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一種克服腫瘤耐藥性的載藥脂質體及其制備方法和應用.pdf

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一種 克服 腫瘤 耐藥性 脂質體 及其 制備 方法 應用
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申請專利號:

CN201110402113.0

申請日:

20111206

公開號:

CN103142481A

公開日:

20130612

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/127,A61K31/337,A61K47/34,A61P35/00,A61K31/047 主分類號: A61K9/127,A61K31/337,A61K47/34,A61P35/00,A61K31/047
申請人: 國家納米科學中心
發明人: 楊先達,孟潔,王琛
地址: 100190 北京市海淀區中關村北一條11號
優先權: CN201110402113A
專利代理機構: 北京潤平知識產權代理有限公司 代理人: 王浩然;周建秋
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法律狀態
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CN201110402113.0

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法律狀態類型:

摘要

本發明提供一種載藥脂質體,該載藥脂質體包括長循環脂質體和包裹于其中的藥物活性組分,所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。本發明還提供一種載藥脂質體的制備方法,該方法包括,利用薄膜-超聲法,將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述載藥脂質體,所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。以及提供由上述方法制得的載藥脂質體。此外,本發明還提供上述脂質體在制備抗腫瘤藥物中的應用和在腫瘤治療中的應用。本發明的載藥脂質體含有紫杉醇和白藜蘆醇,除了具有抑制藥物敏感腫瘤發展的活性外,其還可有效地抑制化療藥物耐藥性腫瘤的發展,具有極大的臨床應用價值。

權利要求書

1.一種載藥脂質體,其特征在于,該載藥脂質體包括長循環脂質體和包裹于其中的藥物活性組分,所述長循環脂質體為脂質體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質體,所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。2.根據權利要求1所述的載藥脂質體,其中,所述長循環脂質體與藥物活性組分的摩爾比為1∶0.001-0.5。3.根據權利要求1所述的載藥脂質體,其中,所述藥物活性組分中,紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比為1∶0.01-100。4.根據權利要求1-3中任意一項所述的載藥脂質體,其中,所述長循環脂質體中,脂質體與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩爾比為1∶0.01-1。5.一種載藥脂質體的制備方法,其特征在于,該方法包括,利用薄膜-超聲法,將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述載藥脂質體,所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。6.根據權利要求5所述的方法,其中,所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為1∶0.01-1∶0.001-0.5。7.根據權利要求5所述的方法,其中,所述藥物活性組分中,紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比為1∶0.01-100。8.根據權利要求5所述的方法,其中,所述脂質體源為大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂、蛋黃卵磷脂中的至少一種。9.根據權利要求5所述的方法,其中,所述薄膜-超聲法中的超聲條件包括,頻率為200-800W,超聲時間為5-30S,間隔時間為2-20S,循環次數為5-30次。10.根據權利要求5-9中任意一項所述的方法,其中,所述薄膜-超聲法包括以下步驟,(1)將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜蘆醇和第一有機溶劑混合,得到第一混合溶液,(2)蒸發去除第一混合溶液中的第一有機溶劑,形成薄膜,(3)將所述薄膜與純水或生理鹽水混合得到第二混合溶液,超聲得到所述載藥脂質體。11.根據權利要求10所述的方法,其中,所述第一有機溶劑為無水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一種。12.根據權利要求10所述的方法,其中,在第二混合溶液中,所述紫杉醇的濃度為1×10mol/L-10mol/L。13.由權利要求5-12中任意一項所述的方法制得的載藥脂質體。14.權利要求1-4和13中任意一項所述的載藥脂質體在制備抗腫瘤藥物中的應用。15.根據權利要求14所述的應用,其中,所述腫瘤為耐藥性腫瘤。16.權利要求1-4和13中任意一項所述的載藥脂質體在腫瘤治療中的應用。17.根據權利要求16所述的應用,其中,所述腫瘤為耐藥性腫瘤。

說明書

技術領域

本發明涉及一種克服腫瘤耐藥性的載藥脂質體,該載藥脂質體的制備方法,及其該載藥脂質體在制備抗腫瘤藥物和腫瘤治療中的應用。

背景技術

1、腫瘤耐藥性

目前,在許多腫瘤的治療中,常規化療效果差和預后不良是困擾臨床的重要難題,而腫瘤多藥耐藥性(MDR)則是腫瘤化療失敗的關鍵因素。經治療后.殘存的腫瘤干細胞耐藥性形成,常導致對某些藥物治療敏感性降低,并引起腫瘤復發甚至轉移。人惡性腫瘤對化療的耐藥性可分為先天性耐藥(nature?resistance)和獲得性耐藥(acquired?resistance);根據耐藥譜又分為原藥耐藥(primary?drug?resistance,PDR)和多藥耐藥(multidrug?resistance,MDR)。PDR只對誘導的原藥產生耐藥,面對其它藥物不產生產交叉耐藥;MDR是由一種藥物誘發,但同時又對其它多種結構和作用機制迥異的抗癌藥物產生交叉耐藥。

耐藥性產生的機制有多種,如:

DNA修復能力的增強:化療藥致使DNA損傷,當二氫葉酸還原酶(DHFR)和DNA損傷修復相關酶活性增強(MGMT)可增加其對化療藥的耐藥程度。

P-糖蛋白表達:P-糖蛋白是一種能量依賴性藥物排出泵,可以與一些抗腫瘤藥物結合,也有ATP結合位點。P-糖蛋白一旦與抗腫瘤藥物結合,通過ATP提供能量,就可將藥物從細胞內泵出細胞外,使藥物在細胞內濃度不斷下降,并使其細胞毒作用減弱直至散失,出現耐藥現象。P-糖蛋白在正常膽管、腎、小腸、腎上腺、造血干細胞等均有表達,負責激素運輸及排泌毒物等生理功能。P-糖蛋白高表達的腫瘤病人常伴預后不良,如低緩解率、高復發率、生存期短,可作為預后評價指標。

谷胱甘肽S-轉移酶:谷胱甘肽是一種含半胱氨酸的三肽,為細胞內主要的非蛋白巰基。谷胱甘肽S-轉移酶能夠催化機體內親電性化合物與GSH結合,使有毒化合物增加水溶性、減少毒性,最終排出細胞外。

2、紫杉醇

紫杉醇屬有絲分裂抑制劑或紡錘體毒素,是從太平洋紫杉樹皮中提取的二萜類化合物,是一種天然來源抗腫瘤藥,能夠誘導和促進微管的裝配,具有聚合和穩定微管的作用,致使快速分裂的腫瘤細胞在有絲分裂階段被牢牢固定,使癌細胞復制受阻斷而死亡,1992年美國FDA批準使用,是目前臨床上非常重要的用于卵巢癌和乳腺癌及非小細胞肺癌等癌癥的一線和二線治療用藥。也可用于頭頸癌、食管癌,精原細胞瘤,復發非何金氏淋巴瘤等的治療。其不良反應包括:過敏反應;骨髓抑制;神經毒性;心血管毒性;脫發以及炎癥等局部反應。

由于紫杉醇難溶于水,制劑由50%乙醇與50%的表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油衍生物配制而成,以增加紫杉醇的水溶性。該溶劑也存在毒副反應,如變態反應、中毒性腎損傷、神經毒性、心臟血管毒性等。

多烯紫杉醇注射液(艾素,多西他賽,Docetaxel?Injection)是由歐洲紅豆杉葉中提取物經合成而來的半合成紫杉醇類似物,作用機制是加強微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用,導致形成穩定的非功能性微管束,因而破壞腫瘤細胞的有絲分裂。它在細胞內濃度比紫杉醇高3倍,并在細胞內滯留時間長,這是它在體外試驗中比紫杉醇抗腫瘤活性大的重要原因。在體內試驗中,對小鼠的結腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢腫瘤移植物等有效。副作用與紫杉醇類似,其骨髓抑制毒性更大。多烯紫杉醇一般由聚山梨醇80配制而成。

脂質體是由磷脂和膽固醇組成的具有類似生物膜的雙分子層結構。1971年Rymen等人開始將其作為藥物載體。相比于其他載體,脂質體具有以下優點:細胞親合性和靶向性;緩釋性;降低藥物毒性,提高藥物穩定性。注射用紫杉醇脂質體(力撲素)是江蘇省藥物研究所、南京思科藥業有限公司、江蘇省脂質體藥物工程技術研究中心研制的新型藥物,于2004年上市推廣。是我國食品藥品監督管理局批準的第一個脂質體藥物,也是國際首次上市的注射用紫杉醇脂質體藥物。

力撲素是將難溶于水的紫杉醇包封在新型藥物載體-脂質體磷脂雙分子層中,解決了紫杉醇的溶解性問題;與普通紫杉醇藥物相比,力撲素具有的優勢有:

(1)解除了由溶媒引發的超過敏風險

紫杉醇脂質體從根本上革除了普通紫杉醇注射液必需使用的聚氧乙基代蓖麻油與無水乙醇混合溶媒,革除了超過敏反應發生的風險。并可不作預處理,這為臨床用藥提供了方便,使患者免除了大劑量使用激素產生的不良影響。

(2)紫杉醇脂質體的毒副反應較紫杉醇注射液明顯減輕

由于脂質體藥物獨特的藥代動力學特性,在體內半衰期延長、血藥濃度波動小等因素,與紫杉醇注射液相比,紫杉醇脂質體對血液系統、血壓和肝功能的影響更小,藥物毒副反應更低。此外,紫杉醇脂質體對血壓的影響明顯低于紫杉醇注射液,且外周血液和肝臟毒性反應明顯減弱。

(3)明顯提高機體對紫杉醇的耐受性

急性毒性試驗顯示:紫杉醇脂質體的LD50比紫杉醇注射液大一倍,表明其耐受性明顯提高,為臨床用藥加大劑量、提高療效提供了空間。

(4)半衰期延長、突顯緩釋功效

臨床前藥代動力學試驗表明:紫杉醇脂質體的半衰期較紫杉醇注射液明顯延長一倍以上。

(5)具有靶向給藥的特性

紫杉醇脂質體在肝臟、肺、淋巴組織等組織器官濃度明顯增高。跟蹤檢測不增加該器官毒性,有利于局部病變的治療。

通過實驗室研究及臨床觀察發現,紫杉醇脂質體解決了紫杉醇的溶解性問題;提高了紫杉醇在溶液中的穩定性;避免過敏反應而不影響抗腫瘤活性;另外,紫杉醇脂質體還具有腹腔、胸腔給藥的可能性。因此紫杉醇脂質體與紫杉醇相比具有一定的優勢。

但是隨著腫瘤化療藥物在臨床治療中的廣泛應用,腫瘤的耐藥性問題越來越突出,已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一。而上述各種形式的紫杉醇藥物對耐藥性腫瘤療效都較差。

3、白藜蘆醇

20世紀80年代,世界衛生組織調查發現,盡管法國人偏愛奶酪等高脂肪食物,但冠心病發病率和死亡率低于其他西方國家,其原因可能是與法國人常飲含白藜蘆醇的葡萄酒有關。此后,白藜蘆醇備受關注。到目前為止至少已在21科、31屬的72種植物中發現了白藜蘆醇。白藜蘆醇主要來源于蓼科Polygonaceae植物虎杖Polygonum?cuspidatum?Sieb.et?Zucc.的干燥根莖和根,葡萄科植物葡萄Vitis?vinifera果實的皮和籽,豆科Fabaceae植物花生Arachis?hypogaea的種子等。

白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑,可降低血液粘稠度,抑制血小板凝結和血管舒張,保持血液暢通,可預防癌癥的發生及發展,具有抗動脈粥樣硬化和冠心病,缺血性心臟病,高血脂的防治作用。

此外,白藜蘆醇還具有保護心血管、抗氧化、抗自由基、抗炎、抗菌等作用,而且還有很多的臨床使用實例。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中各種形式的化療藥物對耐藥性腫瘤療效均較差的缺陷,提供一種對耐藥性腫瘤療效較好的載藥脂質體及其制備方法和應用。

本發明提供一種載藥脂質體,其特征在于,該載藥脂質體包括長循環脂質體和包裹于其中的藥物活性組分,所述長循環脂質體為脂質體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修飾的脂質體,所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。

本發明還提供一種載藥脂質體的制備方法,其特征在于,該方法包括,利用薄膜-超聲法,將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述載藥脂質體,所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。以及提供由上述方法制得的載藥脂質體。

此外,本發明還提供上述載藥脂質體在制備抗腫瘤藥物中的應用和在腫瘤治療中的應用。

本發明的載藥脂質體含有紫杉醇和白藜蘆醇,除了對藥物敏感腫瘤的發展具有抑制活性外,其還可有效地抑制化療藥物耐藥性腫瘤的發展,因此,具有極大的臨床應用價值。

附圖說明

附圖用來提供對本發明的進一步理解,并且構成說明書的一部分,與下面的具體實施方式一起用于解釋本發明,但并不構成對本發明的限制。在附圖中:

圖1a和圖1b是本發明一種實施方式的載藥脂質體的透射電鏡圖;

圖2a顯示出本發明一種實施方式的載藥脂質體處理MCF-7敏感細胞24小時后的結果,圖2b顯示出該載藥脂質體處理MCF-7抗性細胞24小時后的結果;

圖3a顯示出本發明一種實施方式的載藥脂質體處理MCF-7敏感細胞48小時后的結果,圖3b顯示出該載藥脂質體處理MCF-7抗性細胞48小時后的結果;

圖4a顯示出本發明一種實施方式的載藥脂質體處理MCF-7敏感細胞72小時后的結果,圖4b顯示出該載藥脂質體處理MCF-7抗性細胞72小時后的結果;

圖5顯示出本發明一種實施方式的載藥脂質體處理耐藥乳腺癌荷瘤裸鼠后腫瘤的變化結果。

具體實施方式

本發明提供一種載藥脂質體,其特征在于,該載藥脂質體包括長循環脂質體和包裹于其中的藥物活性組分,所述長循環脂質體為脂質體表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)修飾的脂質體,所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。

本發明中,所述長循環脂質體與藥物活性組分的摩爾比可以與現有技術中脂質體載體與藥物活性組分的比例相同,優選地,所述長循環脂質體與藥物活性組分的摩爾比為1∶0.001-0.5,進一步優選為1∶0.01-0.3,最優選為1∶0.02-0.1。

根據本發明,所述藥物活性組分中,紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比可以在較寬的范圍內變化,例如,所述紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比可以為1∶0.01-100;本發明的發明人發現,在一定濃度范圍內,隨著白藜蘆醇量的增加,其與紫杉醇的協同作用也越來越顯著,優選地,所述紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比為1∶1-80,進一步優選為1∶3-40,綜合考慮白藜蘆醇的協同作用和紫杉醇的細胞毒性,最優選為1∶5-20。本發明的發明人發現,使用上述優選比例范圍內的紫杉醇和白藜蘆醇能夠獲得具有更高的治療效果的載藥脂質體。

根據本發明,所述長循環脂質體可以與現有技術中的常規的長循環脂質體相同,其中,脂質體源與二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩爾比可以在很寬的范圍內變化,例如可以為1∶0.01-1,優選為1∶0.02-0.2,進一步優選為1∶0.05-0.1。

本發明提供一種載藥脂質體的制備方法,其特征在于,該方法包括,利用薄膜-超聲法,將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分制成所述載藥脂質體,所述藥物活性組分為紫杉醇和白藜蘆醇。

其中,所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為可以為常規的脂質體載體與藥物活性組分的比例,優選地,所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和藥物活性組分的摩爾比為1∶0.01-1∶0.001-0.5,進一步優選為1∶0.02-0.2∶0.01-0.3,最優選為1∶0.05-0.1∶0.02-0.1。

根據本發明的方法,所述藥物活性組分中,紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比可以根據需要進行調節,優選地,所述紫杉醇和白藜蘆醇的摩爾比為1∶0.01-100,進一步優選為1∶1-80,再優選為1∶3-40,最優選為1∶5-20。

根據本發明,所述脂質體源可以為本領域任何常規的能夠制得脂質體載體的物質,包括但不限于大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂、蛋黃卵磷脂中的至少一種,優選為大豆卵磷脂。

所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇和白藜蘆醇均可以通過商購獲得。

本發明中,所述薄膜-超聲法的具體步驟為本領域技術人員公知,即,將各種原料溶解后去除溶劑制成薄膜,然后通過超聲破碎制得顆粒。

優選地,所述薄膜-超聲法中的超聲條件包括,頻率為200-800W,優選為300-500W;超聲時間為5-30S,優選為10-20S;間隔時間為2-20S,優選為5-10S;循環次數為5-30次,優選為10-20次。

具體地,所述薄膜-超聲法可包括以下步驟,

(1)將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜蘆醇和第一有機溶劑混合,得到第一混合溶液,

(2)蒸發去除第一混合溶液中的第一有機溶劑,形成薄膜,

(3)將所述薄膜與純水或生理鹽水混合得到第二混合溶液,超聲得到所述載藥脂質體。

其中,所述第一有機溶劑可以為能夠溶解各種原料的溶劑,優選為無水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一種,最優選為無水乙醇。

本發明中,所述蒸發的方法為本領域常規的方法,只要能夠將其中的第一有機溶劑去除即可,例如可以在旋轉蒸發儀中進行。

根據本發明,所述第一有機溶劑的加入量可以為本領域的常規選擇,優選地,在第一混合溶液中,所述紫杉醇的濃度為1×10-4mol/L-10mol/L。

所述純水或生理鹽水的加入量也可以為本領域的常規選擇,優選地,在第二混合溶液中,所述紫杉醇的濃度為1×10-5mol/L-10mol/L,進一步優選為1×10-3mol/L-1mol/L,最優選為5×10-2mol/L-0.5mol/L。

本發明對于所述脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜蘆醇和第一有機溶劑的混合方式沒有特別的限定,優選地,先將脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和第一有機溶劑混合,再加入紫杉醇和白藜蘆醇。其中,對于脂質體源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和第一有機溶劑三者的加入順序沒有特別的限定,對于再加入的紫杉醇和白藜蘆醇的加入順序也沒有特別的限定。本發明的發明人發現,通過上述優選的方法,能夠得到治療效果更好的載藥脂質體。

本發明提供由上述方法制得的載藥脂質體。

本發明還提供上述載藥脂質體在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明的所述載藥脂質體特別適合于制備抗耐藥性腫瘤的藥物。

本發明還提供上述載藥脂質體在腫瘤治療中的應用。本發明的所述載藥脂質體特別適合于治療耐藥性腫瘤。

所述腫瘤和耐藥性腫瘤包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞癌、頭頸癌、食管癌、精原細胞瘤、肝癌、肺腺細胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤,以及它們的耐藥性腫瘤中的至少一種。

通過以下實施例對本發明進行更詳細的說明。本發明的實施例中,所用大豆卵磷脂購自上海滬宇生化試劑有限公司,商品號為LE030A,CAS號為8002-43-5;所用蛋黃卵磷脂購自上海滬宇生化試劑有限公司,商品號為P0051;所用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000購自genzyme公司,商品號為LP-R4-039,CAS號為147867-65-0;所用紫杉醇(PTX)購自北京諾瑞醫藥技術有限公司,CAS號為33069-62-4;所用白藜蘆醇(Res)購自湖北興銀河化工有限公司,CAS號為501-36-0。

實施例1

本實施例用于制備載藥脂質體:PTX+Res脂質體-1。

(1)將4×10-2mol大豆卵磷脂、2×10-3mol二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與150ml的無水乙醇混合,溶解后加入3×10-4mol紫杉醇和1.2×10-3mol白藜蘆醇,得到第一混合溶液,

(2)蒸發去除第一混合溶液中的無水乙醇,形成薄膜,

(3)將所述薄膜與5ml生理鹽水混合,超聲得到載藥脂質體,即PTX+Res脂質體-1。

所述超聲的條件包括:頻率為350W,超聲18s,間隔8s,超聲15次。

實施例2

本實施例用于制備載藥脂質體:PTX+Res脂質體-2。

(1)將4×10-2mol大豆卵磷脂、2×10-3mol二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與200ml的無水乙醇混合,溶解后加入3×10-4mol紫杉醇和3.6×10-3mol白藜蘆醇,得到第一混合溶液,

(2)蒸發去除第一混合溶液中的無水乙醇,形成薄膜,

(3)將所述薄膜與4ml生理鹽水混合,超聲得到載藥脂質體,即PTX+Res脂質體-2。

所述超聲的條件包括:頻率為400W,超聲15s,間隔5s,超聲10次。

對比例1

根據實施例2的方法制備紫杉醇載藥脂質體(PTX脂質體),不同的是,不加入白藜蘆醇。

對比例2

根據實施例2的方法制備白藜蘆醇載藥脂質體(Res脂質體),不同的是,不加入紫杉醇。

對比例3

根據實施例2的方法,將4×10-2mol大豆卵磷脂和2×10-3mol二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與200ml的無水乙醇混合,制得長循環脂質體。

實施例3

本實施例用于制備載藥脂質體:PTX+Res脂質體-3。

(1)將8×10-2mol的大豆卵磷脂、2×10-3mol的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與100ml的氯仿混合,溶解后加入3×10-4mol紫杉醇和6×10-3mol白藜蘆醇,得到第一混合溶液,

(2)蒸發去除第一混合溶液中的氯仿,形成薄膜,

(3)將所述薄膜與3ml純水混合,超聲得到載藥脂質體,即PTX+Res脂質體-3。

所述超聲的條件包括:頻率為300W,超聲20s,間隔10s,超聲20次。

實施例4

本實施例用于制備載藥脂質體:PTX+Res脂質體-4。

(1)將0.4mol蛋黃卵磷脂、2×10-2mol二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000與100ml的無水乙醇混合,溶解后加入3×10-4mol紫杉醇和1.2×10-2mol白藜蘆醇,得到第一混合溶液,

(2)蒸發去除第一混合溶液中的無水乙醇,形成薄膜,

(3)將所述薄膜與2ml生理鹽水混合,超聲得到載藥脂質體,即PTX+Res脂質體-4。

所述超聲的條件包括:頻率為500W,超聲10s,間隔5s,超聲12次。

測試例1

用透射電鏡(型號為Tecnai?G2?F20?U-TWIN)對PTX+Res脂質體-3進行檢測,結果如圖1a和圖1b所示,由圖1a和圖1b可以看出,載藥脂質體形成了較為均一的直徑為70-100nm的顆粒。

測試例2

本測試例用于在細胞水平上檢測本發明的載藥脂質體的活性。

細胞實驗1:在96孔板中接種MCF-7敏感細胞(人乳腺癌細胞),接種量為5000個細胞/孔,細胞貼壁后加藥,根據藥物的不同分為4組,分別是:

(1)生理鹽水組;

(2)脂質體組(單獨加入對比例3制得的長循環脂質體);

(3)紫杉醇脂質體組(加入對比例1制得的PTX脂質體),其中,紫杉醇的在培養基中的終濃度為5μg/ml;

(4)同時包裹紫杉醇和白藜蘆醇的脂質體組(PTX+Res脂質體),其中,包括4個小組,分別加入實施例1-4制得的PTX+Res脂質體-1、PTX+Res脂質體-2、PTX+Res脂質體-3和PTX+Res脂質體-4,其中,各組中紫杉醇在培養基中的終濃度均為5μg/ml,而白藜蘆醇的終濃度分別是5,15,25,50μg/ml,每個濃度6個重復孔;

其中,(2)和(4)中加入PTX+Res脂質體-2的組中的脂質體加入量均相同。在加藥24h,48h,72h后用MTS試劑盒檢測OD值。

細胞實驗2:根據與細胞實驗1相同的方法進行檢測,不同的是,接種MCF-7紫杉醇抗性細胞。

細胞實驗2的結果如圖2a-2b、3a-3b和4a-4b所示。

圖2a和圖2b為處理24小時后的結果,其中,縱軸表示測得的OD值,其反映出存活細胞的數量,各組柱狀圖反映出生理鹽水組、脂質體組、紫杉醇脂質體組,以及PTX+Res脂質體-1至PTX+Res脂質體-4中的一組的測試結果(橫軸表示白藜蘆醇在培養基中的終濃度,從左至右依次為PTX+Res脂質體-1至PTX+Res脂質體-4的測試結果)。圖2a為對MCF-7敏感細胞的檢測結果,圖2b為對紫杉醇耐藥性乳腺癌細胞(MCF-7抗性細胞)的檢測結果。圖2a中,加入不同濃度的白藜蘆醇的PTX+Res脂質體-1至PTX+Res脂質體-4對乳腺癌細胞的抑制活性與單獨使用紫杉醇的抑制活性接近,甚至在加入低濃度的白藜蘆醇時,PTX+Res脂質體-1至PTX+Res脂質體-4的抑制活性還差于單獨使用紫杉醇的效果。但是從圖2b中可以看出,紫杉醇脂質體對于紫杉醇耐藥性腫瘤細胞幾乎不再具有抑制活性,而根據本發明的載藥脂質體PTX+Res脂質體-1至PTX+Res脂質體-4均具有明顯的癌細胞抑制活性。并且,隨著白藜蘆醇濃度的增加,其抑制活性越來越顯著。

圖3a和圖3b為處理48小時后的結果,其中,圖3a為對MCF-7敏感細胞的檢測結果,圖3b為對MCF-7抗性細胞的檢測結果。圖3a和圖3b與圖2a和圖2b的結果類似,加入不同濃度的白藜蘆醇的PTX+Res脂質體-1至PTX+Res脂質體-4對乳腺癌細胞的抑制活性與單獨使用紫杉醇的抑制活性接近,但是,紫杉醇脂質體對于紫杉醇耐藥性腫瘤細胞幾乎不再具有抑制活性,而根據本發明的PTX+Res脂質體-1至PTX+Res脂質體-4均具有明顯的癌細胞抑制活性。

圖4a和圖4b為處理72小時后的結果,其中,圖4a為對MCF-7敏感細胞的檢測結果,圖4b為對MCF-7抗性細胞的檢測結果。圖4a和圖4b與上述兩組圖的結果也類似,相比于圖3a和圖3b,圖4a和圖4b中的存活細胞的數目進一步下降。

由上述結果可以看出,本發明的載藥脂質體特別適合于抑制紫杉醇抗性腫瘤細胞的發展和繁殖,并且具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性,在處理72小時后,仍有明顯的抗腫瘤活性,說明本發明的載藥脂質體的抗腫瘤活性持久。

測試例3

本測試例用于在動物水平上檢測本發明的載藥脂質體對紫杉醇耐藥的乳腺癌的抑制活性。

動物實驗:通過皮下注射將MCF-7抗性細胞接種至16g?Balb/c的裸鼠中,107個細胞/只,當腫瘤長至3mm時打藥,共5組,分別是:

(1)生理鹽水組,

(2)脂質體組(注射對比例3制得的脂質體),

(3)紫杉醇脂質體組(注射對比例1制得的PTX脂質體,注射量為8mg/kg體重),

(4)白藜蘆醇脂質體組(注射對比例2制得的Res脂質體,注射量為20mg/kg體重),

(5)同時包裹紫杉醇和白藜蘆醇的脂質體組(注射實施例2制得的PTX+Res脂質體),每天腹腔注射,紫杉醇注射量為8mg/kg體重,白藜蘆醇注射量為20mg/kg體重。

其中,(2)組中的脂質體注射量與(5)組相同。注射2周后取出腫瘤照相,結果如圖5所示(每組三個平行實驗)。

由圖5可以看出,與生理鹽水組相比,單獨使用紫杉醇脂質體和單獨使用白藜蘆醇脂質體已經無法對紫杉醇耐藥的乳腺癌細胞產生抑制作用,但是,使用本發明的PTX+Res脂質體-2,即組合使用白藜蘆醇和紫杉醇的載藥脂質體對紫杉醇耐藥的乳腺腫瘤產生明顯的抑制。

動物實驗結果進一步證明了本發明的載藥脂質體對耐藥性腫瘤具有強的抑制活性。

此外,本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合,只要其不違背本發明的思想,其同樣應當視為本發明所公開的內容。

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本文標題:一種克服腫瘤耐藥性的載藥脂質體及其制備方法和應用.pdf
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