG(或其他合適的分子)反應而官能化,該官能團與表面的OH反應或整合到粒子內部和表面處的氨基發生反應。例如,羧基官能PEG表面處理劑可以用來與粒子上的表面胺基團形成酰胺,或表面胺基團可以被活化(例如通過形成琥珀酰亞胺基或異硫氰酸酯基),然后與氨基官能PEG表面處理劑反應。

PEG基團通常大(典型地>1KDa)使得它們不滲入球體內部而主要接枝到粒子的表面。一系列功能性PEG可商購獲得,其適用于這種接枝,例如異硫氰酸酯-改性PEG和羧基-改性PEG,其在與粒子表面上的胺反應時將產生酰胺鍵。

隨后的表面官能化,例如PEG化,以官能化粒子的表面,可以限于但足夠在堿性條件中。在堿性條件中,第一陶瓷前體(例如氨基硅烷如氨基乙基氨基丙基三乙氧基硅烷)在一些情況下可以直接添加到第二陶瓷前體(例如水玻璃或膠體二氧化硅)。在一些情況下,親水相的pH不低于第一陶瓷前體的pKa。在這樣的情況下,初始形成的粒子懸浮液(在堿性條件下形成)可以隨后被酸化。如果生物分子帶負電荷,這可以用于促進生物分子附著至粒子。如果粒子隨后進行表面處理,則酸化可以在隨后的表面處理之前或期間進行以有利于PEG-硅烷附著。在粒子上不存在正電荷的情況下,生物分子的釋放可以是非常快速的(幾分鐘數量級),除非它足夠大而阻止其逃逸通過粒子的孔隙。

在一些情況下,表面處理劑可以包含用于靶向患者中的靶標的定位基團。例如,表面處理劑可以包含具有在PEG遠端處的定位基團的三烷氧基甲硅烷基-PEG,即它可以具有結構三烷氧基甲硅烷基-PEG-定位基團。靶標可以例如是腫瘤或特定器官或一些其它靶標。定位基團可以例如是抗體或抗體片段(例如Fab)。合適定位基團的實例包括抗體、肽細胞因子、肽激素、基質蛋白質、細胞表面受體、細胞粘附中涉及的蛋白質、細胞識別中涉及的蛋白質、細胞運動性中涉及的蛋白質、細胞募集中涉及的蛋白質、細胞分化中涉及的蛋白質、疾病識別中涉及的蛋白質、生物活性碳水化合物如肝素和相關物質,生物活性糖蛋白包括但不限于落入以上所列類別中的那些,上述類別的任何成員的配體、上述類別的任何成員的片段、上述類別的任何成員的類似物、共享上述類別的任何成員的親和性或功能的低分子量物質,其他低分子量生物分子如激素、營養物、藥物、毒素、神經遞質、內分泌遞質、自分泌和旁分泌遞質、顏料、脂質、油類、離子配體、代謝物、分解代謝物等。

表面處理劑可以直接添加至疏水相中的粒子的懸浮液中。反應可以在大約環境溫度下進行,例如通過攪動適當時間以實現反應。合適時間為約8至約24小時,或約8至16,8至12,12至24,18至24或12至18小時,例如約8,12,16,20或24小時。可以使用足夠的表面處理劑以實現適當水平的表面官能化,例如在使用中足以防止過多粒子聚集或足以提供粒子至靶標的可接受的靶向。

一旦粒子已形成,通常它們不被徹底干燥。這抑制粒子的聚集,如果發生聚集,則它將需要再懸浮,其在一些情況可能很難。通過粒子通過離心分離自溶液。合適的條件為約10000至約50000rpm,或約10000至30000,30000至50000或20000至30000rpm,例如約10000,20000,30000,40000或50000rpm。合適的分離通常在約5至15分鐘內實現,盡管有時可以使用更長時間的離心。

所得粒子可以洗滌以除去雜質。洗滌過程可以涉及將粒子再懸浮在溶劑中,使粒子至少部分地與溶劑分離(例如通過沉淀和/或通過離心)并將溶劑從粒子潷析。重要的是,溶劑是不使生物分子變性的溶劑。這可以是對所使用的特定生物分子是特異的。例如,乙醇不影響DNA或RNA的結構,但可以使大多數大蛋白質變性。用于洗滌的合適溶劑包括烴類如己烷、環己烷、甲苯等,以及醇類如乙醇或異丙醇。粒子可以用相同溶劑或不同溶劑洗滌多次(例如2,3,4或5或更多次)。

所得粒子可以再懸浮在合適溶劑中并作為懸浮液儲存在該溶劑用于以后使用。如果粒子要遞送至患者,則這種溶劑可以是臨床可接受的溶劑。用于儲存的合適溶劑是遺傳。通常粒子的儲存溫度為約-210至約+10°C,或約-210至0,-90至0,-210至-100,-210至-65,-90至-30,-30至0,-30至-10,-20至+10,-10至+10,0至10或0至5°C,例如約-210,-200,-180,-160,-140,-120,-100,-90,-80,-70,-60,-50,-40,-30,-25,-20,-15,-10,-5,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9或10°C。它們可以儲存在約液氮溫度。它們可以儲存在干冰溫度。它們可以儲存在冷凍機或冰箱中。

在上述段落中,提及乙醇,乙醇包括包含多達約30%水。因此乙醇可以是約70至約100%乙醇,剩余可以是水,或約80至100,90至100,70至90或80至90%,例如約70,80,90或100%乙醇。異丙醇、正丙醇或正丁醇也可以代替乙醇,對水含量具有類似限制。使用乙醇或丙醇的優點是它對用于遞送至患者或對于其中無菌性是有益的其他應用提供無菌環境。在一些情況下,可以使用甲醇。

所述方法對于生物分子的包封效率(EE)優選高,因為生物分子通常昂貴。所述EE將取決于所述方法的精確性,包括例如第一陶瓷前體的類型和量、生物分子對所使用的陶瓷前體的比率等。通常所述方法將遞送大約約40%,或大于約50,60,70或80%的EE。所述EE可以例如為約40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90或95%。

在一個特定實施方式中,提供了一種用于制備包含生物分子的粒子的方法,所述方法包括:

a)組合:

包含疏水液體、氨基烷烷基官能三烷氧基硅烷和HLB胃約8至約16的表面活性劑的疏水相;和

包含水、處于pH5的水玻璃和生物分子的親水相,

以形成包含分散在疏水相中的親水相的液滴的乳液;以及

b)當粒子從液滴形成時攪拌所述乳液。

在另一個特定實施方式中,提供了一種用于制備包含生物分子的方法,所述方法包括:

組合HLB為約8至約16的表面活性劑和疏水液體并添加氨基烷氨基官能三烷氧基硅烷以形成疏水相;

組合水和水玻璃,將pH調節至低于約5并添加生物分子以形成親水相;

組合所述疏水相和親水相以形成包含分散在所述疏水相中的親水相的液滴;

當粒子從液滴形成時攪拌所述乳液;以及

在形成所述粒子后向所述乳液中添加表面處理劑以表面處理所述粒子。

在這個實施方式中,添加生物分子的步驟可以在組合疏水相和親水相步驟之前馬上(例如少于1分鐘)進行。生物分子可以是RNA或DNA或之前描述的其他生物分子。它可以是siRNA。

在上述實施方式的變形中,可以使用其他pH范圍代替低于約5。例如可以使用堿性條件如大于約8的pH。本發明的發明人認為范圍為約5至約8的pH也是可用的。其他可能的變形包括使用膠體懸浮液如膠體二氧化硅代替水/水玻璃組合。這些變形可以適用于相對較大生物分子如蛋白質的包封。

納米粒子(<100nm)的形成

在各種實施方式中,可以有利地在較小數量級,特別是尺寸小于100nm上形成粒子。考慮了這可以在一些情況下提供更有效的生物分子遞送。

因此,本發明還提供一種用于制備包含設置在其孔隙內的生物分子的粒子的方法,所述方法包括:

a)組合:

包含疏水液體和表面活性劑的疏水相;和

包含親水液體和催化劑的親水相,

以形成包含分散在疏水相中的親水相的液滴的乳液;

b)向乳液中添加陶瓷前體并水解該陶瓷前體;

c)將親水相的pH調節至適用于生物分子的范圍;

d)向乳液中添加生物分子和官能化陶瓷前體;以及

e)當粒子在液滴內部形成時攪拌乳液,

其中所述官能化陶瓷前體包含能夠促進粒子滲入細胞的官能團。

關于制備微粒的許多上述特征和實施方式可以同樣適用于本發明的這個方面。同樣,這些特征和實施方式通過引用具體地結合于此以避免不必要的重復。在該方面,依照本發明這個方面描述的官能化陶瓷前體對應于上述第一陶瓷前體。依照本發明這個方面描述的陶瓷前體對應于上述第二陶瓷前體。

盡管并入上述特征實施方式,尤其是本發明的實施方式,官能化陶瓷前體的官能團能夠與生物分子化學地相互作用例如靜電地相互作用。例如,官能化陶瓷前體可以是氨基官能陶瓷前體,如氨基官能烷氧基硅烷。在某些實施方式中,氨基官能陶瓷前體包含氨基烷基烷基。例如,氨基官能陶瓷前體可以包含3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷、或這些中的任意兩種以上的混合物。

表面活性劑的HLB同樣可以為約8至約16。已發現利用壬基酚聚氧乙烯醚可以實現良好結果。疏水相可以另外包含輔助表面活性劑,如醇,例如1-戊醇。

在制備納米粒子的情況下,認為粘度不是關鍵,因為形成微乳液(與正常乳液相反),其是熱力學穩定的并且由極小(≈10nm)液滴構成。

在某些實施方式中,疏水液體包含烷烴(例如己烷(C6)至十二烷(C12)),環烷烴如環己烷,芳烴(例如甲苯,苯)和摻混物如煤油。

親水相包含親水液體和催化劑。例如,親水液體可以包含水并且催化劑可以是酸。更通常地,用于水解烷氧基硅的典型催化劑可以是酸或堿,氟化物或其他金屬醇化物例如醇化鈦。

生物分子是如上所述的。例如,它可以帶負電荷或足夠大以使其不能通過粒子的孔隙。生物分子可以包括RNA、反義核苷酸和反義引物、適體、DNA、蛋白質、糖蛋白、多肽、碳水化合物或這些中的任意兩種以上的混合物或加合物。在一個特定實施方式中,生物分子包括siRNA。

所述方法包括調節乳液的pH,例如通過在添加生物分子和官能化陶瓷前體之前添加堿如NaOH、KOH和NH4OH,以避免生物分子的變性。典型地水解在低pH(如2)下進行以確保對于水解反應的足夠動力學同時抑制水解前體的縮合。在添加生物分子之前,優選將pH升至更大中性條件(即pH>4)。

同樣,可以添加聚合物或絡合劑以使其于生物分子一起設置在粒子孔隙內,以有利于內含體逃逸。典型地所述聚合物可以是聚乙烯胺、聚賴氨酸或聚組氨酸或提供質子海綿效應的任何物質。

與關于本發明的之前的方面一樣,所述方法可以另外包括:

f)在形成離子后向乳液中添加表面處理劑以表面處理所述粒子。

表面處理劑可以包含偶聯至結合基團的聚乙二醇鏈,所述結合基團能夠將該聚乙二醇鏈結合至粒子的表面。例如,表面處理劑可以是PEG-硅烷,如三烷氧基甲硅烷基-PEG。

表面處理劑可以包含用于靶向患者中的靶標的定位基團。例如,表面處理劑可以包括包含在PEG距離三烷氧基硅烷基的遠端處的定位基團。

本發明還提供在任意前述段落中描述的方法制備的粒子。

如以上注意的,生物分子可以指定用于預防或治療性治療疾病、障礙或病癥。

因此,在本發明的一個方面,提供了一種藥物組合物,其包含如本文所公開的粒狀物質以及藥用載體、稀釋劑或賦形劑。

藥用載體、稀釋劑或賦形劑可以是可以在全身給藥中安全使用的固體或液體填料、溶劑、稀釋劑或包封物質。取決于具體的給藥途徑,可以使用本領域熟知的各種各樣載體。這些載體可以選自包括以下的組:糖類、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽糖、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸鹽緩沖液、乳化劑、等張鹽水和鹽類如礦物酸鹽包括鹽酸鹽、溴化物和硫酸鹽,有機酸如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽和無熱原水。描述藥用載體、稀釋劑和賦形劑的有用文獻是Remington’s?Pharmaceutical?Sciences(Mack?Publishing?Co.N.J.USA,1991),通過引用將其結合于此。

劑型包括片劑、分散劑、混懸劑、注射劑、溶液、糖漿、糖錠、膠囊、栓劑、氣溶膠、透皮貼劑等。這些劑型也可以包括特別設計用于此目的的注射或植入受控釋放裝置或者改變以另外地以此方式發揮作用的植入物的其他形式。

任何安全的給藥途徑可以采用用于給藥本發明的粒狀物質。例如可以采用經口、直腸、胃腸外、舌下、含服、靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下、吸入、眼內、腹膜內、腦室內、經皮等。

在另一方面,提供了一種治療哺乳動物的疾病、障礙或病癥的方法,包括向所述哺乳動物給藥如本文中公開的粒狀物質或藥物組合物,由此治療所述疾病、障礙或病癥的步驟。

在另一方面,提供了一種如本文公開的粒狀物質,其用于治療哺乳動物的疾病、障礙或病癥。

所述疾病、障礙或病癥可以是遺傳疾病、障礙或病癥(例如囊性纖維化或亨廷頓氏病)、退行性疾病、障礙或病癥(例如老年性黃斑退化癥)、癌癥(例如實體瘤、肉瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、癌、黑素瘤,包括乳腺癌、宮頸癌、肺癌和前列腺癌,盡管不局限于此),免疫系統的疾病、障礙或病癥,包括自身免疫疾病(例如1型糖尿病、多發性硬化、風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡)和炎性病癥(例如哮喘、炎性腸病、腎小球腎炎),由病原體如病毒感染引起的疾病、病癥或障礙(例如丙肝、流感、呼吸道合胞體病毒感染、AIDS),細菌(例如肺炎,細菌性腦膜炎,百日咳,肺結核,破傷風),原生動物(例如瘧疾)或真菌(例如念珠菌),循環系統的疾病、障礙或病癥(例如動脈粥樣硬化,再狹窄,高膽固醇血癥),內分泌系統的疾病、障礙或病癥(例如,II型糖尿病,骨質疏松癥,胰腺炎)或神經性疾病、障礙或病癥(例如阿爾茨海默病,帕金生病或癲癇),盡管不局限于此。

哺乳動物可以是人或非人哺乳動物,包括表演動物(例如賽馬)、家養寵物(例如狗,貓)和家畜(例如牛、馬,羊,豬),盡管不局限于此。優選地,哺乳動物是人。

附圖說明

本發明的實施方式將通過僅實施例的方式,參考附圖進行描述。應當理解,以下討論不應視為以任何方式限制本發明。附圖中:

圖1是制備本發明的粒子的流程圖;

圖2示出了通過本發明方法制備的含有siRNA的粒子的TEM;

圖3示出了粒子的粒度分布;

圖4示出了本發明的粒子的其他TEM;

圖5示出了舉例說明粒子電荷和PEG化對熒光siDNA從粒子釋放的作用的曲線圖;

圖6示出了舉例說明對于粒子中的不同有效載荷的釋放動力學的曲線圖;

圖7示出了從根據本發明制備的粒子釋放的未包封siRNA(紅色跡線)和siRNA的HPLC色譜圖;

圖8示出了本發明的粒子的懸浮液的照片;

圖9示出了舉例說明對于具有負電荷、中性電荷和正電荷的粒子,粒子滲入細胞的顯微照片;

圖10示出了舉例說明負荷在具有負電荷、中性電荷和正電荷的粒子中的保持的顯微照片;

圖11和12示出了舉例說明負荷利用粒子進入細胞的顯微照片–圖11示出了粒子而圖12示出了負荷;

圖13示出了作為時間函數的siDNA在HEPG2細胞中的分散;

圖14示出了作為時間函數的siDNA在HeLa細胞中的分散;

圖15示出了作為時間函數的siDNA在RAW264細胞中的分散;

圖16示出了作為時間函數的siDNA在細胞中的分散;

圖17示出了本發明的粒子對BJ成纖維細胞中的DPP4的活性的作用;

圖18示出了用于包封寡核苷酸的原型方法的詳細流程圖;

圖19示出了在納米級上制備本發明的粒子的流程圖;

圖20示出了根據圖19所示方法制備的粒子的FEG-SEM圖像;

圖21示出了用氟-DNA標記的粒子的相和熒光圖像;和

圖22示出了納米粒子滲入HeLa細胞。

具體實施方式

描述了siRNA的封裝和從改性二氧化硅粒子的受控釋放。該粒子由具有并入以有助于載荷保持和細胞滲入的一定比例的氨基硅烷的無定形二氧化硅(SiO2)組成。粒子對于生物相容性進行表面改性(循環半衰期~4h)。所述粒子可以滲透哺乳動物細胞膜并且將它們的載荷釋放到內含體和細胞內空間中。

圖1示出了粒子的合成,包括封裝siRNA(一種代表性生物分子,其表示所得粒子的載荷)。因此參考圖1,通過組合30mL重石蠟油和4.5g?SPAN-20(=500mM)制成疏水連續相。這些通過攪拌(30分鐘)進行組合。然后將氨基硅烷(DATMS或TATMS,不是APTES)以足量加入用于期望電荷:對于負性粒子,沒有添加,對于中性粒子,添加DATMS(1.5uL=1mol%,作為硅)并且對于正性粒子,添加DATMS(15uL=10mol%,硅)。然后所得混合物攪拌至少另外的10分鐘但不超過60分鐘。

然后通過組合4mL水玻璃和20mL水制備二氧化硅溶液。將足夠的陽離子交換樹脂在攪拌下加入到所得混合物以使pH至4.0。然后將二氧化硅溶液從樹脂傾析到新容器中。

將疏水相(如上所述制備)設置成同時進行磁攪拌和聲處理(3/8”探針),并且啟動攪拌器。在用于組合疏水相和親水相的制備中,聲處理器斜線升至70%功率(~700W)。

5mg載荷(250uL20mg/mL?siRNA溶液)與1.25mL如上所述制備的二氧化硅溶液混合。在10秒聲處理之后,將二氧化硅/載荷混合物加入到聲處理器有效區。聲處理持續30秒然后停用聲處理器。移出乳液并引入至磁攪拌器并攪拌1小時。在此之后,將PEG5000-硅烷(10mg)加入到混合物中并且所得粒子懸浮液攪拌過夜。

通過離心(15000xg達10分鐘)從乳液收集粒子。然后將乳液用0.5體積環己烷稀釋以減小其粘度,并用環己烷(約40mL)洗滌兩次和用100%乙醇(約40mL)洗滌兩次。每個洗滌步驟涉及再懸浮和收集粒子以及傾析上清。將粒子最后再懸浮在5mL的100%乙醇中以在-20°C或4°C儲存。所述粒子可以在4°C儲存幾個月而無生物學活性的顯著損失。然而,更低的溫度儲存提供甚至更長期的儲存。

上述方法提供粒度范圍為100-1000nm的粒子,具有的質量加權平均直徑(d0.5)為約300nm。這些顯示在圖2和4。圖3示出了粒子的粒度分布。在約1微米的肩部可能代表少量的聚集粒子。上述方法已被用于下述的研究,然而,該方法的更改可以生產d0.5<150nm的分散粒子。

通過改變加入的氨基硅烷的量和/或類型,制備的粒子具有不同電荷。DATMS(氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷:2個氮原子/分子)用作標準。APTES(氨基丙基三甲氧基硅烷:1個氮原子/分子)顯著更低效并且TATMS(氨基乙基氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷:三個氮原子/分子)顯示與DATMS類似的結果。

如上所述,氨基硅烷加入到疏水相然后通過親水轉移轉移至親水相。由于各相之間的分配,并入的氨基硅烷的量低于添加的量。發現將氨基硅烷直接加入到親水相(即與水玻璃組合)在酸性pH下不實用,因為這引起提前凝膠化。

粒子的電荷在10mM?MOPS(3-N-嗎啉代丙烷磺酸緩沖液)中在pH7.0測量。粒子的ζ電勢為如下:

天然的(負性的)(無氨基硅烷):ζ≤-30mV

中性的(1%DATMS):-5mv<ζ<5mV

正性(10%DATMS):ζ≥+10mV

盡管使用間接測量方法,但所測得的電荷在各批次之間完全可重復。

百分比封裝效率(EE)通過比較siRNA的理論加載(從添加的量確定)與如通過所釋放的量測得的實際加載進行確定。結果顯示如下:

理論加載:5%

EE(從1mg/mL釋放)

批次1:85%+/-5%

EE(從0.1mg/mL釋放)

批次1:80%+/-2%

批次2:85%+/-10%

實際加載4.2%

理論加載:10%

EE75%,加載7.5%

因此引入的RNA的量越高,封裝效率越低。

圖5示出了熒光標記siDNA從不同電荷和表面改性的二氧化硅粒子的釋放效果。如上所述,粒子電荷可以通過改變所使用的氨基硅烷的量控制。從帶正電荷粒子的釋放比從帶負電荷的粒子的釋放遠遠更慢,如同通過帶正電荷粒子和帶負電荷有效載荷之間的預期吸引所預測的。對于帶負電荷的粒子,粒子表面上的PEG的存在看起來加速有效載荷的釋放。

有效載荷從粒子的釋放被認為主要通過溶解粒子基質。在含水介質中的高濃度(≥約1mg/mL粒子)下,載荷從粒子的浸出受限于通過粒子溶解介導的浸出,即所述溶液可以在粒子基質中達到飽和,由此限制有效載荷的釋放。這顯示在圖6中,其中發生活性(圓點值)和雜混(方形點值)siRNA分子的相對快速釋放,直至由二氧化硅基質溶解度指示的極限。應注意,這在圖5中不明顯,因為粒子的濃度不同。在顯著低于二氧化硅溶解限度(大約100μg/mL)的濃度下,或在其中釋放液體連續更新的情況下,在約12-24小時內發射粒子的完全溶解。如上所述制備的粒子在96%乙醇中在253K下儲存36天。在儲存后,所述粒子完全溶解在無RNA酶水中。所得液體在HPLC上的洗脫顯示與緩沖溶液中的未包封siRNA非常相似的外形,表明封裝和釋放不顯著影響siRNA。

圖7示出了未包封siRNA和從根據本發明制備的粒子釋放的siRNA的HPLC譜圖。兩種粒子和參照(未包封siRNA)用RNA酶A處理15分鐘,然后在含有RNA酶抑制劑的PBS中懸浮之前用PBS洗滌三次。從二氧化硅粒子釋放的材料顯示完整RNA。未包封siRNA的類似消化導致完成破壞。這些實驗證實粒子保護包封生物分子免于酶降解的能力。

圖8示出了相對于PBS(左)或相對于在PBS中的50%鼠血清(右)以3mg/L懸浮的離子的照片。在過夜溫育后,沒有出現可見的聚集。粒子還以1、3、10mg/kg懸浮在1500ppm?BSA中,然后溫育2小時。然后通過Mastersizer(Mie?scattering)確定粒度,表明在尺寸分布上沒有時間或濃度介導的移位。

總之,4%的載荷加載可常規地實現,并且8%的加載已得到證實。>80%的包封效率可常規地實現。生物分子在粒子中的保持看起來主要通過靜電力介導,在生理pH產生溶解首先的釋放特性(即釋放主要通過基質溶解發生)。載荷保持特性已證實在96%EtOH中在-20°C儲存40天后未改變。

攝入哺乳動物細胞

考察了粒子電荷對細胞滲入和載荷保持的影響,以及攝入細胞中和內含體逃逸的時間過程。

合成用RITC(若丹明異硫氰酸酯)共價標記的且載有具有siRNA-類型序列并且用FITC(熒光異硫氰酸酯)標記的DNA的粒子。將細胞(NIH3T3,HeLa,HEPG2)培養至50%匯合并將如上所述的粒子(約30μg/ml,相當于100nM?DNA)直接加入到培養基中。在40h后,將培養物用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌以除去粒子(其已滲入到細胞中),然后通過表面熒光顯微鏡成像。

圖9示出了監測RITC標記的結果:在每對圖像中,上圖是相位對比圖像而下圖是熒光圖像。圖9表明,隨著粒子上的正電荷增加,更多的粒子被細胞吸收。因此,粒子上的正電荷不僅有助于結合有效載荷而且有助于粒子攝入細胞中。圖10顯示,相比于中性或帶負電荷粒子,載荷更有效地保持在帶正電荷粒子中,因為它們被細胞吸收。此圖顯示通過電荷的siDNA保持。在每對圖像中,上圖像是相位對比圖像而下圖是siDNA熒光圖像。

圖11示出了粒子攝入到兩種不同細胞系中(即粒子分布),并且圖12示出了相同樣品但具有突出顯示的標記有效載荷(即載荷分布)的顯微照片。在這些圖二者的每對圖像中,上圖是相位對比圖像。在圖11中,在每對圖中,下圖是RITC熒光(紅色通道)圖像,并且在圖12中,在每對圖中,下圖是siDNA的熒光圖像(綠色通道)。通過比較這兩個圖,可以確定當粒子滲入細胞中時siRNA保持在粒子中。細胞內的綠色和紅色點的并置表示二氧化硅已滲入內部(紅色通道點=二氧化硅粒子)同時保持器熒光DNA載荷(綠色通道點=DNA),由此證實DNA已成功地被轉染到細胞內。圖13至15顯示將標記siDNA借助于本發明的粒子引入到各種細胞系的時間過程(圖13:HEPG2;圖14:HeLa;圖15:RAW264)。各個圖顯示在細胞中的每次后處理的熒光分布。在每種情況下,可以看到,在較短時間期下,siDNA主要位于小區域中,表示位于細胞中的粒子內的定位。在較長時間期下,siDNA擴展到更大區域中,表示粒子通過溶解粒子基質的釋放和通過細胞的分布。

圖16示出了使用共焦顯微鏡的類似實驗。在圖16中,每對的上圖示出了核染色(藍色通道)并且下圖示出了siDNA熒光(綠色通道)。因此,將HeLa細胞以25%匯合鋪放到聚-賴氨酸涂覆的蓋片上。這些用載有FAM-DNA的RITC改性粒子處理24或48h。然后它們用PBS洗滌并用在PBS中的3.7%甲醛固定。然后它們用在等張鹽水中的1.2μg/mL?Hoescht33342染色,安裝到具有Gelmount和丙烯酸類(acrylic)的載玻片上,并用共焦顯微鏡在100x放大率下成像。圖像為150x150μm,z-軸片段深度350nm。良好定義的大致圓形結構代表核DNA。在24小時后,有大量小亮區域,代表位于粒子內的有效載荷。少量的擴散發光代表少量釋放的有效載荷。在48小時后,點光源很大程度地小時,代表粒子溶解。相反,每個細胞具有亮區域的擴散鹵素,代表細胞內的釋放有效載荷。

基因敲除研究

圖17示出了用來顯示敲除中存在的加載粒子的效力(即基因表達的抑制)。此實驗著眼于人BJ成纖維細胞中的DPP4的有效性敲除。siRNA單獨是有效的,可能因為通過系統中存在的RNA酶失活導致。不出意料地,未加載的二氧化硅粒子也是無效的。測量標記的siRNA/Lipo是指借助于轉染的siRNA,已知用來跨越細胞膜轉染寡核苷酸。這種系統具有的缺點是,它有毒并且對于siRNA不提供來自酶攻擊的保護。測量標記的siRNA/nano表示封裝在根據本發明的粒子中的siRNA。在其中存在siRNA的每種情況下,它以約200nM使用。結果表明,封裝的siRNA在此濃度下的敲除有效,并且事實上比具有陽離子脂質體(Lipofectamine)的siRNA稍微更有效。

體外結論

·將生物分子封裝到根據本發明的粒子中可以保護該生物分子免于酶降解。

·當在正常培養條件下應用于細胞時,加載有生物分子的粒子能夠滲透胞質膜并將其載荷遞送至細胞內空間。

·生物分子經由本發明粒子遞送組織培養細胞導致這些細胞中的mRNA水平的劑量依賴性降低。

·封裝在粒子中的siRNA的劑量足以導致mRNA水平>50%降低表明在體外無顯著毒性。

另外的結果-粒子的合成

通常合成方法通過圖18中的流程圖描述。在將含水前體添加到表面活性劑溶液中后粒子形成極快。然而,通常在乳液形成和粒子收集之間允許至少12小時。

寡核苷酸的保持受載荷和粒子的氨基硅烷組分之間的靜電相互作用強烈影響。這形成取代的量和類型,以及在決定封裝、保持和釋放特性方面的形成和釋放關鍵因素的pH。

參數

此實施例中使用的表面活性劑是山梨糖醇酐單月桂酸酯使用的表面活性劑濃度為約17質量%。疏水相為重液體石蠟,這獲得所測試的那些中的最小粒子。通過磁攪拌和聲處理的組合,粒度減小至對于靜脈內注射可接受的值。

用來增強載荷保持的優選氨基硅烷是DATMS(氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷)。用APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷)和TATMS(氨基乙基氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷)的實驗表明,它們在或大或小程度上也具有此效果,并且可以用于精細調節保持/釋放特性。預期載荷加載影響粒子ζ電勢,并且預期氨基硅烷改性影響最大加載。

對于水玻璃的最小穩定性的pH為大約5.5,其表示對于RNA的最大穩定性的pH。如果硅酸鹽溶液太接近中性,則所述前體在它可以用于粒子粒子合成之前自發地凝膠化。如果所述溶液太酸性,則將發生核苷酸載荷的顯著降解。在RNA載荷下,已證實如果有點難處理,則3.75-4.00的前體pH是合適的。DNA、LNA或其他修飾的寡核苷酸可以允許更大酸性(并因此更穩定的)前體溶液。

實施例–圖18

將siRNA封裝入用DATMS、羅丹明和mPEG-5000改性的粒子:

15g的Dowex50W用100mL5M?HCl攪拌30分鐘以將該樹脂轉化為活性、質子化形式。然后通過真空輔助過濾到燒結玻璃過濾漏斗中進行回收,其中它用100mL?milliQ水洗滌兩次以除去殘留HCl。

9克稱入到聚四氟乙烯燒杯中并加入60mL液體石蠟。所得混合物攪拌約30分鐘以完成在石蠟中的溶解。將在2-丙酮中的29μL?DATMS液體和6μL10%羅丹明-APTES加入到攪拌的表面活性劑溶液中。

4.0mL硅酸鈉溶液加入到28mL?milliQ水中。留下8.0mL此溶液用于后續主要體積的滴定。

使用pH探針連續地監測溶液pH,添加活化的陽離子交換樹脂以將硅酸鹽混合物的pH降低至約3.5。將硅酸鹽溶液從樹脂傾析并再檢測pH。

將2.5mL的此前體溶液轉移至5mL塑料試管。適當體積的(<0.5mL)的載荷RNA溶液轉移至1.5mL試管。

將載荷RNA溶液移液到硅酸鹽前體中。將RNA/硅酸鹽混合物移液到表面活性劑溶液中并持續聲處理攪拌25秒。

所得乳液快速攪拌15分鐘。然后將15mg?mPEG-5000硅烷粉末加入到該乳液中并將所得混合物攪拌過夜。

然后將混合物在>2000x?g離心5分鐘以分離粒子。然后粒子用環己烷洗滌兩次以除去石蠟和表面活性劑,在每次洗滌后離心,然后用乙醇洗滌一次。通過離心收集粒子,上清傾析,并且將粒子再懸浮在10mL乙醇中。

獲得的產物的典型重量為200mg。典型封裝效率為>80%。粒子在pH7.4的典型ζ為+20mV。當相比于天然硅酸鹽粒子時,結合于粒子的蛋白質的典型減少(PEG化密度的量度)為>90%。

實施例–圖19

A.用于生物分子封裝的粒子的微乳液合成

將0.381g的NP9通過在玻璃瓶中攪拌(磁力)溶解在3mL的環己烷(0.2mol/L)中,并在持續攪拌下隨后加入0.065mL的1-戊醇作為輔助表面活性劑(0.2mol/L)。所得溶液構成疏水相。

加入0.013mL的0.01M?HNO3以充當酸催化劑,構成親水相,并該溶液攪拌20分鐘以進行均化。這導致形成微乳液。

加入0.018mL的四甲基原硅酸酯(TMOS)并將所得溶液攪拌66小時以水解TMOS并提供水解后的前體溶液。

加入0.013mL的0.01M?NaOH并攪拌5分鐘以將pH調節至大于約4。

通過在攪拌下加入0.010mL的水來模擬生物分子的加入。作為官能化陶瓷前體,加入0.003mL的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷并將該混合物攪拌6.5小時,在該時間內溶液變得逐漸更渾濁。這提供納米粒子的懸浮液。

加入5mg的mPEG-硅烷(MW=5000)并將該溶液保持攪拌15小時。然后將該溶液離心(13,000達1分鐘)以分離粒子,然后該粒子用2mL乙醇洗滌三次,并懸浮在2mL乙醇中。

所述粒子通過FEG-SEM成像,其表明尺寸范圍為30–100nm。參考圖20。

B.用于生物分子封裝的粒子的微乳液合成

將0.636g的NP9通過在玻璃瓶中攪拌(磁力)溶解在5mL的環己烷(0.2mol/L)中。在持續攪拌下加入0.109mL的1-戊醇作為輔助表面活性劑(0.2mol/L)。將1.14mL的環己烷/NP9/1-戊醇溶液移液到第二玻璃瓶(x2)中。

將0.011mL的0.01M?HNO3加入到上述子樣品中并將溶液攪拌40分鐘以進行均化,形成微乳液。

將0.0125mL(0.08mMol)的四甲基原硅酸酯加入到子樣品中并將所得溶液攪拌17.5小時以水解TMOS。將0.011mL的0.01M?NaOH加入到該兩個樣品中,然后將它們攪拌5分鐘以將pH調節至大于約4。

在攪拌下降0.006mL的氟-DNA溶液(FITC-標記的DPP4(21個堿基對)),在水中為0.5mg/mL在攪拌下加入到一個樣品中,并將0.006mL的水在攪拌下加入到第二樣品中。

將0.002mL(0.009mMol)的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷作為官能化陶瓷前體加入到每個樣品中并將混合物攪拌6小時。

將0.8mg的mPEG-硅烷(MW=5000)加入到每個樣品中,然后將樣品保持攪拌18小時。將1mL的丙酮加入到每個樣品中并且溶液攪拌10分鐘。

然后將溶液離心(13,000達1分鐘)以分離粒子,該粒子然后用2mL乙醇洗滌三次。將含氟-DNA的樣品(CS11-0028)懸浮在2mL乙醇中。僅適用水支制成的樣品(CS11-0029)在40°C干燥并稱重為7.3mg。

將幾滴用氟-DNA標記的粒子在顯微鏡用載玻片上干燥并使用裝配有FITC過濾器熒光顯微鏡在40x放大率和4次二次曝光下進行成像。參考圖21。

圖22示出了培養的人肝細胞用AlexaFluor-633標記的二氧化硅納米粒子的轉染。細胞在成像前處理24小時。

其他實施例

合成用FITC(異硫氰酸熒光素)共價標記并載有藻紅蛋白(Phycoerythrin)有效載荷的粒子。將HeLa細胞培養至50%匯合并且如上所述的粒子(約30μg/ml)直接加入到培養基中。在40h之后,培養物用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌一次以除去沒有深入細胞中的粒子,然后通過表面熒光顯微鏡成像,從而監測所遞送的藻紅蛋白的細胞內釋放。

除非上下文另有要求或具體地相反說明,作為單數的整數、步驟和構件在本文中陳述的整數、步驟或構件明確地涵蓋所陳述整數、步驟或構件的單數和復數形式。

在本說明書通篇中,除非上下文另有要求,術語“包括”或變形“包含”或“含有”應被理解為暗示包括所陳述的步驟或構件或整數,或者步驟或構件或整數的組,但不排除任何其他步驟或構件或整數或步驟、構件或整數的組。因此,在本說明書的上下文中,術語“包括”以包含含義使用并應理解為是指“主要包括但不必是單獨地”。

應理解,前面的描述通過本發明的舉例說明性實施例給出并且其對于本領域技術人員明顯的更改和變形被視為落入本文提出的發明的寬范圍和界限內。

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本文標題:用于遞送生物分子的包含陶瓷粒子的粒狀物質.pdf
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