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一種木鱉子提取物及其制備方法和用途.pdf

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一種 木鱉子 提取物 及其 制備 方法 用途
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摘要
申請專利號:

CN201110442493.0

申請日:

20111226

公開號:

CN103169752B

公開日:

20150128

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/42,A61P35/00 主分類號: A61K36/42,A61P35/00
申請人: 復旦大學
發明人: 郁韻秋,劉洪瑞,林志燕
地址: 200433 上海市楊浦區邯鄲路220號
優先權: CN201110442493A
專利代理機構: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 吳桂琴
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110442493.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬醫學檢驗領域,涉及一種木鱉子提取物及其制備方法和抗腫瘤的用途。本發明對待測提取樣品冷浸過后,以高效液相色譜為手段進行分離和純化得到相應組分,制得具抗腫瘤活性的木鱉子提取物,經體外藥理實驗,實驗結果表明,木鱉子提取物通過誘導細胞凋亡和阻滯細胞生長周期顯著抑制癌細胞的增殖,對于人胃癌細胞及其他腫瘤細胞有明顯的抑制作用,可作為活性成分制備治療實體腫瘤的藥物,尤其是治療人胃癌、人前列腺癌或結腸癌的藥物。本發明制備方法簡單,方便且成本低;產率高,提取物組分純度高、重現性高。

權利要求書

1.木鱉子提取物在制備治療實體腫瘤藥物中的用途;所述的木鱉子提取物通過下述方法制備,1)樣品制備木鱉子中粉,用乙酸鈉溶液20mM,pH5.0在冰箱中4℃冷藏提取過夜,離心后濾液凍干得提取物F;2)樣品分離與純化采用半制備型的液相色譜柱,其填料為十八烷基鍵合相硅膠,高效液相系統采用半制備型的紫外檢測器以及高壓泵,流動相采用A:0.05%甲酸B:90%乙腈+10%水,其中含0.045%甲酸,梯度洗脫,依照岀峰情況和保留時間收集,得有效部位;其中,色譜條件是:色譜柱:YMC-Pack?ODS-A?150×10mm,5μm;柱溫:室溫;流動相:A:0.05%甲酸B:90%乙腈+10%水,其中含0.045%甲酸;流速:2ml/min;進樣量:1000μL;檢測器:紫外可變波長檢測器,檢測波長254nm;洗脫方式:梯度洗脫,收集26-40min餾分,合并收集液凍干后于-20℃冰箱保存備用。2.按權利要求1的用途,其特征在于,所述的實體腫瘤是人胃癌、人前列腺癌或結腸癌。

說明書

技術領域

本發明屬醫學檢驗領域,涉及中藥材中的活性物質,具體涉及一種木鱉子提取物及其制備方法和抗腫瘤的用途。

背景技術

據統計報道,惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類生命的疑難疾病,是僅次于心臟病的第二殺手。目前,臨床實踐常用的對惡性腫瘤的藥物治療方法大多首選化療,然而,化療時會帶來極其嚴重的副作用。現有技術研究報道若干中草藥在治療疑難雜癥、惡性腫瘤等方面具有獨到之處。因此,從天然資源中尋找和篩選抗腫瘤的活性成分,以進一步開發有效低毒的治療惡性腫瘤的藥物,已經引起醫藥研究者的廣泛關注。

木鱉子為葫蘆科植物木鱉(Momordica?cochinchinensis(Lour.)Spreng)的干燥成熟種子,主產于廣西、四川、湖北、河南、安徽、浙江、福建、廣東、貴州、云南等地。據《現代中藥大辭典》記載,木鱉子性味苦、微甘,有毒,入肝、脾、胃經,具散結消腫,攻毒療瘡功效,常用于瘡瘍腫毒,乳癰,瘰疬,痔漏,干癬,禿瘡。

有研究將中藥材木鱉子運用在抗腫瘤復方中,與其它中藥成分起協同作用,但中藥復方尚達不到國家促進中藥產業化、國際化以及對中藥標準水平的要求。有關研究者期望,從天然中藥材木鱉子中篩選抗腫瘤的活性成分以進一步開發有效低毒的治療惡性腫瘤的藥物。

迄今,尚未見有關木鱉子提取物其獨特的并通過體外藥理實驗證明的抗腫瘤活性的報道。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術存在的缺陷,提供一種木鱉子提取物及其制備方法。

本發明的進一步目的是提供該木鱉子提取物的抗腫瘤活性,尤其是對人胃癌、人前列腺癌和結腸癌抑制作用。

本發明對中藥材木鱉子進行,從中提取得到一種活性提取物,通過體外藥理實驗證明該提取物對人胃癌細胞SGC7901、人前列腺癌細胞PC-3和小鼠結腸癌細胞CT-26具有抑制其生長作用,進一步可作為活性成分制備治療人胃癌、人前列腺癌和結腸癌的藥物,為中藥材木鱉子提供了新的廣闊的應用前景。

本發明提供了制備木鱉子中活性提取物的方法,其包括步驟:

1)樣品制備

木鱉子中粉,用乙酸鈉溶液20mM,pH?5.0在冰箱中4℃冷藏提取過夜,離心后濾液凍干得提取物F;

2)樣品分離與純化

采用半制備型的液相色譜柱,其填料為十八烷基鍵合相硅膠,高效液相系統采用半制備型的紫外檢測器以及高壓泵,流動相采用A:0.05%甲酸B:90%乙腈+10%水(含0.045%甲酸),梯度洗脫,依照出峰情況和保留時間收集,得有效部位。

更具體的,本發明的木鱉子中活性提取物通過下述方法制備:

將木鱉子中藥材粉碎得到木鱉子中粉,取木鱉子中粉100g,用500ml乙酸鈉溶液(20mM,pH?5.0)在冰箱中4℃冷藏提取過夜,離心后濾液凍干得提取物,于-20℃冰箱中保存備用。將提取得到的木鱉子提取物凍干粉用水溶解后,離心過濾除去少量不溶雜質,用色譜法進行進一步的分離(如圖1所示),色譜條件是:色譜柱:YMC-Pack?ODS-A(150×10mm,5μm);柱溫:室溫;流動相:A:0.05%甲酸B:90%乙腈+10%水(含0.045%甲酸);流速:2ml/min;進樣量:1000μL;檢測器:紫外可變波長檢測器(VWD),檢測波長254nm。

洗脫方式:梯度洗脫(如表1所示),收集26-40min餾分,合并收集液凍干后于-20℃冰箱中保存備用。

表1木鱉子提取物梯度洗脫時間表

本發明對提取得到活性提取物,進行了體外藥理實驗,通過細胞培養實驗,檢測了木鱉子提取物在體外對人胃癌細胞SGC7901、人前列腺癌細胞PC-3和小鼠結腸癌細胞CT-26的作用及機制,實驗結果表明,木鱉子提取物通過誘導細胞凋亡和阻滯細胞生長周期而顯著抑制癌細胞的增殖,對于人胃癌細胞SGC7901的抑制作用F3>F>F1>F2,其中F和F3對其他腫瘤細胞也有明顯的抑制作用(如圖2、表2所示)。

表2木鱉子提取物F及F3抑制人胃癌細胞SGC7901、人前列腺癌細胞PC-3和小鼠結腸癌細胞CT-26細胞增殖的IC50值。

表3是采用PI染色和流式細胞儀檢測木鱉子提取物對人胃癌細胞SGC7901生長周期的影響,結果顯示了不同濃度木鱉子提取物處理SGC7901細胞48h,其中A.Control;B.0.1mg/L;C.0.2mg/L,D.0.4mg/L。

表2

表3

本發明的木鱉子提取物可作為活性成分制備治療實體腫瘤的藥物,尤其是治療人胃癌、人前列腺癌或結腸癌的藥物。

本發明的木鱉子提取物及其制備方法具有如下優點:

(1)制備簡單,采用冷浸提取法,不僅方便且成本低;

(2)提取物組分純度高,用半制備高效液相色譜法進行分離和純化得到相應的組分,重現性還且純度高。

附圖說明

圖1木鱉子提取物色譜分離圖。

圖2木鱉子提取物(F,F1,F2,F3)抑制人胃癌細胞SGC7901增殖的作用,不同濃度木鱉子提取物(F,F1,F2,F3)處理時間為72h,與空白對照組相比,*p<0.05,#p<0.01。

圖3采用Hoechst?33258染色和PI/Annexin?V雙染檢測木鱉子提取物對SGC7901細胞凋亡的作用。不同濃度木鱉子提取物處理SGC7901細胞48h,A.Hoechst?33258染色;B.PI/Annexin?V雙染。

具體實施方式

實施例1.制備木鱉子提取物

將木鱉子中藥材粉碎得到木鱉子中粉,取木鱉子中粉100g,用500ml乙酸鈉溶液(20mM,pH?5.0)在冰箱中4℃冷藏提取過夜,離心后濾液凍干得提取物(F),于-20℃冰箱中保存備用,將提取得到的木鱉子提取物凍干粉(F)用水溶解后,離心過濾除去少量不溶雜質,用色譜法進行進一步的分離(色譜圖如圖1所示),收集26-40min餾分,合并收集液凍干后于-20℃冰箱中保存備用。

色譜條件如下:

色譜柱:YMC-Pack?ODS-A(150×10mm,5μm)

柱溫:室溫

流動相:A:0.05%甲酸B:90%乙腈+10%水(含0.045%甲酸)

流速:2ml/min

進樣量:1000μL

檢測器:紫外可變波長檢測器(VWD),檢測波長254nm

洗脫方式:梯度洗脫(表1)。

表1木鱉子提取物梯度洗脫時間表

實施例2.木鱉子提取物體外抗腫瘤作用試驗

將對數生長期的SGC7901細胞接種于96孔板中,分為空白對照組、卡鉑對照組和木鱉子提取物處理組(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml),37℃培養72h后進行MTT檢測,計算細胞增殖抑制率。結果顯示,隨著劑量增加,木鱉子提取物顯著抑制SGC7901細胞增殖(如圖2所示)。

實施例3.木鱉子提取物F及F3對不同腫瘤細胞的IC50值

將對數生長期的人胃癌細胞SGC7901、人前列腺癌細胞PC-3和小鼠結腸癌細胞CT-26分別接種于96孔板中,分為空白對照組、卡鉑對照組和木鱉子提取物處理組(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml),37℃培養48h、72h、96h后進行MTT檢測,計算細胞增殖抑制率。結果顯示,隨著劑量增加,木鱉子提取物顯著抑制各種癌細胞增殖(如表2所示)。

實施例4.木鱉子提取物抑制SGC7901細胞生長周期的作用

將對數生長期的SGC7901細胞接種于96孔板內,加入木鱉子提取物處理48h后,離心收集細胞,PBS洗2次,加入預冷的70%乙醇固定過夜。離心收集細胞,PBS洗1次,加入溴化乙錠(PI)避光孵育30分鐘,用流式細胞儀檢測,結果用ModFit軟件分析。結果顯示,隨著劑量增加,木鱉子提取物將SGC7901細胞阻滯于S期(如表3所示)。

實施例4.木鱉子提取物誘導SGC7901細胞生長凋亡的作用

將SGC7901將細胞接種于24孔板,加入木鱉子提取物處理48h后,加入終濃度為5μg/ml的Hoechst33342溶液,室溫避光放置5分鐘。棄培養基,4%甲醛固定10min,吸棄,PBS洗滌1-2次,加入1ml?PBS。熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞大小、形態。另外,離心收集SGC7901細胞,用預冷PBS漂洗1次,加入Annexin?V-FITC混合均勻,室溫避光溫育10min。PBS洗1次,加入適量PI,用流式細胞儀進行細胞凋亡定量檢測。結果顯示,木鱉子提取物具有明顯誘導SGC7901細胞凋亡的作用(如圖3所示)。

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