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摘要
申請專利號:

CN201210132294.4

申請日:

20120428

公開號:

CN103156884B

公開日:

20150204

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K35/52,A61K38/17,A61P35/04 主分類號: A61K35/52,A61K38/17,A61P35/04
申請人: 陜西精健新星生物醫藥有限公司
發明人: 李偃,程輝
地址: 710065 陜西省西安市高新區錦業路38號粵漢國際A幢19層11901
優先權: CN201210132294A
專利代理機構: 西安智邦專利商標代理有限公司 代理人: 楊引雪
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210132294.4

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供的精漿的新用途,主要用于抑制癌細胞的擴散,特別是大于3kDa的精漿蛋白,對癌細胞的擴散抑制效果非常明顯。可用于抑制肺癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞、宮頸癌細胞、肝癌細胞或胃癌細胞等癌細胞的擴散。同時,本發明提供了精漿在制備治療癌癥的藥物中的應用,包括精漿在制備治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌等癌癥的藥物中的應用。

權利要求書

1.精漿蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的精漿蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用,其特征在于:所述精漿蛋白大于3kDa。3.根據權利要求2所述的精漿蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用,其特征在于:所述精漿蛋白的濃度大于2.5%。4.根據權利要求3所述的精漿蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用,其特征在于:所述精漿蛋白的濃度大于5.0%。5.根據權利要求4所述的精漿蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用,其特征在于:所述精漿蛋白的濃度大于7.5%。6.根據權利要求1至5任一所述的精漿蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用,其特征在于:所述癌癥是肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌。7.根據權利要求1至5任一所述的精漿蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用,其特征在于:所述治療癌癥的藥物是中西藥復方制劑。

說明書

技術領域

本發明涉及精漿的用途。

背景技術

腫瘤發生是由于細胞電子平衡失調所致。活性氧(自由基ROS)是一種缺乏電子的物質(不飽和電子物質),進入人體后到處爭奪電子,如果奪去細胞蛋白分子的電子,使蛋白質接上支鏈發生烷基化,形成畸變的分子而致癌。該畸變分子由于自己缺少電子,又要去奪取鄰近分子的電子,又使鄰近分子也發生畸變而致癌。這樣,惡性循環就會形成大量畸變的蛋白分子。這些畸變的蛋白分子繁殖復制時,基因突變,形成大量癌細胞,最后出現癌癥癥狀。而當自由基或畸變分子搶奪了基因的電子時,人就會直接得癌癥。人體得到負離子后,由于負離子帶負電荷,有多余的電子,可提供細胞缺失的電子,從而阻斷惡性循環,癌細胞就可防止或被抑制。

專利CN200710017785.3已描述了動物精液藥材在治療腫瘤、抑郁癥等多種疾病中的藥物應用,而精液包括精漿與精子,精漿是由前列腺液、精囊液、附睪液和尿道球腺分泌的少量液體一起組成,精漿是輸送精子的必須介質,并為精子提供能量和營養物質;精漿由前列腺、精囊腺和尿道球腺分泌產生,精漿里含有果糖和蛋白質,是精子的營養物質,精漿中還含有前列腺素和一些酶類物質,是一類天然有機物質,沒有毒副作用。

現有技術并未確定動物精液中何種物質起到抑制腫瘤等疾病的作用,直接應用動物精液制備的藥物純度也較低,因此效用較差,患者的服用劑量大;同時,在傳統的認識中,人們并沒有發現精漿的藥用價值。

發明內容

本發明提供的精漿的新用途,主要用于抑制癌細胞的擴散,特別是大于3kDa的精漿蛋白,對癌細胞的擴散抑制效果非常明顯。

本發明的具體技術解決方案如下:

精漿用于抑制癌細胞的擴散,精漿用于抑制肺癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞、宮頸癌細胞、肝癌細胞或胃癌細胞等癌細胞的擴散。

精漿為活性成分的藥物制劑。

精漿在制備治療癌癥的藥物中的應用。

精漿在制備治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌等癌癥的藥物中的應用。

精漿用于制備膠囊、顆粒、片劑、滴丸、中西藥復方制劑、口服液或注射液。

精漿蛋白用于抑制癌細胞的擴散,精漿蛋白用于抑制肺癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞、宮頸癌細胞、肝癌細胞或胃癌細胞等癌細胞的擴散。

精漿蛋白為活性成分的藥物制劑。

精漿蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用。

精漿蛋白在制備治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌等癌癥的藥物中的應用。

精漿用于制備膠囊、顆粒、片劑、滴丸、中西藥復方制劑、口服液或注射液。

上述精漿蛋白尤其是分子直徑大于3kDa,和/或濃度大于2.5%的精漿蛋白,效果更佳。

本發明的優點在于:

本發明通過大量的實驗研究,突破現有技術應用上的局限性,獲取了精漿在治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌等癌癥的藥物中的應用。

同時,本發明通過實驗發現,抑制癌細胞的作用還與精漿中精漿蛋白的分子直徑以及與精漿濃度有關,精漿蛋白分子大于3kDa后抑制作用明顯,精漿濃度或精漿蛋白濃度處于2.5%~5.0%時效果一般,5.0%~7.5%效果較佳,大于7.5%~10.0%后抑制作用明顯。

精漿可制成可制成膠囊、顆粒、片劑、滴丸、口服液、注射液等各種制劑應用于臨床,優選為膠囊。本品也可與其他藥物制成中西藥復方制劑應用。

具體實施方式

人大細胞肺腫瘤細胞株NCI-H460分析,所用試劑如下:

RPMI-1640培養基為Thermo公司(北京)產品;胎牛血清為Thermo公司(北京)產品;MTT為Invitrogen公司產品;其余試劑均為進口分析純;

磷酸緩沖鹽溶液(PBS):NaCl?8g,KCl?0.2g,Na2HPO4?1.44g,KH2PO40.24g,溶于800mlddH2O,HCl調節PH值至7.4,定容至1L,121℃高壓滅菌,4℃保存。

0.25%胰酶溶液:1.25g胰酶,溶解于500mlPBS,過濾除菌后4℃保存。

首先進行樣品分離:取-20℃保存于精液37℃緩慢融化后,冰浴條件下,吸取2ml樣品,4℃,3000rpm離心10min,精液樣品清晰分層,其中上清部分為精漿,將精漿移入另一支EP管中,標記為“上清”,沉淀部分為精子,以2mlPBS重懸,標記為“沉淀”;

同取融化后樣品,冰浴條件下,吸取4ml,加入超濾離心管中,4℃,7500rpm離心30min,吸取濾過液補足4ml,標記為“小分子”,吸取PBS將濾出部分充分混懸并補足4ml,標記為“大分子”;

其次進行目標細胞培養:復蘇NCI-H460一支,37℃,5%CO2培養5天至細胞增殖至一定數量,0.25%胰酶消化,1640培養基將細胞稀釋至1*105個/ml,接種至96孔板,每孔100μL,繼續于37℃,5%CO2培養24h至細胞穩定貼壁;

然后進行加藥及檢測:按表1所示濃度分別加入樣品,每個濃度取3個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

按表1所示濃度分別加入樣品上清、沉淀,大分子部分、小分子部分,每個濃度取4個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

表1樣品濃度梯度

結果與討論:酶標儀分別讀取樣品混合物、樣品上清、樣品沉淀、樣品大分子、樣品小分子對細胞作用作用的讀數,求均值,并以濃度為0處讀數作為對照,按以下公式求抑制百分率:

抑制百分率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)*100%,

結果見表2、表3、表4、表5、表6:

表2樣品混合物處理后MTT實驗結果

表3作用后MMT實驗結果

表4樣品沉淀作用后MMT實驗結果

表5樣品小分子作用后MMT實驗結果

表6樣品大分子作用后MMT實驗結果

綜合分析以上各表。由表2可知,該樣品對腫瘤細胞有致死作用,尤其是濃度大于10%后,抑制作用明顯;表3~表4顯示,將該樣品離心分離后,上清即精漿部分對腫瘤細胞有明顯致死作用,并有劑量依賴性,沉淀即精子部分對腫瘤細胞則無明顯致死作用;表5~表6則表明,該樣品經過超濾離心管分離后,小于3kDa的小分子部分對腫瘤細胞無明細致死作用,而大于3kDa的大分子部分對腫瘤細胞致死作用明顯,具有明顯的劑量依賴性。

綜上所述,精漿對肺癌細胞有明顯的致死作用。

人大腸癌細胞株PA319分析,所用試劑如下:

RPMI-1640培養基為Thermo公司(北京)產品;胎牛血清為Thermo公司(北京)產品;MTT為Invitrogen公司產品;其余試劑均為進口分析純;

磷酸緩沖鹽溶液(PBS):NaCl?8g,KCl?0.2g,Na2HPO4?1.44g,KH2PO40.24g,溶于800mlddH2O,HCl調節PH值至7.4,定容至1L,121℃高壓滅菌,4℃保存。

0.25%胰酶溶液:1.25g胰酶,溶解于500mlPBS,過濾除菌后4℃保存。

首先進行樣品分離:取-20℃保存于精液37℃緩慢融化后,冰浴條件下,吸取2ml樣品,4℃,3000rpm離心10min,精液樣品清晰分層,其中上清部分為精漿,將精漿移入另一支EP管中,標記為“上清”,沉淀部分為精子,以2mlPBS重懸,標記為“沉淀”;

同取融化后樣品,冰浴條件下,吸取4ml,加入超濾離心管中,4℃,7500rpm離心30min,吸取濾過液補足4ml,標記為“小分子”,吸取PBS將濾出部分充分混懸并補足4ml,標記為“大分子”;

其次進行目標細胞培養:復蘇PA319一支,37℃,5%CO2培養5天至細胞增殖至一定數量,0.25%胰酶消化,1640培養基將細胞稀釋至1*105個/ml,接種至96孔板,每孔100μL,繼續于37℃,5%CO2培養24h至細胞穩定貼壁;

然后進行加藥及檢測:按表1所示濃度分別加入樣品,每個濃度取3個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

按表1所示濃度分別加入樣品上清、沉淀,大分子部分、小分子部分,每個濃度取4個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

表1樣品濃度梯度

結果與討論:酶標儀分別讀取樣品混合物、樣品上清、樣品沉淀、樣品大分子、樣品小分子對細胞作用作用的讀數,求均值,并以濃度為0處讀數作為對照,按以下公式求抑制百分率:

抑制百分率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)*100%,

結果見表2、表3、表4、表5、表6:

表2樣品混合物處理后MTT實驗結果

表3作用后MMT實驗結果

表4樣品沉淀作用后MMT實驗結果

表5樣品小分子作用后MMT實驗結果

表6樣品大分子作用后MMT實驗結果

綜合分析以上各表。由表2可知,該樣品對腫瘤細胞有致死作用,尤其是濃度大于10%后,抑制作用明顯;表3~表4顯示,將該樣品離心分離后,上清即精漿部分對腫瘤細胞有明顯致死作用,并有劑量依賴性,沉淀即精子部分對腫瘤細胞則無明顯致死作用;表5~表6則表明,該樣品經過超濾離心管分離后,小于3kDa的小分子部分對腫瘤細胞無明細致死作用,而大于3kDa的大分子部分對腫瘤細胞致死作用明顯,具有明顯的劑量依賴性。

綜上所述,精漿對大腸癌細胞有明顯的致死作用。

人宮頸癌細胞株Hela229分析,所用試劑如下:

RPMI-1640培養基為Thermo公司(北京)產品;胎牛血清為Thermo公司(北京)產品;MTT為Invitrogen公司產品;其余試劑均為進口分析純;

磷酸緩沖鹽溶液(PBS):NaCl?8g,KCl?0.2g,Na2HPO4?1.44g,KH2PO40.24g,溶于800mlddH2O,HCl調節PH值至7.4,定容至1L,121℃高壓滅菌,4℃保存。

0.25%胰酶溶液:1.25g胰酶,溶解于500mlPBS,過濾除菌后4℃保存。

首先進行樣品分離:取-20℃保存于精液37℃緩慢融化后,冰浴條件下,吸取2ml樣品,4℃,3000rpm離心10min,精液樣品清晰分層,其中上清部分為精漿,將精漿移入另一支EP管中,標記為“上清”,沉淀部分為精子,以2mlPBS重懸,標記為“沉淀”;

同取融化后樣品,冰浴條件下,吸取4ml,加入超濾離心管中,4℃,7500rpm離心30min,吸取濾過液補足4ml,標記為“小分子”,吸取PBS將濾出部分充分混懸并補足4ml,標記為“大分子”;

其次進行目標細胞培養:復蘇Hela229一支,37℃,5%CO2培養5天至細胞增殖至一定數量,0.25%胰酶消化,1640培養基將細胞稀釋至1*105個/ml,接種至96孔板,每孔100μL,繼續于37℃,5%CO2培養24h至細胞穩定貼壁;

然后進行加藥及檢測:按表1所示濃度分別加入樣品,每個濃度取3個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

按表1所示濃度分別加入樣品上清、沉淀,大分子部分、小分子部分,每個濃度取4個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

表1樣品濃度梯度

結果與討論:酶標儀分別讀取樣品混合物、樣品上清、樣品沉淀、樣品大分子、樣品小分子對細胞作用作用的讀數,求均值,并以濃度為0處讀數作為對照,按以下公式求抑制百分率:

抑制百分率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)*100%,

結果見表2、表3、表4、表5、表6:

表2樣品混合物處理后MTT實驗結果

表3作用后MMT實驗結果

表4樣品沉淀作用后MMT實驗結果

表5樣品小分子作用后MMT實驗結果

表6樣品大分子作用后MMT實驗結果

綜合分析以上各表。由表2可知,該樣品對腫瘤細胞有致死作用,尤其是濃度大于10%后,抑制作用明顯;表3~表4顯示,將該樣品離心分離后,上清即精漿部分對腫瘤細胞有明顯致死作用,并有劑量依賴性,沉淀即精子部分對腫瘤細胞則無明顯致死作用;表5~表6則表明,該樣品經過超濾離心管分離后,小于3kDa的小分子部分對腫瘤細胞無明細致死作用,而大于3kDa的大分子部分對腫瘤細胞致死作用明顯,具有明顯的劑量依賴性。

綜上所述,精漿對宮頸癌細胞有明顯的致死作用。

人乳腺癌細胞株MCF-7分析,所用試劑如下:

RPMI-1640培養基為Thermo公司(北京)產品;胎牛血清為Thermo公司(北京)產品;MTT為Invitrogen公司產品;其余試劑均為進口分析純;

磷酸緩沖鹽溶液(PBS):NaCl?8g,KCl?0.2g,Na2HPO4?1.44g,KH2PO40.24g,溶于800mlddH2O,HCl調節PH值至7.4,定容至1L,121℃高壓滅菌,4℃保存。

0.25%胰酶溶液:1.25g胰酶,溶解于500mlPBS,過濾除菌后4℃保存。

首先進行樣品分離:取-20℃保存于精液37℃緩慢融化后,冰浴條件下,吸取2ml樣品,4℃,3000rpm離心10min,精液樣品清晰分層,其中上清部分為精漿,將精漿移入另一支EP管中,標記為“上清”,沉淀部分為精子,以2mlPBS重懸,標記為“沉淀”;

同取融化后樣品,冰浴條件下,吸取4ml,加入超濾離心管中,4℃,7500rpm離心30min,吸取濾過液補足4ml,標記為“小分子”,吸取PBS將濾出部分充分混懸并補足4ml,標記為“大分子”;

其次進行目標細胞培養:復蘇MCF-7一支,37℃,5%CO2培養5天至細胞增殖至一定數量,0.25%胰酶消化,1640培養基將細胞稀釋至1*105個/ml,接種至96孔板,每孔100μL,繼續于37℃,5%CO2培養24h至細胞穩定貼壁;

然后進行加藥及檢測:按表1所示濃度分別加入樣品,每個濃度取3個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

按表1所示濃度分別加入樣品上清、沉淀,大分子部分、小分子部分,每個濃度取4個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

表1樣品濃度梯度

結果與討論:酶標儀分別讀取樣品混合物、樣品上清、樣品沉淀、樣品大分子、樣品小分子對細胞作用作用的讀數,求均值,并以濃度為0處讀數作為對照,按以下公式求抑制百分率:

抑制百分率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)*100%,

結果見表2、表3、表4、表5、表6:

表2樣品混合物處理后MTT實驗結果

表3作用后MMT實驗結果

表4樣品沉淀作用后MMT實驗結果

表5樣品小分子作用后MMT實驗結果

表6樣品大分子作用后MMT實驗結果

綜合分析以上各表。由表2可知,該樣品對腫瘤細胞有致死作用,尤其是濃度大于10%后,抑制作用明顯;表3~表4顯示,將該樣品離心分離后,上清即精漿部分對腫瘤細胞有明顯致死作用,并有劑量依賴性,沉淀即精子部分對腫瘤細胞則無明顯致死作用;表5~表6則表明,該樣品經過超濾離心管分離后,小于3kDa的小分子部分對腫瘤細胞無明細致死作用,而大于3kDa的大分子部分對腫瘤細胞致死作用明顯,具有明顯的劑量依賴性。

綜上所述,精漿對乳腺癌細胞有明顯的致死作用。

人肝癌細胞株HepG2分析,所用試劑如下:

RPMI-1640培養基為Thermo公司(北京)產品;胎牛血清為Thermo公司(北京)產品;MTT為Invitrogen公司產品;其余試劑均為進口分析純;

磷酸緩沖鹽溶液(PBS):NaCl?8g,KCl?0.2g,Na2HPO4?1.44g,KH2PO40.24g,溶于800mlddH2O,HCl調節PH值至7.4,定容至1L,121℃高壓滅菌,4℃保存。

0.25%胰酶溶液:1.25g胰酶,溶解于500mlPBS,過濾除菌后4℃保存。

首先進行樣品分離:取-20℃保存于精液37℃緩慢融化后,冰浴條件下,吸取2ml樣品,4℃,3000rpm離心10min,精液樣品清晰分層,其中上清部分為精漿,將精漿移入另一支EP管中,標記為“上清”,沉淀部分為精子,以2mlPBS重懸,標記為“沉淀”;

同取融化后樣品,冰浴條件下,吸取4ml,加入超濾離心管中,4℃,7500rpm離心30min,吸取濾過液補足4ml,標記為“小分子”,吸取PBS將濾出部分充分混懸并補足4ml,標記為“大分子”;

其次進行目標細胞培養:復蘇HepG2一支,37℃,5%CO2培養5天至細胞增殖至一定數量,0.25%胰酶消化,1640培養基將細胞稀釋至1*105個/ml,接種至96孔板,每孔100μL,繼續于37℃,5%CO2培養24h至細胞穩定貼壁;

然后進行加藥及檢測:按表1所示濃度分別加入樣品,每個濃度取3個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

按表1所示濃度分別加入樣品上清、沉淀,大分子部分、小分子部分,每個濃度取4個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

表1樣品濃度梯度

結果與討論:酶標儀分別讀取樣品混合物、樣品上清、樣品沉淀、樣品大分子、樣品小分子對細胞作用作用的讀數,求均值,并以濃度為0處讀數作為對照,按以下公式求抑制百分率:

抑制百分率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)*100%,

結果見表2、表3、表4、表5、表6:

表2樣品混合物處理后MTT實驗結果

表3作用后MMT實驗結果

表4樣品沉淀作用后MMT實驗結果

表5樣品小分子作用后MMT實驗結果

表6樣品大分子作用后MMT實驗結果

綜合分析以上各表。由表2可知,該樣品對腫瘤細胞有致死作用,尤其是濃度大于10%后,抑制作用明顯;表3~表4顯示,將該樣品離心分離后,上清即精漿部分對腫瘤細胞有明顯致死作用,并有劑量依賴性,沉淀即精子部分對腫瘤細胞則無明顯致死作用;表5~表6則表明,該樣品經過超濾離心管分離后,小于3kDa的小分子部分對腫瘤細胞無明細致死作用,而大于3kDa的大分子部分對腫瘤細胞致死作用明顯,具有明顯的劑量依賴性。

綜上所述,精漿對肝癌細胞有明顯的致死作用。

人胃癌細胞株SGC-7901分析,所用試劑如下:

RPMI-1640培養基為Thermo公司(北京)產品;胎牛血清為Thermo公司(北京)產品;MTT為Invitrogen公司產品;其余試劑均為進口分析純;

磷酸緩沖鹽溶液(PBS):NaCl?8g,KCl?0.2g,Na2HPO4?1.44g,KH2PO40.24g,溶于800mlddH2O,HCl調節PH值至7.4,定容至1L,121℃高壓滅菌,4℃保存。

0.25%胰酶溶液:1.25g胰酶,溶解于500mlPBS,過濾除菌后4℃保存。

首先進行樣品分離:取-20℃保存于精液37℃緩慢融化后,冰浴條件下,吸取2ml樣品,4℃,3000rpm離心10min,精液樣品清晰分層,其中上清部分為精漿,將精漿移入另一支EP管中,標記為“上清”,沉淀部分為精子,以2mlPBS重懸,標記為“沉淀”;

同取融化后樣品,冰浴條件下,吸取4ml,加入超濾離心管中,4℃,7500rpm離心30min,吸取濾過液補足4ml,標記為“小分子”,吸取PBS將濾出部分充分混懸并補足4ml,標記為“大分子”;

其次進行目標細胞培養:復蘇SGC-7901一支,37℃,5%CO2培養5天至細胞增殖至一定數量,0.25%胰酶消化,1640培養基將細胞稀釋至1*105個/ml,接種至96孔板,每孔100μL,繼續于37℃,5%CO2培養24h至細胞穩定貼壁;

然后進行加藥及檢測:按表1所示濃度分別加入樣品,每個濃度取3個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

按表1所示濃度分別加入樣品上清、沉淀,大分子部分、小分子部分,每個濃度取4個副孔,37℃,5%CO2培養24h后,換液并用PBS輕柔吹吸洗去孔內殘余培養液后,每孔加入MMT溶液5μL,新鮮培養基100μL。37℃孵育3h,吸去培養基,每孔加入DMSO150μL將MTT-甲充分溶解,溶解液轉移至96孔酶標板中,每孔轉移100μL,490nm處讀取吸光度。

表1樣品濃度梯度

結果與討論:酶標儀分別讀取樣品混合物、樣品上清、樣品沉淀、樣品大分子、樣品小分子對細胞作用作用的讀數,求均值,并以濃度為0處讀數作為對照,按以下公式求抑制百分率:

抑制百分率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)*100%,

結果見表2、表3、表4、表5、表6:

表2樣品混合物處理后MTT實驗結果

表3作用后MMT實驗結果

表4樣品沉淀作用后MMT實驗結果

表5樣品小分子作用后MMT實驗結果

表6樣品大分子作用后MMT實驗結果

綜合分析以上各表。由表2可知,該樣品對腫瘤細胞有致死作用,尤其是濃度大于10%后,抑制作用明顯;表3~表4顯示,將該樣品離心分離后,上清即精漿部分對腫瘤細胞有明顯致死作用,并有劑量依賴性,沉淀即精子部分對腫瘤細胞則無明顯致死作用;表5~表6則表明,該樣品經過超濾離心管分離后,小于3kDa的小分子部分對腫瘤細胞無明細致死作用,而大于3kDa的大分子部分對腫瘤細胞致死作用明顯,具有明顯的劑量依賴性。

綜上所述,精漿對胃癌細胞有明顯的致死作用。

現有技術中,對精漿從精液中分離的技術已經相當成熟,而從精漿中提取精漿蛋白以及篩選分子直徑大于3kDa的技術也相當成熟,故本發明主要陳述的是精漿對癌細胞的抑制作用。

結合上述,本發明通過對精漿的不同條件下對肺癌細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞、宮頸癌細胞、肝癌細胞或胃癌細胞的抑制作用整體分析,得出了精漿對癌細胞有明顯的抑制作用的結論,同時,對精漿進一步解析后,抑制癌細胞的作用還與精漿中精漿蛋白的分子直徑以及與精漿濃度有關,精漿蛋白分子大于3kDa后抑制作用明顯,精漿濃度或精漿蛋白濃度處于2.5%~5.0%時效果一般,5.0%~7.5%效果較佳,大于7.5%~10.0%后抑制作用明顯,具體數據與所抑制的癌細胞類型相關。

實施例1

精漿為活性成分制備的膠囊,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿含量為52.5%。

實施例2

精漿為活性成分制備的顆粒,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿含量為60.2%。

實施例3

精漿為活性成分制備的片劑,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿含量為73.5%。

實施例4

精漿為活性成分制備的滴丸,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿含量為81.9%。

實施例5

精漿為活性成分制備的口服液,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿含量為90.1%。

實施例6

精漿為活性成分制備的注射液,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿含量為77.3%。

實施例7

精漿蛋白為活性成分制備的膠囊,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿蛋白含量為40.5%。

實施例8

精漿蛋白為活性成分制備的顆粒,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿蛋白含量為51.3%。

實施例9

精漿蛋白為活性成分制備的片劑,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿蛋白含量為56.5%。

實施例10

精漿蛋白為活性成分制備的滴丸,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿蛋白含量為73.2%。

實施例11

精漿蛋白為活性成分制備的口服液,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿蛋白含量為79.2%。

實施例12

精漿蛋白為活性成分制備的注射液,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中精漿蛋白含量為55.4%。

實施例13

大于3kDa的精漿蛋白為活性成分制備的膠囊,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中大于3kDa的精漿蛋白含量為13.5%。

實施例14

大于3kDa的精漿蛋白為活性成分制備的顆粒,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中大于3kDa的精漿蛋白含量為18.2%。

實施例15

大于3kDa的精漿蛋白為活性成分制備的片劑,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中大于3kDa的精漿蛋白含量為20.1%。

實施例16

大于3kDa的精漿蛋白為活性成分制備的滴丸,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中大于3kDa的精漿蛋白含量為22.6%。

實施例17

大于3kDa的精漿蛋白為活性成分制備的口服液,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中大于3kDa的精漿蛋白含量為24.9%。

實施例18

大于3kDa的精漿蛋白為活性成分制備的注射液,用于治療肺癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、肝癌或胃癌,但不限于上述癌癥,其中大于3kDa的精漿蛋白含量為19.5%。

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