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在后代中固定農作物雜交種的雜種優勢的方法.pdf

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后代 固定 農作物 雜交種 雜種優勢 方法
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摘要
申請專利號:

CN201210347650.4

申請日:

20120713

公開號:

CN102972281A

公開日:

20130320

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A01H1/02 主分類號: A01H1/02
申請人: 俄羅斯農業科學院全俄水稻研究所國家科學研究院
發明人: Y·K·貢恰羅娃,E·M·哈里托諾夫
地址: 俄羅斯克拉斯諾達爾
優先權: 2011128792
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 殷駿
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210347650.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及農業領域,特別涉及選擇方法。請求保護的方法能夠以雜種優勢的雜交種為基礎、通過固定雜種優勢產生具有相似產量的高生產力品種,例如水稻品種。用于在后代中固定農作物雜交種的雜種優勢的方法,其中包括通過使用花藥培養產生純合的樣本、繼而恢復決定初代雜交種雜種優勢的基因復合體,該方法是通過基因型不同的雙單倍體品系之間的雜交來實現的,且雙單倍體品系之間的差異是根據一系列的形態學、生理學和生化性質、分子標記物(SSR,SNP等)、遺傳體系對樣本生產能力的貢獻、以及所有提到的這些方法的組合來進行評估的。所公開的方法能更有效地清理初代雜交種的基因型,加速雜種優勢決定基因(CGC)的聚集,避開(在其多個正常生命周期中)維持初代雜交種的植物生存能力這一長期、非常艱難的過程,并避免了與其后代繁殖相關的問題。該方法減少基本一半的初始雜種優勢決定基因復合體聚集所需的時間,并清除降低雜交種生產能力和生存能力的基因。

權利要求書

1.一種在后代中固定農作物雜交種的雜種優勢的方法,包括:通過使用花藥培養產生純合的樣本,繼而恢復決定初代雜交種雜種優勢的基因復合體,其特征在于,所述基因復合體通過基因型不同的雙單倍體品系之間的雜交來恢復,雙單倍體品系之間的差異根據一系列的形態學、生理學、生化性質、分子標記物(SSR,SNP等)、遺傳體系對樣本生產能力的貢獻、以及所有提到的這些方法的組合來進行評估。

說明書

本發明涉及農業領域,特別涉及選擇方法。?

依靠無性繁殖的方式固定宿根稻雜種優勢的方法是已知的(例如,參見F.Hu,P.Xu,J.Li,J.Zhou,E.Sacks,Z.Li,D.Tao,“Rice?heterosis?fixing?by?means?of?vegetative?propagation?from?Oryza?longistaminata”//摘要,第四屆國際雜交水稻研討會,2002年,第95頁),該方法包括轉移稻的野生親緣物種中與根形成相關的基因(例如,來自長雄蕊野生稻(orisa?longistominata),其中這些基因位于第三和第四染色體,分別與基因座CSR16和RM119相關聯)。?

一種固定雜種優勢效果的方法是已知的(例如,參見Bennett?J.,Xuezhi?Bi,Kathiresan,Chaudhury?A.,Ivahova?A.,Payne?T.,Dennis?L.和Khush?G,“Molecular?tools?for?achieving?synthetic?apomixes?for?hybrid?rice”//摘要,第四屆國際雜交水稻研討會,2002年,第12頁),其中該方法包括通過轉移來自其他物種,包括玉米、高粱和小麥等稻的親緣物種的單性生殖相關基因使雜交種轉變為單性生殖。?

已知另一種固定雜種優勢效果的方法(例如,參見V.Krishnasamy,2002),其中該方法包括產生雜交種的人工種子。此處人工種子是指體細胞胚的使用,其中生長調節劑、營養物質和抗生素的混合物作為該胚的胚乳。?

上述方法的不足之處在于,為了固定雜種優勢效果,它們提倡完整保留初代雜交種的基因復合體,包括在后代有性生殖的情況下導致生殖隔離(segregation)的致死和半致死基因。這些方法的主要目的均在于將雜交種轉變為無性繁殖或者單性生殖;此外,上述方法均未被實施。?

已知一種在后代中固定雜交種的雜種優勢的方法,該方法可被考慮為本發明的原型,其詳述于專利2453253,A01K67/00,A01K67/04,2000年7月27日公開,公告第21期(第2部分),該方法包括產生純合的樣本,用完全純合的樣本進行回交(于植物而言,即用花藥培養獲得的雙單倍體進行回交)以除去雜種優勢的?雜交種基因型中的致死或半致死基因。?

該方法的缺點是,歸因于雙單倍體樣本與初代樣本(即,其花粉被用于繁育雙單倍體植物種群的雜種優勢的雜交種植株)之間5-6代回交的復雜性。為了回交,必須要在多個正常生命周期內保持雜交種的生存能力;例如,水稻的生長期是3到5個月,然后植株死亡。為了消除致死和半致死基因并保留帶來雜種優勢的補償性基因復合體(CGC),必須產生雙單倍體樣本與其花粉被用于繁育雙單倍體的雜種優勢的雜交種初代植株之間的雜交種。產生雙單倍體的過程需要許多時間,約7個月;初代植株的生長周期已經完成,且植株非常衰弱。雙單倍體在衰弱的親本植株上進行的雜交導致非常低的結種率(seed?set)和雜交種子的生存能力,并且這一流程還將重復5-6次。?

本發明的目的在于提高保留雜交種中的補償性基因復合體(CGC)并且從雜種基因型中消除在后代中導致減產的半致死、致死基因以及無效基因這一過程的效率。?

技術效果在于,以雜種優勢的雜交種為基礎,產生具有類似產率的高生產力品種。?

當使用該方法時,上述技術效果通過在后代中固定雜交種的雜種優勢的方法來實現,該方法包括:通過花藥培養產生純合的植株以消除雜種優勢的雜交種基因型中的致死和半致死基因,根據本發明,在不同基因型的雙單倍體品系之間進行雜交以恢復雜交種的CGC,其中雜交過程僅涉及最具生產力的雙單倍體品系,且雙單倍體品系之間的差異根據一系列的形態學、生理學、和生化性質、分子標記物(SSR,SNP等)、遺傳體系對樣本生產力的貢獻等方式,以及所有提到的方式的細合來進行評估。?

賦予初代雜交種高生產力的最佳基因和因此不同樣本之間雙單倍體的交換和產生過程中分布的CGC的恢復,被作為不同雙單倍體品系之間(而非與初代雜交株之間)的雜交結果而聯合起來。這就使得育種過程避開了(在其多個正常生命周期中)維持初代雜交種的植物生存能力這一長期、非常艱難的過程,并避免了涉及其后代繁殖的問題。?

雜交過程中僅使用具有最高生產力的雙單倍體品系,這允許了在培養基的培?養階段能淘汰保有或獲得致死、半致死和亞致死基因的樣本,并因此提供了對初代雜交種基因型更為有效的清理。?

不同雙單倍體品系的選擇能夠使攜帶不同雜種優勢基因(CGC)的樣本得以展現,并因此加速了在所產生的基因型中的所述基因的聚集過程。?

不同雙單倍體品系雜交所獲得的不同的高生產力樣本之間的雜交,進一步減少了CGC聚集過程的時間。不同雙單倍體品系的兩次雜交幾乎節省了初代雜種優勢雜交種的CGC聚集所需時間的一半,這使得在育種過程的最初就能生成高生產力的品種。?

涉及對專利、科技信息來源的檢索,以及包括與本發明近似技術方案相關的數據在內的資源的新發現的現有技術分析可以得出結論:未發現具有與本發明技術方案所有必要技術特征相同的技術特征的近似技術方案。在所檢索到的近似技術方案中,根據必要技術特征組合,將所述原型鑒定為最近似技術方案允許確定在所要求的方法中的區別技術特征的組合,其是本發明技術方案能產生其所述技術效果的本質所在。?

因此,本發明請求保護的技術方案符合“新穎性”的條件。?

為了評估請求保護的本發明是否符合“創造性”條件,針對其不同于最接近的現有技術的特征,進一步檢索了披露類似特征的已知方法和技術方案。評估結果顯示,本領域提術人員按照現有科技和工程水平無法顯而易見地獲得要求的發明,特別的,更求的發明不提供已知的轉換。?

因此,依據法律規定,本發明技術方案符合“創造性”的條件。?

本發明技術方案的實質如下所示。?

根據所要求的方法,從雜種優勢的雜交種的花粉獲得多個雙單倍體品系的種群(圖1)以固定雜種優勢。評估這些雙單倍體品系的生產能力和生存能力,選擇具有最高生產能力的雙單倍體品系用于進一步工作。所選的高生產能力雙單倍體品系之間的基因型差異根據一系列形態學、生理學、生化性質、分子標記物、遺傳體系對樣本生產能力的貢獻等不同方法,以及所有這些方法之間的組合來進行評估,以展現攜帶初代CGC的不同基因的品系。不同的雙單倍體品系被用于雜交以恢復CGC,因為當繁育雙單倍體時,決定雜種優勢雜交種高產能力的基因分散于?不同的樣本中。雙單倍體由所獲雜交種的花粉通過花藥培養產生。雙單倍體的生產能力和生存能力均進行評估,最具生產能力的雙單倍體品系被選出用于進一步工作,對它們的生產能力也進行評估。這些步驟使得育種最初即能獲得高生產力品種。如果最初沒能在單一基因型中聯合足夠數量的CGC基因而使獲得的品系未顯示出初代雜交株的產量,即進行下一步:通過各種不同雙單倍體樣品雜交后的品系的雜交。再次由作為結果的雜交種的花粉衍生雙單倍體品系。最具生產能力的品系被從中選出和繁殖,對獲得的品種的生產能力進行。最好的品種送入新品種國家評測中心(the?State?Testing?of?New?Varieties)。?

附圖說明

圖1:在后代中固定雜交種的雜種優勢的方法?

在花藥培養中選擇性基因清除的可能性被示范于生物和分子水平。使用第一代和第二代雜交種、13個雜交組合的親本形式、和通過衍生自第一代雜交種的花粉的花藥培養產生的雙單倍體品系作為此類研究的材料。用初代雜交種與由其花粉產生的雙單倍體回交以在后代中固定雜交優勢。繁育雙單倍體以消除半致死等位基因,其中任何會降低樣本生存能力的無效基因座都在此視為此類等位基因。致死基因向單倍體植株原核的滲透會導致胚胎在發育的某一階段中死亡,只有基因型中含有最少致死基因和最多有利基因的個體才能存活。當使用花藥培養獲得植株時,樣本的存活率不超過0.5%,所以,大部分基因型得以排除。含有最少數目致死基因的基因型具有更高的生存概率,這就能使初代雜交種基因型中的致死和半致死基因得以清除,就此留下一組有利基因。?

回交在純合和雜合雜件中不含有害基因的樣本產生其基因型在純合條件中同樣不包含半致死基因的后代。該事實加上大量的基因修飾,不但使雜種優勢得以維持,而且在所有回交后代中得以增強。?

因此,固定雜種優勢的問題可通過獲得不含致死和半致死基因的雜交種而得以解決。同時,初代雜交種的主要基因型不僅應當維持,而且要進行提升。從第一代開始,回交后代的高生存能力即是最大的關注點,因為這些后代實質上都是自我繁殖的結果,而通常自我繁殖會嚴重降低生存力。高生存力可通過以下事實解釋,即作為簡單的兩性繁殖,回交不會導致純合條件下后代基因型中出現有害基因。同時回交將初代復合體中增強生存能力的部分基因回復到基因型中。獲得?了水稻13個雜交組合的回交后代。通過將回交植株與初代雜交種、由該初代雜交種花粉培育獲得的雙單倍體、二代雜交種以及親本形式進行比較來評估回交植株的生產能力。由于這些品種是多系品種(育種者控制形態型決定基因,然而,品種維持穩定性的多態性和生理過程的高效性),相同組合、但獲自相同品種不同遺傳品系的雜交的第一代雜交種,其在遺傳上也是不相同的。實施了兩個變化實驗。第一個變化實驗旨在通過用相同雜交組合的植株雜交產生回交后代,其在獲得雙單倍體品系之后進行播種。第二個變化實驗中,用雜交組合的最佳初代植株雜交獲得回交后代,其被選擇用于培育雙單倍體(在雙單倍體培育期間維持其生存能力并生長至開花)。?

第一個變化實驗表現出生殖隔離,其符合初代品種是多系品種、且回交后代應當僅通過使用作為花粉供體的植物來產生這一事實。第二個變化實驗未在回交后代中表現出生殖隔離,因此,在花藥培養中清除雜種優勢的雜交種基因型中的無效基因是可行的(表1-2)。?

表1F1和F2種群以及初代雜交種花粉培育出的雙單倍體與初代雜交種回交產生的種群(F1/DH)的變化參數(所有獲得的回交群體的平均值),2005?

??參數 ??F1/DH ??F1 ??F2 ??主穗重,g ??2.22 ??2.39 ??1.79 ??離差 ??0.06 ??0.06 ??0.16 ??均方差 ??0.24 ??0.24 ??0.40 ??變異系數,% ??11.49 ??10.17 ??22.4

表2F1,F1/DH種群的生產能力特征變化參數(對13個雜交組合而言),2006?

在產生大量的雙單倍體品系并因此使得能夠選擇高生產能力的雙單倍體品系用于回交的雜交組合中,后代植株的生產力比初代雜交種更高。(表3)?

當使用低生產力的雙單倍體與雜交種進行雜交時,通過回交獲得的植株的生產力比初代雜交種低;然而,方差分析并未顯示初代雜交種和回交植株之間生產能力的顯著差異。所以,當繁育雙單倍體清除有害基因時,必須產生更多數量的品系,因為低產和不育的品系經常能夠存活。長期在培養基上培養植物組織會導致大量突變的出現。?

表3F1,F2及F1/DH植株的生產能力分析?

*F1-第一代雜交種,F2-第二代雜交種?

DH-核細胞及體細胞的雙單倍體品系,此外一些攜帶致死基因的品系也能存活。但是,由于致死基因處于純合條件下,這些品系可以很容易相據其生產能力而被淘汰。因此,雙單倍體品系之間的選擇應當通過生產能力比較來進行。獲得?的數據顯示,當獲得雙單倍體時,親本形式所帶來的致死和半致死基因已經得以從初代雜交種中清除。通過使用200個標記物對由90個品系組成的yaponika亞種(由變種BR29和IR69428的雜交衍生)的雙單倍體種群進行分子標記(表4-5),以確認花藥培養中基因的選擇性消除。其中的100個以20cm的間隔均勻分布在整個基因組,與決定應激抗性(干旱、鹽度、高低溫)的屬性相關的其余的100個根據獲自文獻資料或互聯網的數據或者IRRI(國際水稻研究所)提供的數據(通過對適應性決定基因座的標記)來進行選擇。?

對多態性標記物的不同等位基因的發生頻率的研究顯示出某些等位基因的選擇性消除,這印證了利用花藥培養來消除降低生存能力的基因的可能性。?

在獲得雙單倍體、消除半致死基因之后,進行了同一雜交組合不同雙單倍體品系之間的雜交。當在雜種優勢的雜交種的基礎上獲得雙單倍體品系時,雜種優勢決定基因復合體分散在雙單倍體系中,然后進行了高生產力品系之間的雜交用以將該復合體合并到單個基因型中。根據對226個雜交組合提供高產的屬性的雜種優勢值的研究顯示,只有16.6%的組合顯示出雜種優勢,而同一雜交組合繁育而成的雙單倍體品系之間的雜種優勢百分比為52.92%,這證明,在雜交中使用雙單倍體品系能顯著提高獲得雜種優勢組合的可能性。?

表4花藥培養中與降低花粉粒生存能力的等位基因相關的標記物?

表5與適應性中性等位基因相關的標記物?

當獲得雙單倍體、消除半致死基因之后,進行了同一雜交組合不同雙單倍體品系之間的雜交。當在雜種優勢的雜交種的基礎上獲得雙單倍體品系時,雜種優勢決定基因復合體分散在雙單倍體系中,然后進行了高生產力品系之間的雜交用以將該復合體合并到單個基因型中。根據對226個雜交組合提供高生產力的屬性的雜種優勢值的研究顯示,只有16.6%的組合顯示出雜種優勢,而同一雜交組合繁育而成的雙單倍體品系之間的雜種優勢百分比為52.92%,這證明,在雜交中使用雙單倍體品系能顯著提高獲得雜種優勢組合的可能性。應當使用不同的品系以獲得更高的雜交效率,其能夠將雜種優勢組合所占比例提高到82.3%,從而使得能夠將初代雜交種補償基因復合體(CGC)合并到一起。?

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