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以花椰菜小孢子胚為外植體建立再生體系的方法.pdf

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花椰菜 孢子 外植體 建立 再生 體系 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310013922.1

申請日:

20130115

公開號:

CN103053423B

公開日:

20140226

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 浙江省農業科學院
發明人: 盛小光,顧宏輝,趙振卿,虞慧芳,王建升,許映君
地址: 310021 浙江省杭州市江干區石橋路198號
優先權: CN201310013922A
專利代理機構: 杭州豐禾專利事務所有限公司 代理人: 沈伾伾
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310013922.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了以花椰菜小孢子胚為外植體建立高效再生體系的方法,屬于植物組織培養技術領域。包括培養基的配制和花椰菜小孢子胚再生植株培養等兩大步驟。本發明以小孢子胚為外植體,其芽誘導率高達100%,每外植體芽數達30-50個;培養基添加玉米素0.5-1.0mg/L后,芽誘導率和誘導數比對照分別提高1.1倍和3.2倍;添加4.0-5.0mg/LAgNO3后褐化率比對照降低10%左右。該方法既大幅度提高了花椰菜組培的效率,并為提高其遺傳轉化率提供了新的技術途徑。本發明可在花椰菜組培及基因工程遺傳改良中推廣應用。

權利要求書

1.以花椰菜小孢子胚為外植體建立再生體系的方法,其特征在于按如下步驟進行:?(1)培養基的配制:包括,?1)誘導培養基:MS基礎培養基?+?2,4-D?1.0-2.0?mg/L?+?ZT?0.5-1.0?mg/L?+?AgNO?4.0-5.0?mg/L?+?30?g/L蔗糖+?9?g/L瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;2)分化培養基:MS基礎培養基?+?ZT?0.5-1.0mg/L?+?BAP?1.0-2.0mg/L?+?NAA?0.05mg/L?+?AgNO?4.0-5.0mg/L?+?30g/L蔗糖+?9g/L瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;3)再分化培養基:MS基礎培養基?+?AgNO4.0?mg/L?+?30?g/L蔗糖+?10-11?g/L?瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;4)生根培養基:?1/2?MS基礎培養基?+?NAA?1.0?mg/L?+?30?g/L蔗糖+?9?g/L?瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養:1)小孢子胚的選取:選取雙單倍體材料花蕾分離的小孢子在25-28℃暗培養30-35天獲得的發育正常、生長良好的子葉胚,備用;2)愈傷誘導培養:將足夠量的子葉胚接種于誘導培養基中,于25-28℃光培養1周至子葉胚明顯膨大并形成淺綠色愈傷組織;3)愈傷分化培養:將愈傷組織轉接到分化培養基中,于26-28℃、每天光照16小時條件下培養2-3周至出芽點;4)愈傷再分化培養:將帶芽點的愈傷組織轉接到再分化培養基中,于26℃、每天光照16小時條件下培養2-3周至出苗成再生苗;5)生根培養:將再生苗移入生根培養基中,于26℃、每天光照16小時條件下培養1-2周至出根。

說明書

技術領域

本發明涉及植物組織培養技術領域,具體涉及一種以小孢子胚為外植體建立花椰菜高效再生體系的方法。

背景技術

花椰菜(?Brassica?oleracea?var?.?botrytis?)?屬十字花科蕓薹屬植物,其花球營養豐富,除含蛋白質、纖維素和各種礦物質外,還含有多種吲哚衍生物,具有顯著的防癌、抗癌功效,越來越受到消費者的青睞,近年來栽培面積迅速擴大,已成為我國的主要蔬菜作物之一。但花椰菜生長期間病蟲害嚴重、不耐貯藏、品質差等問題一直困擾著廣大菜農與菜商。因此,對花椰菜品種進行改良勢在必行,而常規育種方法已不能滿足現代農業對花椰菜品種改良的要求。現代生物技術的發展為人們選育和轉化具有優良園藝性狀基因的突破性品種提供了可能。然而,國內外關于花椰菜遺傳轉化的技術還很不成熟,遺傳轉化率極低,難以適應花椰菜分子育種的要求,其原因在于尚未真正解決并建立起適宜于農桿菌介導的花椰菜高頻率植株的再生技術。

前人雖對花椰菜組織培養研究已進行了多方面的探索,通過對不同基因型品種及外植體、不同培養基成分(包括蔗糖濃度和激素配比等)、不同培養條件對愈傷的誘導、增殖及分化再生能力的影響進行了較為系統的研究,也獲得了一些高頻率的再生體系,但僅限少數幾個品種,且每個外植體上再生芽數較少,增殖能力低。另一方面,以上研究大多是以花椰菜的下胚軸和子葉為外植體,截止目前為止,以花椰菜小孢子胚為外植體的相關研究國內外尚未見有報道。

小孢子胚是植物小孢子通過分離、純化和培養后形成的胚狀體,其特點是:分化能力強,周體都可以再生出不定芽,增殖系數高;其次,小孢子胚周體都可以被農桿菌浸染轉化,故有利于外源基因的成功導入;再次,小孢子胚具有遺傳背景一致性,大大方便了對轉化陽性株表型差異的觀察和特異基因的功能研究。但花椰菜小孢子培養一直以來被認為是在蕓薹屬中最難成功的技術之一。

為此,發明人對花椰菜小孢子培養過程中的關鍵技術進行了創新、改進和完善,突破了花椰菜小孢子培養的技術瓶頸,使誘導成功率達84.6%,最高每花蕾胚狀體產量達112胚,實現了小孢子胚的流水線生產。在此基礎上,本研究以花椰菜小孢子胚為外植體,對影響其芽再生的相關因素進行了系統的研究,獲得了芽誘導率達100%的再生體系,且每個外植體的芽誘導數為30-50個。該方法既大幅度提高了花椰菜組培的增殖率,又為提高花椰菜遺傳轉化率提供了一個新的途徑,從而為今后的花椰菜基因工程遺傳改良奠定了繁苗技術基礎。

發明內容

本發明目的是,針對傳統花椰菜再生芽誘導以其下胚軸和子葉為外植體,所存在的再生芽數少、增殖能力低,遺傳轉化率低等的缺陷,提供一種外植體再生芽數多、增殖能力強、遺傳背景一致性好,具高效遺傳轉化潛力的花椰菜高頻率植株再生的方法。

本發明目的通過以下技術方案來實現。

????以花椰菜小孢子胚為外植體建立高效再生體系的方法,該方法按如下步驟進行:?

(1)培養基的配制:包括,?

1)誘導培養基:MS基礎培養基?+?2,4-D?1.0-2.0?mg/L?+?ZT?0.5-1.0?mg/L?+?AgNO3?4.0-5.0?mg/L?+?30?g/L蔗糖+?9?g/L瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;

2)分化培養基:MS基礎培養基?+?ZT?0.5-1.0mg/L?+?BAP?1.0-2.0mg/L?+?NAA?0.05mg/L?+?AgNO3?4.0-5.0mg/L?+?30g/L蔗糖+?9g/L瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;

3)再分化培養基:MS基礎培養基?+?AgNO3?4.0?mg/L?+?30?g/L蔗糖+?10-11?g/L?瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;

4)生根培養基:?1/2?MS基礎培養基?+?NAA?1.0?mg/L?+?30?g/L蔗糖+?9?g/L?瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;

(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養:

1)小孢子胚的選取:選取雙單倍體材料花蕾分離的小孢子在25-28℃暗培養30-35天獲得的發育正常、生長良好的子葉胚,備用;

2)愈傷誘導培養:將足夠量的子葉胚接種于誘導培養基中,于25-28℃光培養1周至小孢子胚明顯膨大并形成淺綠色愈傷組織;

3)愈傷分化培養:將愈傷組織轉接到分化培養基中,于26-28℃、每天光照16小時條件下培養2-3周至出芽點;

4)愈傷再分化培養:將帶芽點的愈傷組織轉接到再分化培養基中,于26℃、每天光照16小時條件下培養2-3周至出苗成再生苗;

5)生根培養:將再生苗移入生根培養基中,于26℃、每天光照16小時條件下培養1-2周至出根。

????本發明的有益效果是:?

一、本發明通過植物激素配比、培養基成分、添加劑濃度調試等因素對花椰菜小孢子胚培養影響的比較試驗后發現,培養基中添加玉米素0.5-1.0?mg/L后對花椰菜小孢子胚愈傷組織的誘導及不定芽再生具有明顯的促進作用,芽誘導率和每外植體芽誘導數分別比對照提高約1.1倍和3.2倍;同時在培養基中添加4.0-5.0?mg/L?AgNO3?后可以一定程度減輕褐化現象,褐化率比對照降低10%左右,同時也促進了芽誘導率的提高,比對照提高5%左右。

二、本發明利用花椰菜小孢子胚為外植體,采用特定的培養基成分,不同的培養條件對愈傷組織進行誘導、分化,直至植株再生,本發明能得到高達100%的芽誘導率,且平均每個外植體的芽數可達30-50個,比以前報道的花椰菜其它外植體組織的芽誘導數要高1-3倍。

三、本發明以花椰菜小孢子胚為外植體的高頻再生體系的建立,既可大幅度提高花椰菜組培的芽誘導率和增殖率,同時由該法再生的小孢子胚具有遺傳背景一致、易被農桿菌浸染轉化,有利于外源基因導入等特點,故又為提高花椰菜遺傳轉化率提供了一個新的途徑,從而為今后的花椰菜基因工程的遺傳改良奠定了技術基礎。

具體實施方式

通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明,但本發明的內容并不局限于此。

實施例1:(花椰菜小孢子胚高頻率芽再生的培養方法1)

該方法按如下步驟進行:?

(1)培養基的配制:包括外植體芽再生各階段的培養基,它們的組分與各組分在每升培養基中所含重量為:

?1)愈傷誘導培養基:MS基礎培養基?+?2,4-D?1.0?mg/L?+?ZT?0.8?mg/L?+?AgNO3?4.0?mg/L?+?30g/L?蔗糖?+?9g/L?瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;

????2)愈傷分化培養基:MS基礎培養基?+?ZT?0.5?mg/L?+?BAP?2.0?mg/L?+?NAA?0.05mg/L?+?AgNO3?4.0?mg/L?+?30?g/L?蔗糖?+?9?g/L?瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;

????3)愈傷再分化培養基:MS基礎培養基?+?AgNO3?4.0?mg/L?+?30?g/L?蔗糖?+?10?g/L?瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;

4)生根培養基:1/2?MS基礎培養基?+?NAA?1?mg/L?+?30?g/L?蔗糖?+?9?g/L?瓊脂,pH?5.8,高溫滅菌;

(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養:

1)小孢子胚的選擇:選取雙單倍體材料花蕾分離的小孢子在26℃暗培養32天獲得的發育正常、生長良好的子葉胚200個,備用;

?2)愈傷誘導培養:愈傷誘導培養基高壓滅菌后分裝于直徑9cm的玻璃培養皿中;將選取的200個小孢子胚從培養液中揀出、無菌濾紙吸干后,放入誘導培養基中,25℃,每天光照16小時,培養1周至胚狀體明顯膨大并形成淺綠色愈傷組織;

3)愈傷分化培養:芽誘導培養基高壓滅菌后分裝于5×9cm(底×高)圓柱形玻璃瓶中;將愈傷組織轉接到芽誘導培養基中,于26℃每天光照16小時條件下培養2-3周至愈傷組織出現可見芽點;

4)愈傷再分化培養:愈傷再分化培養基高壓滅菌后分裝于5×9cm(底×高)圓柱形玻璃瓶中;選取帶有綠色芽點的外植體轉接到愈傷再分化培養基上,于26℃每天光照16小時條件下培養2-3周至出苗成再生苗;

5)再生植株的生根培養:切取萌發有正常生長點的再生植株,插于生根培養基中,于26℃每天光照16小時條件下進行生根培養1-2周至出根;

以花椰菜小孢子胚為外植體,用上述方法進行培養,獲得了高達100%的芽誘導率,平均每個外植體的再生芽數為30-50個,且芽長勢良好,芽生根率達100%。

實施例2:(花椰菜小孢子胚高頻率芽再生的培養方法2)

本實施例中,步驟(1)培養基的配制:其中,1)愈傷誘導培養基中的?2,4-D為?1.5?mg/L、?ZT為?1.0?mg/L、?AgNO3?為4.5?mg/L?;2)愈傷分化培養基中的?ZT為?0.8?mg/L、BAP為1.5?mg/L、?AgNO3為4.5?mg/L;3)愈傷再分化培養基上中的瓊脂為10.5?g/L;步驟(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養:其中,1)選取的小孢子在25℃暗培養35天后取生長良好的子葉胚180個;2)子葉胚于27℃,每天光照16小時,培養1周;3)愈傷組織于28℃,每天光照16小時,培養2-3周,至出現可見芽點;其余步驟工藝均同于實施例1。

實施例3:(花椰菜小孢子胚高頻率芽再生的培養方法3)

本實施例中,步驟(1)培養基的配制:其中,1)愈傷誘導培養基中的?2,4-D為?2.0?mg/L、ZT為0.5?mg/L、AgNO3?為5.0?mg/L?;2)愈傷分化培養基中的?ZT為?1.0?mg/L、BAP?1.0?mg/L、AgNO3為?5.0?mg/L;3)愈傷再分化培養基中的瓊脂為11?g/L;步驟(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養:其中,1)選取的小孢子在28℃暗培養30天后取生長良好的子葉胚180個;2)子葉胚于28℃,每天光照16小時,培養1周;3)愈傷組織于27℃,每天光照16小時,培養2-3周,至出現可見芽點;其余步驟工藝均同于實施例1。

實施例4:(花椰菜小孢子胚高頻率芽再生的比較試驗)

本實施例中,步驟(1)培養基的配制為:1)愈傷誘導培養基中的?2,4-D為2.0?mg/L、?ZT為0-1.3?mg/L、?AgNO3?為0與4.5?mg/L?;2)愈傷分化培養基中的?ZT為?0-1.3?mg/L、BAP?1.0?mg/L、AgNO3為?0與4.5?mg/L;3)愈傷再分化培養基上中的瓊脂為11?g/L;步驟(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養:其中,1)選取的小孢子在28℃暗培養30天后取生長良好的子葉胚150個;2)子葉胚于28℃,每天光照16小時,培養1周;3)愈傷組織于27℃,每天光照16小時,培養2-3周,至出現可見芽點;其余步驟工藝均同于實施例1。所獲結果如表1所示,培養基中添加一定濃度的ZT,可以大幅度提高小孢子胚的愈傷和芽誘導率及每外植體芽誘導數。其中,培養基添加0.5、0.8和1.0?mg??l-1的ZT?均使外植體的愈傷誘導率達到95%以上,約是對照的1.9倍;芽誘導率均達到94%以上,約是對照的2.1倍;每外植體芽數均達到30個以上,約為對照的4.2倍。同時,培養基中添加4.5?mg??l-1的AgNO3可以一定程度減輕褐化現象,褐化率比對照降低10%左右,同時也促進了芽誘導率的提高,比對照提高5%左右。

表1??花椰菜小孢子胚在不同ZT和AgNO3濃度下愈傷和芽的誘導率

實施例5:(花椰菜小孢子胚高效再生體系在遺傳轉化研究中的應用)

利用建立的高效再生體系進行農桿菌介導的遺傳轉化工作。通過預培養、農桿菌浸染、共培養、延遲培養、篩選培養等環節,最終獲得了18個株系的轉基因陽性株。這些植株已經成功移栽入大棚中,進一步的抗逆脅迫、基因表達及自交后代群體的獲得等工作正在進行中。

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