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抑癌基因FBXW7在制備預防或治療乳腺腫瘤藥物中的應用、表達載體和診斷藥物.pdf

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基因 FBXW7 制備 預防 治療 乳腺 腫瘤 藥物 中的 應用 表達 載體 診斷
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摘要
申請專利號:

CN201310056124.7

申請日:

20130221

公開號:

CN103191443A

公開日:

20130710

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,C12N15/85,C12N15/66,C12Q1/68,A61P35/00,A61P15/14 主分類號: A61K48/00,C12N15/85,C12N15/66,C12Q1/68,A61P35/00,A61P15/14
申請人: 山東大學
發明人: 魏光偉,王允山,張鵬舉,何秀全
地址: 250061 山東省濟南市歷下區文化西路44號
優先權: 201210398268.6
專利代理機構: 濟南圣達知識產權代理有限公司 代理人: 鄧建國
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310056124.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種抑癌基因FBXW7在制備預防或治療乳腺腫瘤藥物中的應用、表達載體和診斷藥物,屬于醫藥生物技術領域,內容包括抑癌基因FBXW7在制備預防或治療乳腺腫瘤藥物中的應用,由FBXW7基因和pcDNA3.1載體構建而成的表達載體及其制備方法,至少包括一對特異性擴增FBXW7基因的引物、所述的引物由上游引物和下游引物組成的乳腺腫瘤診斷藥物。該抑癌基因FBXW7的表達與乳腺癌分子分型密切相關,在惡性程度高的乳腺癌中特異性低表達,并且具有抑制乳腺癌細胞生長的作用。因此篩選低表達該基因的乳腺癌,對乳腺癌的預后預測具有重要意義,特異性恢復該抑癌基因在乳腺癌細胞中的表達,能為乳腺癌的靶向個體化治療提供一種新方法。

權利要求書

1.抑癌基因FBXW7在制備預防或治療乳腺腫瘤藥物中的應用。2.如權利要求1所述的應用,其特征是,所述乳腺腫瘤預防或治療藥物以FBXW7基因為靶點。3.如權利要求1所述的應用,其特征是,所述藥物為藥劑學上可接受的任何一種劑型,包括粉劑、注射劑、膠囊、片劑或口服液。4.如權利要求1所述的應用,其特征是,所述乳腺腫瘤為腔上皮型乳腺癌A型或B型。5.一種預防或治療乳腺腫瘤的表達載體,其特征是,它是由FBXW7基因和pcDNA3.1載體構建而成。6.權利要求5所述的預防或治療乳腺腫瘤藥物的表達載體的制備方法,其特征是,步驟如下:(1)獲得cDNA:全長FBXW7基因的開放閱讀框采用RT-PCR法從正常乳腺組織的總RNA中獲得,然后進行擴增,擴增所用引物為FBXW7-cF:ttcaccatgaatcaggaactgctcFBXW7-cR:acacctgtacttcacttgatga;(2)將上述cDNA連接到TOPO?PCR?Blunt載體,轉化感受態細菌,在含青霉素培養LB板中培養,挑取陽性克隆培養,經測序選擇正確克隆;(3)FBXW7表達載體的構建抽提正確克隆的質粒,用EcoRⅠ酶切后,經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收目的片段,連入線性化的pcDNA3.1載體,轉化感受態細菌,在含青霉素培養LB板中培養,挑取陽性克隆培養,經酶切和測序雙鑒定后,保存正確克隆,抽提質粒,即得。7.一種乳腺腫瘤診斷藥物,其特征是,它至少包括一對特異性擴增FBXW7基因的引物,所述的引物由上游引物和下游引物組成,其中,所述的上游引物具有如SEQ?ID?NO.4所示的核苷酸序列,下游引物具有如SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列。8.如權利要求7所述的乳腺腫瘤診斷藥物,其特征是,所述的乳腺腫瘤診斷藥物以FBXW7基因為基礎的檢測手段,檢測手段為RT-PCR或實時定量PCR。

說明書

技術領域

本發明涉及醫藥生物技術領域,具體是抑癌基因FBXW7在乳腺癌制備預防、診斷及治療乳腺腫瘤藥物中的應用及其表達載體。

背景技術

腫瘤細胞基本特征是細胞生長失控和分化受阻。這種細胞生長失控和分化受阻是由于多種基因缺陷積累的結果,主要表現在兩個方面:一是癌基因的激活或過度表達,另一方面是腫瘤抑制基因的失活。正常情況下,腫瘤抑制基因能夠抑制細胞的惡性轉化,對正常細胞的增殖其負調節作用,當腫瘤抑制基因失活后,正常細胞增殖失控,轉化成腫瘤細胞。對癌基因和抑癌基因的研究對最終揭示細胞癌變的機制、實現腫瘤的預防和有效的基因治療具有重大的理論和現實意義。

腫瘤抑制基因(tumor?supperssor?genes),是指一類可抑制細胞生長、增殖,誘導細胞凋亡,并有抑制癌變潛能的基因。當它失活時,協同癌基因導致細胞惡性轉化。目前已分離的腫瘤抑制基因包括有,與DNA結合直接作用起到基因轉錄調節作用的,如p53、WT1;間接調節基因轉錄的,如Rb、APC;在細胞周期中發揮調節作用的,如NF1、TGFβ;以及調節DNA修復和基因組穩定性的,如MSH、MLH等。

FBXW7(F-box?and?WD?repeat?domain-containing?protein7,也稱為hCDC4,FBW7)是F-box蛋白家族成員,為SCF(Skp-cullin-F-box)泛素連接酶的靶蛋白識別組分。近期研究表明,FBXW7是P53依賴的抑癌基因,在多數人類惡性腫瘤中包括乳腺癌、直腸癌、胃癌、卵巢癌和白血病中存在突變或缺失。FBXW7通過泛素化調控多種癌蛋白如周期蛋白E、c-Myc、c-Jun、Notch和mTOR等的含量是其發揮腫瘤抑制作用最常見的機制。我們研究表明FBXW7是一重要抑癌基因網絡(p53-FBXW7-HIPK2-PTEN)的中心節點。FBXW7的突變或缺失會導致染色體不穩定性增加以及細胞生長失控。

但是目前,FBXW7在乳腺癌中的作用機制尚不完全清楚,其功能和表達變化的臨床意義尚未有報道。因此,分析FBXW7與乳腺癌發生發展的關系,探索針對FBXW7途徑的腫瘤治療和預警策略至關重要。

發明內容

本發明的目的是為克服上述現有技術的不足,提供一種新的抑癌基因在乳腺癌預后預測診斷及制備預防、治療乳腺腫瘤藥物中的應用。

為實現上述目的,本發明采用下述技術方案:

發明人研究發現,FBXW7(如SEQ?ID?NO.1所示)基因在乳腺癌腫瘤組織中的特異性低表達與乳腺癌的分子類型相關,并且在特定分子類型的乳腺癌中具有延長患者生存時間的作用,因此,在篩選FBXW7基因低表達的腫瘤標本的基礎上,特異性恢復該抑癌基因在腫瘤組織細胞中的表達,有望成為乳腺癌靶向治療的一種新方法和手段。

FBXW7表達作為乳腺癌預后預測和預警診斷的生物靶標。

抑癌基因FBXW7在制備預防或治療乳腺腫瘤藥物中的應用。

所述乳腺腫瘤預防或治療藥物以FBXW7基因為靶點。

所述藥物為藥劑學上可接受的任何一種劑型,包括粉劑、注射劑、膠囊、片劑或口服液。

所述乳腺腫瘤為導管型、基底型、腔上皮型乳腺癌A型或B型、ERBB2型、ER陽性和陰性。所述乳腺癌腫瘤包括但不限于乳腺癌。

一種預防或治療乳腺腫瘤的表達載體,它是由FBXW7基因和pcDNA3.1載體構建而成。

上述預防或治療乳腺腫瘤藥物的表達載體的制備方法,步驟過下:

(1)獲得cDNA:全長FBXW7基因的開放閱讀框采用RT-PCR法從正常乳腺組織的總RNA中獲得,然后進行擴增,擴增所用引物為

FBXW7-cF:(SEQ?ID?NO.2)ttcaccatgaatcaggaactgctc

FBXW7-cR:(SEQ?ID?NO.3)acacctgtacttcacttgatga

(2)將上述cDNA連接到TOPO?PCR?Blunt載體,轉化感受態細菌,在含青霉素培養LB板中培養,挑取陽性克隆培養,經測序選擇正確克隆;

(3)FBXW7表達載體的構建

抽提正確克隆的質粒,用EcoRⅠ酶切后,經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收目的片段,連入線性化的pcDNA3.1載體,轉化感受態細菌,在含青霉素培養LB板中培養,挑取陽性克隆培養,經酶切和測序雙鑒定后,保存正確克隆,抽提質粒,即得。

一種乳腺腫瘤診斷藥物,它至少包括一對特異性擴增FBXW7基因的引物,所述的引物由上游引物和下游引物組成,其中,所述的上游引物具有如GCCAAGGTCCAAGAAGTAGCA(SEQ?ID?NO.4)的核苷酸序列,下游引物具有如TAGCGACATGTCTGAGCTGC(SEQ?ID?NO.5)的核苷酸序列。

診斷方法是:

所述的乳腺腫瘤診斷藥物以FBXW7基因為基礎的檢測手段,檢測手段為RT-PCR或實時定量PCR。用GAPDH作為對照,PCR使用美國Applied?biosystem公司的定量RT-PCR試劑盒。反應總體積為20微升:采用1微升cDNA模板,加入2×PCR?buffer10微升,高純去離子水9微升。反應參數如下:95℃預熱5分鐘;35個循環設置如下,95℃,30秒;58℃,30秒;72℃45秒;最后進行表達分析。

與現有技術相比,本發明具有如下優點:

本發明提供了一種新抑癌基因在制備乳腺癌診斷、預防或治療藥物中的應用,以FBXW7基因為基礎的診斷藥物可方便快捷的在基因水平上實現腫瘤的檢測,同時,以FBXW7基因為靶點的藥物有望成為腫瘤靶向治療的一種新手段。

附圖說明

圖1a?GSE10780數據庫分析正常乳腺組織和乳腺癌組織中FBXW7mRNA表達水平;

圖1b?GSE3844數據庫分析正常乳腺組織和乳腺癌組織中FBXW7mRNA表達水平;

圖2a.FBXW7mRNA表達水平與患者無病生存率的相關性;

圖2b.FBXW7mRNA表達水平與患者總體生存率的相關性;

圖3雌激素受體狀態與FBXW7表達水平的相關性分析;

圖4FBXW7在不同分子亞型的乳腺癌組織中的表達分析;

圖5根據分子亞型分析FBXW7表達水平對無病生存率的影響

其中5a正常樣乳腺癌型

5b腔上皮型乳腺癌A型

5c腔上皮型乳腺癌B型

5dERBB2型

5e基底型

圖6根據分子亞型分析FBXW7表達水平對總生存率的影響

其中6a正常樣乳腺癌型

6b腔上皮型乳腺癌A型

6c腔上皮型乳腺癌B型

6dERBB2型

6e基底型

圖7是FBXW7基因表達載體的構建示意圖;

圖8是RT-PCR法和Western?blot法檢測FBXW7基因表達載體轉染前后的基因及蛋白表達情況;

圖9是應用集落形成實驗來分析FBXW7基因的抑癌功能;

圖10是應用細胞生長曲線實驗來分析FBXW7基因的抑癌功能。

具體實施方式

下面結合實施例和說明書附圖,更具體地說明本發明的內容。應當理解,本發明的實施并不局限于下面的實施例,對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。

在本發明中,若非特指,所有的份、百分比均為重量單位,所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。若無特別指明,實施例采用的方法為本領域通用技術。

本發明所述的抑癌基因FBXW7基因在開發乳腺癌診斷、預防和治療手段中的應用,可參考常規的藥物配置方法和試劑開發。藥物劑型和生物劑型為醫學上認可的任何一種劑型,例如為粉劑、注射劑、膠囊、片劑或口服液。

實施例中未注明具體條件的實驗方法,是按照常規條件,例如Sambrook等所著的分子克隆實驗室手冊中所述的條件,或按照制造廠商說明書建議的條件。

試驗試劑:DNA聚合酶,Trizol試劑,小牛血清,磷酸鹽緩沖液,RPMI-1640培養基,青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶購于Invitrogen(USA)。Taq聚合酶購于Promega。乳腺癌細胞系購自美國的ATCC。逆轉錄反應使用HighCapacity?cDNA?Reverse?Transcription試劑盒(美國Applied?Biosystem公司)。

實施例1FBXW7基因在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的薈萃分析

1.材料和方法選取包含正常和乳腺癌樣本的2個轉錄組數據庫和10個包含臨床資料及基因表達數據的乳腺癌數據庫,在這些數據庫中的樣本均已通過Affymetrix?microarray?assay(either?HG-U133A?or?HG?U133Plus2.0)or?Agilent?oligo?microarray檢測分析(圖1a和圖1b,FBXW7mRNA的表達實通過Affymetrix?microarray方法檢測。通過對兩大數據庫GSE10780(a)and?GSE3844(b)的分析發現,相對于正常乳腺組織,乳腺腫瘤組織中的FBXW7mRNA表達水平顯著降低)。通過調取GEO網站中的相關數據進行分析。總計在10個數據庫中的1935個病人樣本中1900個能夠得到無病生存率(disease-free?survival,DFS)的資料。

2.統計分析通過卡方檢驗分析正常和乳腺癌之間在FBXW7基因mRNA表達水平的差異。采用Kaplan-Meier法分析無病和總生存率之間FBXW7的差異,分析FBXW7表達水平與相關分子亞型的相關性。所有分析均采用SPSS11.5.0,p<0.05表示具有統計學意義。

3.結果

我們首先分析FBXW7基因在兩個包含正常和乳腺癌樣本的數據庫(見SEQ?ID?NO.1)中的表達。FBXW7在浸潤性導管癌中的表達水平(IDC)比在正常的乳腺導管表達水平顯著降低(P=1.09E-13)(圖1a)。在另外的數據集,也發現乳腺癌FBXW7表達水平顯著低于在正常乳腺組織(P=0.0013)(圖1b)。

接下來,我們研究了從10個可公開獲得的數據庫(表1)中1900例乳腺癌患者的無病生存與FBXW7基因表達水平的關系。要做到這一點,我們首先根據FBXW7在每個數據庫中的表達將患者分為不同組別(“FBXW7高”,“中級FBXW7”,“FBXW7低”),然后統計匯集所有數據庫中的患者。所有患者的無病生存率(DFS)的曲線如圖2a所示。高表達FBXW7的患者(“FBXW7高”)相對于中表達(“FBXW7中級”)或低表達(“FBXW7低”)FBXW7的患者能夠顯著增加DFS(P=0.037)(圖2a)。在FBXW7中表達和低表達的群體之間的DFS曲線無顯著差異,這表明FBXW7表達對DFS的影響無劑量依賴性。令人驚訝的是,FBXW7表達對患者的整體存活率(OS)無顯著影響(P=0.35)(圖2b)。

ER狀態是乳腺癌預測復發及治療的重要檢測指標。因此,我們進行了ER陽性和ER陰性乳腺癌中FBXW7的表達分析。FBXW7低表達與ER陰性患者較短的DFS和OS(P=0.038和0.010)密切相關,然而與ER陽性患者的DFS和OS無相關性(圖3)。

分子亞型的不同是人類乳腺癌另一重要預后因素。接下來,我們研究是否能從分子亞型層面揭示FBXW7表達與乳腺癌具有特定的相關性。因此,樣本庫中的乳腺癌樣本被分為以下幾類:正常乳腺樣型(n=265);腔上皮型乳腺癌A型(n=550);腔上皮型乳腺癌B型(n=342);ERBB2的(N=193);基底細胞樣型(N=382);其他未分類組(N=282)。FBXW7表達水平在不同的亞型(P=2.28E-23)(圖4)均顯著不同。值得注意的是腔上皮型乳腺癌A型和B型中FBXW7表達較低,而正常乳腺樣型乳腺癌FBXW7表達顯著升高(圖4)。隨后,我們進行亞組分析FBXW7在每個分子亞型腫瘤中與患者生存時間的相關性。研究發現,僅在基底細胞樣型患者的FBXW7高表達能顯著增加患者的DFS(P=0.040)(圖5)。對不同亞型的患者而言,FBXW7對患者的OS長短有著不同的效果(圖6)。在正常乳腺樣腫瘤亞型,具有FBXW7高表達的患者其OS顯著縮短(P=0.044)(圖6a),而在ERBB2亞型和基底細胞樣亞型腫瘤患者中,高表達的FBXW7能顯著延長其OS(P=0.003和0.049)(圖6d和e)

4.結論

我們的薈萃分析表明,FBXW7作為ER陰性和基底細胞樣亞型乳腺癌患者具有重要的意義,可以作為一個診斷、治療和預后預測的靶標。

實施例2FBXW7cDNA的克隆和表達載體的構建

1.克隆專用cDNA合成

逆轉錄反應(RT)使用Fermentas公司的First?Synthesis?System?for?RT-PCR試劑盒,每個反應使用2μg總RNA。反應總體積為20μl:10×RT?buffer2μl,總RNA5μl,oligodT20引物1μl,10mM?dNTP1μl,25mM?MgCl24μl,0.1M?DTT1μl,RNaseOUT1μl,SuperScriptⅢ逆轉錄酶1μl,高純去離子水4μl。使用ABI?PCR儀進行逆轉錄反應,具體運行參數如下:25℃10min;37℃60min;75℃5min;冷卻至4℃。-20℃保存備用。

2.FBXW7cDNA的克隆

全長FBXW7基因的開放閱讀框采用RT-PCR法從正常乳腺組織的總RNA中擴增獲得,其中PCR使用Fermentas公司的Mix,反應總體積為50μl:2×PCR?Mix25μl,引物各1μl,cDNA模板5μl,高純度去離子水23μl。PCR反應參數如下:95℃預變性4min;反應35個循環:95℃,30s;58℃30s;72℃45s,72℃延伸1min。

運用TOPO技術,連接到TOPO?PCR?Blunt載體。具體步驟如下:取新鮮PCR產物2μl,加入載體1μl,試劑盒中NaCl溶液1μl,高純去離子水2μl。室溫下孵育10min后轉化細胞:將TOPO反應產物加入冰浴融化的感受態細菌中,冰浴孵育30min,42℃熱激活90s,加入試劑盒中SOB培養液1ml,37℃低俗培養1h,再將細菌培養液接種在含青霉素培養LB板中繼續常規培養過夜。第二天,挑取克隆培養,經測序選擇正確克隆。

3.FBXW7的克隆引物

FBXW7-cF:(SEQ?ID?NO.2)ttcaccatgaatcaggaactgctc

FBXW7-cR:(SEQ?ID?NO.3)acacctgtacttcacttgatga

4.FBXW7表達載體的構建

抽提正確克隆的質粒,用EcoRⅠ酶切后,經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收目的片段,連入線性化的pcDNA3.1。連接反應如下:載體1μl,回收插入5μl,連接酶緩沖液2μl,T4DNA連接酶1μl。16℃連接過夜。過夜連接產物參照步驟2中的細菌轉化程序進行轉化和細菌接種。挑取克隆培養,經酶切和測序雙鑒定后,保存正確克隆,抽提質粒,用于基因轉染。

5.結果分析

FBXW7基因的哺乳動物表達載體構建成功(見圖7,8)

實施例3集落形成實驗分析FBXW7基因的抑癌功能

1.操作過程

利用克隆形成實驗來檢測FBXW7基因對乳腺癌細胞生長的作用,100000個細胞接種于12孔培養板培養過夜,使用FUGENE6試劑轉染FBXW7質粒,并使用空的pcDNA3.1載體作為對照。轉染48h后,轉染的細胞均分成三組重新接種,并使用含有400μg/ml的G418培養基培養10-15d,形成的克隆選用甲醇固定,然后用龍膽紫染色,大于等于50個細胞的克隆被統計用于分析。

2.結果分析

BT549細胞中,當外源轉入FBXW7基因后,腫瘤細胞形成克隆的能力顯著降低(圖9)。表明FBXW7具有抑制乳腺癌細胞增殖的功能。

實施例4細胞生長曲線法分析FBXW7的功能

1.操作過程

利用細胞生長曲線實驗來檢測FBXW7基因對乳腺癌細胞生長的影響。基因轉染同實施例4。轉染細胞用含有400μg/ml的G418培養基培養篩選,獲得的穩定細胞株在12孔細胞培養板中連續培養4-5d,使用臺盼藍染色進行活細胞技術,所得結果如圖10所示,穩定表達FBXW7基因的細胞株的增殖能力顯著低于對照的空載體細胞株。

2.結果分析

當外源轉入FBXW7基因后,腫瘤細胞的生長能力被顯著抑制(見圖10)

實施例5

一種乳腺腫瘤診斷藥物,它至少包括一對特異性擴增FBXW7基因的引物,所述的引物由上游引物和下游引物組成,其中,所述的上游引物具有如SEQ?ID?NO.4所示的核苷酸序列,下游引物具有如SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列。

所述的乳腺腫瘤診斷藥物以FBXW7基因為基礎的檢測手段,檢測手段為RT-PCR或實時定量PCR。

診斷方法是:用GAPDH作為對照,PCR使用美國Applied?biosystem公司的定量RT-PCR試劑盒。反應總體積為20微升:采用1微升cDNA模板,加入2×PCR?buffer10微升,高純去離子水9微升。反應參數如下:95℃預熱5分鐘;35個循環設置如下,95℃,30秒;58℃,30秒;72℃45秒;最后進行表達分析。

結論:

FBXW7基因在乳腺癌組織中表達下降,且其表達水平與ER-乳腺癌患者的預后生存時間密切相關;通過克隆FBXW7cDNA,構建FBXW7基因的哺乳動物表達載體,發現使FBXW7基因在腫瘤細胞中高表達后,可以抑制腫瘤細胞生長。以上結果表明:FBXW7基因在乳腺癌中具有抑癌功能,特別是ER-型乳腺癌,檢測FBXW7基因的表達可以用于乳腺癌的診斷。而恢復FBXW7基因的抑癌功能則可以達到治療腫瘤的目的。因此,FBXW7基因在乳腺癌的診斷、預防及治療中均有一定的應用價值。

盡管本發明人已經對本發明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉,應當理解,對于本領域普通技術人員而言,對上述實施例作出修改和或變通或者采用等同的替代方案是顯然的,都不能脫離本發明精神的實質,本發明中出現的術語用于對本發明技術方案的闡述和理解,并不能構成對本發明的限制。

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