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牽牛子離體胚軸植株再生的方法.pdf

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牽牛子 胚軸 植株 再生 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310045458.4

申請日:

20130206

公開號:

CN103053429B

公開日:

20141224

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00,A01G31/00 主分類號: A01H4/00,A01G31/00
申請人: 鄭州師范學院
發明人: 馬杰,鄧祖麗穎,田云芳,蔣素華,王默霏,崔波
地址: 450044 河南省鄭州市惠濟區英才街6號
優先權: CN201310045458A
專利代理機構: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 代理人: 張曉萍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310045458.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

牽牛子離體胚軸植株再生的方法由“建立無菌苗培養體系—胚軸誘導產生不定芽—繼代增殖培養得到分化芽—培養生根苗—練苗移栽獲得再生植株”5個環節組成,選用圓葉牽牛子外植體接種到特制的培養基上,在無菌的條件下進行培養,形成再生植株,該方法繁殖速度快,成苗性狀一致,不受季節限制,并可防止真菌、細菌、特別是病毒對牽牛子危害。

權利要求書

1.牽牛子胚軸離體培養獲得再生植株的方法,其特征在于:本方法由“建立無菌苗培養體系—胚軸誘導產生不定芽—繼代增殖培養得到分化芽—培養生根苗—煉苗移栽獲得再生植株”5個環節組成,無菌苗由圓葉牽牛種子經過處理接種于MS固體培養基培養獲得;無菌苗胚軸誘導產生不定芽所用的誘導培養基為MS培養基+1.0~2.0mg/l?BA+0.1~0.2mg/l?NAA+3%蔗糖+0.9%瓊脂;不定芽經繼代增殖培養得到分化芽所用的增殖培養基為MS培養基+1.0~2.0mg/l?BA+0.1~0.2mg/l?NAA+3%蔗糖+0.9%瓊脂;分化芽培養生根苗所用的生根培養基為1/2MS培養基+0.3~0.5mg/l?NAA+3%蔗糖+0.9%瓊脂。2.如權利要求1所述的牽牛子胚軸離體培養獲得再生植株的方法,其特征在于:種子處理是將成熟飽滿的圓葉牽牛種子,流水沖洗20min,放入75%乙醇中浸泡30s,取出,用無菌水沖洗3-5次,加入0.1%氯化汞溶液中,進行種子表面消毒,控制消毒時間10min,消毒好的種子取出用無菌水沖洗4-5次后接種于MS固體培養基上,放入培養室。3.如權利要求1所述的牽牛子胚軸離體培養獲得再生植株的方法,其特征在于:建立無菌苗培養體系、胚軸誘導產生不定芽、繼代增殖培養得到分化芽和培養生根苗4個環節均無菌條件下進行,培養條件同為溫度25±2C,光照時間12h/d,光照強度2000~3000Lux,夜間保持黑暗。4.如權利要求1所述的牽牛子胚軸離體培養獲得再生植株的方法,其特征在于:無菌苗培養時間為20~25d,胚軸誘導產生不定芽時間為15~20d,繼代增殖培養時間為13~17d,培養生根苗時間為7d,生根率為100%,煉苗移栽時間為13~15d。5.如權利要求1所述的牽牛子胚軸離體培養獲得再生植株的方法,其特征在于:煉苗移栽是在生根苗的根長到1cm左右時轉移到智能溫室,在自然光照下馴化3天,取出生根苗洗凈根部附著物,用0.1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒1min,移入移栽基質,每周噴灑1次0.1%多菌靈,最后移入土壤形成再生植株。

說明書

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域,特別適用于牽牛子離體胚軸植株再生的方法。

背景技術

牽牛子系旋花科植物裂葉牽牛(Pharbitis?nil?L.)或圓葉牽牛(Pharbitis?purpurea?L.)的成熟種子。牽牛子始載于名醫別錄,又名黑丑、白丑。具有瀉水通便消痰滌飲殺蟲攻積的功效,用于治療水腫脹滿、二便不通、痰飲積聚氣逆喘咳、蟲積腹痛及蛔蟲、絳蟲病等。現代臨床醫學亦多見有關牽牛子的報道,如在利用鈣調神經磷酸酶的分子模型篩選針對老年癡呆癥的天然藥物時,發現牽牛子粗提物具有明顯激活鈣調神經磷酸酶的作用,并有藥理試驗證明它能明顯改善記憶,目前市場的需求量很大且在年年增加。牽牛為1年生纏繞性草本植物,秋末果實成熟、果殼未開裂時采割植株,曬干,打下種子。目前入藥的牽牛子來自野生種和栽培種的都有,野生種因生長分散,采收種子非常不容易,總體品質也較差;種植牽牛存在著種子質量差異大、保存期短、發芽率低、發芽時間差別大、幼苗生長緩慢等問題;采用扦插、分株、貯根等方法繁殖牽牛子種苗,常常因為感染病害、真菌和細菌等,造成病毒長期累積而導致牽牛子產量及效力降低;另外,種子采收每年只有一次,產量有限,很難滿足實際需求。應用植物組織培養方法生產藥用植物是一個理想的選擇,這種方法通過培養植物的離體器官、組織或細胞產生完整植株,組織培養中的細胞生長速度要比植物正常生長速度快,接近于分生組織的生長速度,亦可以將各種初級化合物,轉化成醫藥上更有效的化合物,并且具有不受地區、季節與氣候限制,便于工廠化生產等優勢。植物的組織,甚至單個細胞都具有再生能力,因此利用組織培養手段快速繁殖藥用植物種苗,或者利用組織培養或細胞培養手段直接生產藥物便隨之日益發展。植物組織培養技術中,激素或生長調節物質對離體培養組織的分化起著重要的作用,激素的種類、相對濃度和絕對濃度直接影響根和芽再生,培養組織內的激素水平與再生過程關系密切,另外,由于同一植物的不同部位的再生能力差異很大,不同器官的組織培養需要不同的方法和培養基配比,因此,不同的植物或器官對組織培養的方法有不同的要求。到目前為止,有關牽牛子的組織培養技術或方法還未見有報道。

發明內容

本發明的目的在于利用組織培養技術,提供一種用于牽牛子離體胚軸植株再生的方法。

本發明采用圓葉牽牛的種子—牽牛子,通過組織培養的方法,取其無菌苗的胚軸離體培養獲得牽牛子再生植株,技術方案由“建立無菌苗培養體系—胚軸誘導產生不定芽—繼代增殖培養得到分化芽—培養生根苗—練苗移栽獲得再生植株”五個環節組成,無菌苗由圓葉牽牛種子經過處理接種于MS固體培養基培養獲得,使用0.1%氯化汞溶液進行種子表面消毒的時間控制為10min;無菌苗胚軸誘導產生不定芽所用的誘導培養基為MS培養基+1.0~2.0mg/l?BA+0.1~0.2mg/l?AA+3%蔗糖+0.9%瓊脂;不定芽經繼代增殖培養得到分化芽所用的增殖培養基為MS培養基+1.0~2.0?mg/l?BA?+?0.1~0.2mg/l?AA+?3%蔗糖+?0.9%瓊脂;分化芽培養生根苗所用的生根培養基為1/2MS培養基+0.3~0.5mg/l?NAA+?3%蔗糖+0.9%瓊脂;生根苗的根長至1cm左右時進行練苗移栽,培植成再生植株,技術方案的前4個環節在無菌條件下進行,煉苗移栽培養基質為滅菌草炭+珍珠巖=2:1。

本發明的技術方案通過以下步驟完成:

步驟1.建立無菌苗培養體系,獲得無菌苗:種子處理是挑選成熟飽滿的圓葉牽牛種子,流水沖洗20min,放入75%乙醇中浸泡30s,取出,用無菌水沖洗3-5次,加入0.1%氯化汞溶液中,進行種子表面消毒,控制消毒時間10min,時間不足達不到消毒效果,時間過長影響種子發芽率,將消毒好的種子取出用無菌水沖洗4-5次后接種于MS固體培養基上,整個操作在超凈工作臺進行,最后將接種后的MS固體培養基放入培養室,培養20~25d,獲得無菌苗。

步驟2.胚軸誘導產生不定芽:將步驟1中無菌苗的胚軸切成0.3~0.5cm大小的段兒,置于誘導培養基培養,誘導培養基為MS基本培養基+1.0~2.0mg/l?6-BA?+?0.1~0.2mg/l?NAA+?3%蔗糖+?0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,?7~9d即產生黃綠色愈傷,15~20d分化出不定芽。

步驟3.繼代增殖培養得到叢生芽:將步驟2分化出的不定芽切分后置于增殖培養基上進行繼代培養,增殖培養基為MS培養基+1.0~2.0mg/l?6-BA+0.1~0.2mg/l?NAA+3%蔗糖+0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,培養13~17d分化成叢生芽,芽的增殖數量達到6-8個,此過程可重復操作,使其不斷增殖。

步驟4.培養生根苗,獲得完整植株:叢生芽經培養長至約2~3cm高時,將其分成單株,轉移到生根培養基上進行生根培養,生根培養基為:1/2MS?+?0.3~0.5mg/l?NAA+?3%蔗糖+?0.9%?瓊脂,pH5.8-6.0,7d左右可分化出不定根,形成完整的牽牛子植株—生根苗,生根率達100%。

以上4個步驟均在無菌條件下進行,培養條件同為溫度25±2°C,光照時間12h/d,光照強度2000~3000Lux,夜間保持黑暗。

步驟5.練苗移栽:當生根苗的根長到1cm左右時將生根苗轉移到智能溫室,在自然光照下馴化3天,使生根苗逐漸適應周圍環境,取出生根苗洗凈根部的附著物,用0.1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒1min,移入苗床進行種苗培育,移栽基質選用滅菌草炭加珍珠巖,二者比例為2:1,移栽期內保持部分遮光和適當的濕度,長出新根后,適當增加光照,13~15d可至正常生長,期間每周噴灑1次0.1%多菌靈,最后移入土壤形成再生植株。

本發明利用植物細胞的全能性和再生能力,選用牽牛子外植體接種到特制的培養基上,在無菌的條件下進行培養,產生愈傷組織、長出不定芽、生出不定根、最終形成再生植株。該發明技術使牽牛子的繁殖達到如下效果:(1)繁殖速度快:不受種子發芽率的影響,選用優良母株的外植體,經離體培養,一年能繁殖幾萬到十幾萬株新的優良個體;(2)脫毒:本技術是防止真菌、細菌、特別是病毒對牽牛子危害的一項最有效、最快捷、最實用的方法;(3)輔助育種:本技術可將誘變和篩選出的優良品種快速繁殖,提高選擇效率,培育出高產、優質、抗病、抗逆性強的新品種;(4)組培苗性狀一致:本技術繁殖的牽牛子能夠保持后代植株的一致性和整齊度,便于工廠化生產的管理,這點對于藥用植物尤為重要;(5)不受季節限制:本技術采用人工可控條件,室內培養,可以周年生產;(6)節省土地和資源:本方法可在室內集中實施,立體分層生產,集中管理,最大限度地節省土地、人力等資源。另外,該技術建立了牽牛子分子育種的受體系統,為以后牽牛子開展轉基因試驗受體的培養、開展分子育種目的性狀基因的供體總DNA片段導入、分離目的基因和構建重組分子等技術的應用提供了基礎材料和技術支持。

附圖說明

圖1為無菌苗;

圖2為胚軸愈傷及不定芽;

圖3為叢生苗;

圖4為生根苗。

具體實施方式

實施例1.

步驟1.建立無菌苗培養體系,獲得無菌苗:挑選成熟飽滿的圓葉牽牛種子,流水沖洗20min,放入75%乙醇中浸泡30s,取出,用無菌水沖洗4次,加入0.1%氯化汞溶液中,進行種子表面消毒,控制時間10min,將消毒好的種子取出用無菌水沖洗4次后接種于MS固體培養基上,整個操作在超凈工作臺進行,最后將接種后的MS固體培養放入培養室,培養時間25d,獲得無菌苗,見圖1。

步驟2.胚軸誘導產生不定芽:將步驟1中無菌苗的胚軸切成0.3~0.5cm大小,置于誘導培養基培養,誘導培養基為MS基本培養基+1.0?mg/l?6-BA?+?0.1mg/l?NAA+?3%蔗糖+?0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,9d即產生黃綠色愈傷,20d分化出不定芽,見圖2。

步驟3.繼代增殖培養:將步驟2分化出的不定芽切分后置增殖培養基上進行繼代培養,增殖培養基為MS培養基+1.0mg/l?6-BA?+?0.1mg/l?NAA+?3%蔗糖+?0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,培養17d分化成叢生芽,見圖3,芽的增殖數量為7個。

步驟4.培養生根苗:選2~3cm高的叢生芽,將其分成單株,轉移到生根培養基上進行生根培養,生根培養基為1/2MS+0.3mg/l?NAA+3%?蔗糖+0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,8d即分化出不定根,形成完整的牽牛子植株—生根苗,生根率100%,見圖4。

以上4個步驟均在無菌條件下進行,培養條件同為溫度25±2°C,光照時間12h/d,光照強度2000~3000Lux,夜間保持黑暗。

步驟5.練苗移栽:當生根苗的根長到1cm左右時將生根苗轉移到智能溫室,在自然光照下馴化3天,使生根苗逐漸適應周圍環境,取出生根苗洗凈根部的附著物,用0.1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒1min,移入苗床進行種苗培育,移栽基質選用滅菌草炭加珍珠巖,二者比例為2:1,移栽期內保持部分遮光和適當的濕度,長出新根后,適當增加光照,15d可至正常生長,期間每周噴灑1次0.1%多菌靈,最后移入土壤形成再生植株。

實施例2.

步驟1.建立無菌苗培養體系,獲得無菌苗:挑選成熟飽滿的圓葉牽牛種子,流水沖洗20min,放入75%乙醇中浸泡30s,取出,用無菌水沖洗5次,加入0.1%氯化汞溶液中,進行種子表面消毒,控制時間10min,將消毒好的種子取出用無菌水沖洗4-5次后接種于MS固體培養基上,整個操作在超凈工作臺進行,最后將接種后的MS固體培養放入培養室,培養時間20d,獲得無菌苗。

步驟2.胚軸誘導產生不定芽:將步驟1中無菌苗的胚軸切成0.3~0.5cm大小,置于誘導培養基培養,誘導培養基為MS基本培養基+2.0?mg/l?6-BA?+?0.2mg/l?NAA+?3%蔗糖+?0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,7d即產生黃綠色愈傷,15d分化出不定芽。

步驟3.繼代增殖培養:將步驟2分化出的不定芽切分后置增殖培養基上進行繼代培養,增殖培養基為MS培養基+2.0mg/l?6-BA?+?0.2mg/l?NAA+?3%蔗糖+?0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,培養14d分化成叢生芽,增殖倍數為8。

步驟4.培養生根苗:選2~3cm高的叢生芽,將其分成單株,轉移到生根培養基上進行生根培養,生根培養基為1/2MS+0.5mg/l?NAA+3%?蔗糖+0.9%?瓊脂,pH5.8-6.0,6d即分化出不定根,形成完整的牽牛子植株—生根苗,生根率100%。

以上4個步驟均在無菌條件下進行,培養條件同為溫度25±2°C,光照時間12h/d,光照強度2000~3000Lux,夜間保持黑暗。

步驟5.練苗移栽:當生根苗的根長到1cm左右時將生根苗轉移到智能溫室,在自然光照下馴化3天,使生根苗逐漸適應周圍環境,取出生根苗洗凈根部的附著物,用0.1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒1min,移入苗床進行種苗培育,移栽基質選用滅菌草炭加珍珠巖,二者比例為2:1,移栽期內保持部分遮光和適當的濕度,長出新根后,適當增加光照,13d可至正常生長,期間每周噴灑1次0.1%多菌靈,最后移入土壤形成再生植株。

實施例3.

步驟1.建立無菌苗培養體系,獲得無菌苗:挑選成熟飽滿的圓葉牽牛種子,流水沖洗20min,放入75%乙醇中浸泡30s,取出,用無菌水沖洗3次,加入0.1%氯化汞溶液中,進行種子表面消毒,控制時間10min,將消毒好的種子取出用無菌水沖洗4-5次后接種于MS固體培養基上,整個操作在超凈工作臺進行,最后將接種后的MS固體培養放入培養室,培養時間23d,獲得無菌苗。

步驟2.胚軸誘導產生不定芽:將步驟1中無菌苗的胚軸切成0.3~0.5cm大小,置于誘導培養基培養,誘導培養基為MS基本培養基+1.5?mg/l?6-BA?+?0.15mg/l?NAA+?3%蔗糖+?0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,8d即產生黃綠色愈傷,17d分化出不定芽。

步驟3.繼代增殖培養:將步驟2分化出的不定芽切分后置增殖培養基上進行繼代培養,增殖培養基為MS培養基+1.5mg/l?6-BA?+?0.15mg/l?NAA+?3%蔗糖+?0.9%瓊脂,pH5.8-6.0,培養15d分化成叢生芽,增殖倍數為6。

步驟4.培養生根苗:選2~3cm高的叢生芽,將其分成單株,轉移到生根培養基上進行生根培養,生根培養基為:1/2MS?+?0.4mg/l?NAA+?3%?蔗糖+?0.9%?瓊脂,pH5.8-6.0,7d即分化出不定根,形成完整的牽牛子植株—生根苗,生根率100%。

以上4個步驟均在無菌條件下進行,培養條件同為溫度25±2°C,光照時間12h/d,光照強度2000~3000Lux,夜間保持黑暗。

步驟5.練苗移栽:當生根苗的根長到1cm左右時將生根苗轉移到智能溫室,在自然光照下馴化3天,使生根苗逐漸適應周圍環境,取出生根苗洗凈根部的附著物,用0.1%的高錳酸鉀溶液浸苗消毒1min,移入苗床進行種苗培育,移栽基質選用滅菌草炭加珍珠巖,二者比例為2:1,移栽期內保持部分遮光和適當的濕度,長出新根后,適當增加光照,14d可至正常生長,期間每周噴灑1次0.1%多菌靈,最后移入土壤形成再生植株。?

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