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納米粒子藥物組合物的制備方法和納米粒子藥物組合物.pdf

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納米 粒子 藥物 組合 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201110402420.9

申請日:

20111206

公開號:

CN103142482A

公開日:

20130612

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/14,A61K47/34,A61K31/136,A61K31/337,A61K31/704,A61K31/713,A61K47/36,A61P35/00 主分類號: A61K9/14,A61K47/34,A61K31/136,A61K31/337,A61K31/704,A61K31/713,A61K47/36,A61P35/00
申請人: 國家納米科學中心
發明人: 聶廣軍,王海,吳雁
地址: 100190 北京市海淀區中關村北一條11號
優先權: CN201110402420A
專利代理機構: 北京潤平知識產權代理有限公司 代理人: 王浩然;周建秋
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110402420.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種納米粒子藥物組合物的制備方法,該方法包括:(1)使第一溶液與親水性小分子藥物的水溶液混合乳化得到第一乳液;所述第一溶液含有所述兩親性聚合物和第一有機溶劑;(2)將所述第一乳液與第一表面活性劑水溶液混合,并將所得混合后的物料與第二溶液和陽離子聚合物的水溶液混合并乳化,得到第二乳液;所述第二溶液含有所述疏水性藥物和第二有機溶劑;(3)將所述第二乳液與第二表面活性劑水溶液混合,離心分離得到沉淀物;(4)將所述沉淀物用水溶解后與核酸藥物混合,分離得到納米粒子組合物。本發明還提供了由上述方法制備得到的納米粒子藥物組合物。

權利要求書

1.一種納米粒子藥物組合物的制備方法,所述納米粒子藥物組合物含有兩親性聚合物、陽離子聚合物、疏水性藥物、親水性小分子藥物和核酸藥物,該方法包括以下步驟:(1)在超聲波輻射條件下,使第一溶液與親水性小分子藥物的水溶液混合并乳化,得到第一乳液;所述第一溶液含有所述兩親性聚合物和第一有機溶劑;所述第一有機溶劑為能夠溶解所述兩親性聚合物,但不溶于水的有機溶劑;(2)將所述第一乳液與第一表面活性劑水溶液混合,并將所得混合后的物料與第二溶液和陽離子聚合物的水溶液混合并乳化,得到第二乳液;所述第二溶液含有所述疏水性藥物和第二有機溶劑;所述第二有機溶劑為能夠溶解所述疏水性藥物,但不溶于水的有機溶劑;(3)將所述第二乳液與第二表面活性劑水溶液混合,并除去所述第一有機溶劑和所述第二有機溶劑,而后離心并分離得到沉淀物;(4)將所述沉淀物用水溶液溶解后與核酸藥物混合,離心分離得到納米粒子藥物組合物。2.根據權利要求1所述的方法,其中,步驟(1)中,所述第一溶液與所述親水性小分子藥物的水溶液的體積比為1∶1-1∶10;所述第一溶液中,相對于每毫升的第一有機溶劑,所述兩親性聚合物的含量為5-100毫克;所述親水性小分子藥物的水溶液中,相對于每毫升的水,所述親水性小分子藥物的含量為1-100毫克。3.根據權利要求1或2所述的方法,其中,步驟(1)中,所述兩親性聚合物為聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸、聚環氧乙烷-聚環氧丙烷和聚乙二醇與聚L-乳酸中的一種或多種;所述親水性小分子藥物為阿霉素、米托蒽醌、柔紅霉素和表柔比星中的一種或多種;所述第一有機溶劑為二氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃、丙酮、甲基丁酮、二氯苯和甲基異丙酮中的一種或多種。4.根據權利要求1所述的方法,其中,步驟(1)中,所述乳化的條件包括:超聲波輻射的頻率為20-25kHz,相對于每毫升接受超聲波輻射的物料,功率為10-190W;乳化的溫度為1-99℃,乳化的時間為1-30分鐘。5.根據權利要求1所述的方法,其中,步驟(2)中,相對于1體積的第一乳液,所述第一表面活性劑水溶液的用量為0.5-2體積,所述第二溶液的用量為0.1-1體積,所述陽離子聚合物的水溶液的用量為0.1-1體積;所述第一表面活性劑水溶液中,所述第一表面活性劑的含量為0.6-6重量%;所述第二溶液中,相對于每毫升的第二有機溶劑,所述疏水性藥物的含量為0.1毫克至所述疏水性藥物在所述第二有機溶劑中達到飽和濃度的含量;所述陽離子聚合物的水溶液中,相對于每毫升的水,所述陽離子聚合物的含量為1毫克至所述陽離子聚合物在所水溶液中達到飽和濃度的含量。6.根據權利要求1或5所述的方法,其中,步驟(2)中,所述第一表面活性劑為聚乙烯醇、土溫80、司盤和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種;所述疏水性藥物為紫杉醇、喜樹堿、三尖杉酯堿和長春瑞賓中的一種或多種;所述陽離子聚合物為多聚賴氨酸、殼聚糖、聚醚酰亞胺和聚酰胺-胺型樹枝狀高分子中一種或多種。7.根據權利要求1或5所述的方法,其中,步驟(2)中,所述乳化的條件包括:超聲波輻射的頻率為20-25kHz,相對于每毫升接受超聲波輻射的物料,功率為10-190W;乳化的溫度為1-99℃,乳化的時間為1-30分鐘。8.根據權利要求1所述的方法,其中,步驟(3)中,相對于1體積的所述第二乳液,所述第二表面活性劑水溶液的用量為2-20體積;所述第二表面活性劑水溶液中,所述第二表面活性劑的含量為0.3-3重量%;所述第二表面活性劑為聚乙烯醇、土溫80、司盤和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種。9.根據權利要求1所述的方法,其中,步驟(4)中,相對于1重量份的所述沉淀物,水的用量為1-1000重量份,所述核酸藥物的用量為0.001-1重量份。10.一種納米粒子藥物組合物,該納米粒子藥物組合物由權利要求1-9中任意一項所述的方法制備得到,其中,所述疏水性藥物為紫杉醇,所述親水性小分子藥物為阿霉素,所述核酸藥物為siRNA,所述兩親性聚合物為聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物,所述陽離子聚合物為ε-多聚賴氨酸,所述納米粒子藥物組合物中,所述疏水性藥物和所述親水性小分子藥物的重量比為1∶10000-10000∶1。

說明書

技術領域

本發明涉及納米粒子藥物領域,具體地,涉及一種納米粒子藥物組合物的制備方法和由該方法制備的納米粒子藥物組合物。

背景技術

納米載藥體系是指藥物與納米載體形成的粒徑介于1-1000nm的藥物輸送系統,包括納米球、納米囊、納米粒子和納米脂質體等。納米載藥體系與其它藥物載體相比,具有顯著優勢:(1)超微小體積,可通過人體最小的毛細血管,不易被吞噬細胞迅速清除,延長了在循環系統中的存留時間;(2)到達網狀內皮系統分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等靶部位;(3)能穿透組織間隙并被細胞吸收,有利于透皮吸收和細胞內藥效發揮;(4)藥物可包埋或鍵合在納米粒子內部,也可吸附或偶合在其表面;(5)利用納米材料本身的生物可降解性,pH或溫度敏感性等,達到藥物控制釋放的效果;(6)提高藥物的生物利用度和降低毒副作用等。

納米粒子是納米載藥體系中常用的一種選擇,通常用作為藥物載體的聚合物負載藥物,來得到納米粒子藥物組合物。但是,目前公開的納米粒子藥物組合物的制備方法得到的納米粒子藥物組合物多為只負載一種藥物化合物的納米粒子藥物組合物。如對于親水性小分子藥物化合物,通過親水性乳化的方式將藥物化合物負載在聚合物上,具體方法為:將兩親性聚合物溶解于有機溶劑中,并與親水性小分子藥物化合物的水溶液混合后在超聲波條件下進行第一次乳化,第一次乳化后的物料加入表面活性劑進行第二次乳化,將第二次得到的乳液分散于表面活性劑水溶液中并旋轉蒸發除去有機溶劑,離心分離后得到負載親水性小分子藥物化合物的納米粒子組合物。如對于疏水性藥物化合物,通過疏水性乳化的方式將藥物化合物負載在兩親性聚合物上,具體方法為:將溶解有藥物和兩親性聚合物的有機溶液緩慢滴入含有表面活性劑水溶液中,攪拌一定時間后超聲波乳化得到乳液,將得到的乳液旋轉蒸發除去有機溶劑,離心分離后得到負載疏水性藥物化合物的納米粒子組合物。當負載多種藥物化合物時,如果分別通過親水性乳化的方式或疏水性乳化的方式將多種藥物化合物負載在聚合物上,得到的納米粒子藥物組合物中,各藥物化合物之間的含量比例難以控制,限制了納米粒子藥物組合物的使用效果的提高。

因此,現有的納米粒子藥物組合物存在各藥物化合物之間的含量比例難以控制的缺陷。

發明內容

為了克服現有的納米粒子藥物組合物存在各藥物化合物之間的含量比例難以控制的缺陷,本發明提供了一種制備能夠按需求控制各藥物化合物之間的含量比例的納米粒子藥物組合物的制備方法以及該方法制備的納米粒子藥物組合物。

本發明的發明人發現,不同的藥物化合物由于親水性和/或疏水性不同,在分別通過親水性乳化的方式或疏水性乳化的方式將多種藥物化合物負載在兩親性聚合物上時,得到的納米粒子藥物組合物中,各藥物化合物之間的含量比例只能為較窄范圍,而無法根據用藥需求進行調整;但是,如果通過具有兩次乳化步驟的復乳法將親水性和/或疏水性不同的藥物化合物負載到所述兩親性聚合物上,就能夠很容易地根據用藥需求進行調整得到的納米粒子藥物組合物中各藥物化合物之間的含量比例,并且由于陽離子聚合物的摻入,能夠實現核酸藥物的負載,由此得到本發明。

本發明提供了一種納米粒子藥物組合物的制備方法,所述納米粒子藥物組合物含有兩親性聚合物、陽離子聚合物、疏水性藥物、親水性小分子藥物和核酸藥物,該方法包括以下步驟:

(1)在超聲波輻射條件下,使第一溶液與親水性小分子藥物的水溶液混合并乳化,得到第一乳液;

所述第一溶液含有所述兩親性聚合物和第一有機溶劑;所述第一有機溶劑為能夠溶解所述兩親性聚合物,但不溶于水,且在乳化條件下不與所述兩親性聚合物、所述疏水性藥物、所述親水性小分子藥物和所述核酸藥物發生化學反應的有機溶劑;

(2)將所述第一乳液與第一表面活性劑水溶液混合,并將所得混合后的物料與第二溶液和陽離子聚合物的水溶液混合并乳化,得到第二乳液;

所述第二溶液含有所述疏水性藥物和第二有機溶劑;所述第二有機溶劑為能夠溶解所述疏水性藥物,但不溶于水,且在乳化條件下不與所述兩親性聚合物、所述疏水性藥物、所述親水性小分子藥物和所述核酸藥物發生化學反應的有機溶劑;

(3)將所述第二乳液與第二表面活性劑水溶液混合,并除去所述第一有機溶劑和所述第二有機溶劑,而后離心并分離得到沉淀物。

(4)將所述沉淀物用水溶液溶解后與核酸藥物混合,分離得到納米粒子藥物組合物。

本發明提供的方法,可以能夠很容易地根據用藥需求進行調整使得本發明提供的納米粒子組合物中,親水性和/或疏水性不同的藥物化合物之間以及與核酸藥物的含量比例。通過上述調整,可以高效地利用納米載藥體系在給藥方式上的特有優勢,達到最佳的藥物配伍使用效果,尤其是能夠使得在受藥靶位點的局部區域中,例如腫瘤發生位點中,親水性小分子藥物、疏水性藥物和核酸藥物化合物達到最佳的藥物配伍使用效果。

本發明還提供了一種納米粒子藥物組合物,該納米粒子藥物組合物由上述方法制備得到,其中,所述疏水性藥物為紫杉醇,所述親水性小分子藥物為阿霉素,所述核酸藥物為siRNA,所述兩親性聚合物為聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物,所述陽離子聚合物為ε-多聚賴氨酸,所述納米粒子藥物組合物中,所述疏水性藥物和所述親水性小分子藥物的重量比為1∶10000-10000∶1。

實驗證明,本發明提供的上述納米粒子藥物組合物,與將只負載紫杉醇的納米粒子藥物組合物和只負載阿霉素的納米粒子藥物組合物按紫杉醇與阿霉素的重量比為1∶0.9-1.1混合后得到的藥物組合物相比,對于黑色素瘤、肺癌和肝癌等腫瘤具有更好的治療效果。

本發明的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

圖1為在透射電鏡下觀察實施例1得到的納米粒子藥物組合物的圖像。

圖2為激光粒度儀測得實施例1得到的納米粒子藥物組合物的粒徑圖。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是,此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明,并不用于限制本發明。

本發明提供了一種納米粒子藥物組合物的制備方法,所述納米粒子藥物組合物含有兩親性聚合物、陽離子聚合物、疏水性藥物、親水性小分子藥物和核酸藥物,該方法包括以下步驟:

(1)在超聲波輻射條件下,使第一溶液與親水性小分子藥物的水溶液混合并乳化,得到第一乳液;

所述第一溶液含有所述兩親性聚合物和第一有機溶劑;所述第一有機溶劑為能夠溶解所述兩親性聚合物,但不溶于水,且在乳化條件下不與所述兩親性聚合物、所述疏水性藥物、所述親水性小分子藥物和所述核酸藥物發生化學反應的有機溶劑;

(2)將所述第一乳液與第一表面活性劑水溶液混合,并將所得混合后的物料與第二溶液和陽離子聚合物的水溶液混合并乳化,得到第二乳液;

所述第二溶液含有所述疏水性藥物和第二有機溶劑;所述第二有機溶劑為能夠溶解所述疏水性藥物,但不溶于水,且在乳化條件下不與所述兩親性聚合物、所述疏水性藥物、所述親水性小分子藥物和所述核酸藥物發生化學反應的有機溶劑;

(3)將所述第二乳液與第二表面活性劑水溶液混合,并除去所述第一有機溶劑和所述第二有機溶劑,而后離心并分離得到沉淀物。

(4)將所述沉淀物用水溶液溶解后與核酸藥物混合,分離得到納米粒子藥物組合物。

其中,步驟(1)中,所述第一溶液與所述親水性小分子藥物的水溶液的體積比沒有特別的要求,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,所述第一溶液與所述親水性小分子藥物的水溶液的體積比為1∶1-1∶10;進一步優選為1∶2-1∶6,最優選為1∶4。

根據本發明,所述第一溶液中,相對于每毫升的第一有機溶劑,所述兩親性聚合物的含量沒有特別的要求,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,所述第一溶液中,相對于每毫升的第一有機溶劑,所述兩親性聚合物的含量為5-100毫克;進一步優選為20-40毫克。

根據本發明,所述親水性小分子藥物的水溶液中,相對于每毫升的水,所述親水性小分子藥物的含量沒有特別的要求,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,所述親水性小分子藥物的水溶液中,相對于每毫升的水,所述親水性小分子藥物的含量為1-100毫克;進一步優選為10-50毫克。

根據本發明,步驟(1)中,所述兩親性聚合物的選擇沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,例如,所述兩親性聚合物為同時含有親水性基團和疏水性基團的聚合物;所述親水性基團可以為聚乙二醇基團、聚氧乙烯基團和聚異丁烯酸基團等中的一種或多種,所述疏水性基團可以為聚氧乙烯基團、聚乳酸-乙醇酸基團、聚苯乙烯基團和聚己內酯基團中等的一種或多種。需要說明的是,所述兩親性聚合物的重復單元的排列方式沒有特別地要求,只要是能用于形成納米粒子藥物組合物即可,例如可以為交替、嵌段、無規或接枝中的一種或多種,也可以由含有親水性基團和疏水性基團的單體均聚得到;所述兩親性聚合物的分子量沒有特別的要求,只要是能用于形成納米粒子藥物組合物即可,例如所述兩親性聚合物按照SHT?1759-2007規定的方法測得的重均分子量可以為104-105。

根據本發明,為了使所述納米粒子藥物組合物還能具有更加特異的靶向性能和/或成像性能,優選情況下,步驟(1)中,所述兩親性聚合物還含有靶向基團和/或成像基團。

其中,所述靶向基團和/或成像基團的選擇沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,進一步優選情況下,所述靶向基團為葉酸基團、精-甘-天冬氨酸基序環肽(RGD)基團和轉鐵蛋白基團等中的一種或多種;所述成像基團為量子點基團和/或熒光染料基團。例如,所述量子點基團可以為金量子點基團、鎘量子點基團和鈀量子點基團等納米材料中的一種或多種;所述熒光染料基團可以為異硫氰酸熒光素基團、四溴熒光素二鈉基團和酸性紅87基團中的一種或多種。

其中,所述靶向基團和/或成像基團的含量沒有特別地要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,例如,相對于每摩爾的親水性基團,所述靶向基團和/或成像基團的含量可以為0.2-1摩爾。

根據本發明的一種優選實施方式,步驟(1)中,所述兩親性聚合物為聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸、聚環氧乙烷-聚環氧丙烷、聚乙二醇和聚L-乳酸中的一種或多種。

其中,所述聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸的親水基團為聚乙二醇單甲醚基團,疏水基團為聚乳酸-乙醇酸基團,所述聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物的重復單元的排列方式為嵌段,其中,乙二醇單元和乳酸-乙醇酸單元之間的摩爾比可以為1∶1-1∶8,所述聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物按照SHT?1759-2007規定的方法測得的重均分子量可以為104-105。符合上述要求的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物可以通過商購獲得。

根據本發明,所述親水性小分子藥物的選擇沒有特殊的要求,可以根據所期望的藥效和藥物在水中的溶解度進行選擇,所述親水性小分子藥物的分子量可以為1000Da以下,例如,可以選擇在水中的溶解度大于1g/100g的藥物作為親水性小分子藥物,優選情況下,所述親水性小分子藥物為阿霉素、米托蒽醌、柔紅霉素和表柔比星中的一種或多種。

根據本發明,所述第一有機溶劑的選擇沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果并降低成本,優選情況下,所述第一有機溶劑為二氯甲烷、二甲基亞砜、四氫呋喃、丙酮、甲基丁酮、二氯苯和甲基異丙酮中的一種或多種。

根據本發明,步驟(1)中,所述乳化的條件沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(1)中,所述乳化的條件包括:超聲波輻射的頻率為20-25kHz,進一步優選為22-23kHz;相對于每毫升接受超聲波輻射的物料,功率為19-190W,進一步優選為28.5-57W;乳化的溫度為1-99℃,進一步優選為20-30℃;乳化的時間為1-30分鐘,進一步優選為3-10分鐘。

其中,步驟(1)中,所述混合的方式沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(1)中,所述混合的方式包括:將所述親水性小分子藥物的水溶液加入到第一溶液中混合。

根據本發明,步驟(2)中,所述第一表面活性劑水溶液的用量、所述第二溶液和陽離子聚合物的水溶液的用量沒有特別的要求,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(2)中,相對于1體積的第一乳液,所述第一表面活性劑水溶液的用量為0.5-2體積,進一步優選為0.8-1體積;所述第二溶液的用量為0.1-1體積,進一步優選為0.4-0.6體積;所述陽離子聚合物的水溶液的用量為0.1-1體積,進一步優選為0.4-0.6體積。

其中,步驟(2)中,所述第一表面活性劑水溶液中,相對于每毫升的水,所述第一表面活性劑的含量沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(2)中,所述第一表面活性劑水溶液中,所述第一表面活性劑的含量為0.6-6重量%,進一步優選為2-4重量%。

其中,步驟(2)中,所述第二溶液中,相對于每毫升的第二有機溶劑,所述疏水性藥物的含量沒有特別的要求,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(2)中,所述第二溶液中,相對于每毫升的第二有機溶劑,所述疏水性藥物的含量可為0.1毫克至所述疏水性藥物在所述第二有機溶劑中達到飽和濃度的含量,進一步優選為1-10毫克。

其中,步驟(2)中,所述陽離子聚合物的水溶液中,所述陽離子聚合物的含量沒有特別的要求,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(2)中,所述第四溶液中,所述陽離子聚合物的含量可為1毫克至所述陽離子聚合物在所水溶液中達到飽和濃度的含量,進一步優選為20-40毫克。

根據本發明,步驟(2)中,所述第一表面活性劑的作用是提高第二乳液的穩定性,從而可以提高納米粒子藥物組合物的穩定性,其選擇沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(2)中,所述第一表面活性劑為聚乙烯醇、土溫80、司盤和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種。

其中,所述聚乙烯醇的選擇沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,例如,所述聚乙烯醇可以為醫藥級聚乙烯醇;所述聚乙烯醇的皂化度可以為70-95mol%;所述聚乙烯醇在25℃下的粘度可以為500-900mPa·s。符合上述要求的聚乙烯醇可以通過商購獲得,例如可以購買自國藥集團化學試劑有限公司的牌號為PVA-124的產品。

其中,所述疏水性藥物的選擇沒有特殊的要求,可以根據所期望的藥效和藥物在水中的溶解度進行選擇,例如,可以選擇在水中的溶解度小于1g/100g的藥物作為疏水性藥物,優選情況下,所述疏水性藥物為紫杉醇、喜樹堿、三尖杉酯堿和長春瑞賓中的一種或多種。

其中,所述陽離子聚合物的選擇沒有特殊的要求,可以根據所期望的納米粒子表面電勢進行選擇,例如,可以選擇在水中的為正電勢的陽離子聚合物,優選情況下,所述陽離子聚合物為多聚賴氨酸、殼聚糖和聚醚酰亞胺-胺型樹枝狀高分子中的一種或多種。所述多聚賴氨酸優選為ε-多聚賴氨酸。

其中,步驟(2)中,所述乳化的條件沒有特殊的要求,可以根據所期望的藥效和藥物在水中的溶解度進行選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(2)中,所述乳化的條件包括:超聲波輻射的頻率為20-25kHz,進一步優選為22-23kHz;相對于每毫升接受超聲波輻射的物料,功率為19-190W,進一步優選為28.5-57W;乳化的溫度為1-99℃,進一步優選為20-30℃;乳化的時間為1-30分鐘,進一步優選為3-10分鐘。

其中,步驟(2)中,將所述第一乳液與所述第一表面活性劑水溶液混合的過程中,所述混合的方式沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(2)中,將所述第一乳液與所述第一表面活性劑水溶液混合的過程中,所述混合的方式包括:在100-1200轉/min的攪拌條件下,將所述第一乳液加入到所述第一表面活性劑水溶液中混合,且所述第一乳液加入的速度為0.1-3ml/min。

其中,步驟(2)中,將如上混合所得混合后的物料與所述第二溶液和所述陽離子聚合物的水溶液混合并乳化的過程中,所述混合的方式沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(2)中,將所得混合后的物料與所述第二溶液和所述陽離子聚合物的水溶液混合并乳化的過程中,所述混合的方式包括:在1000-1200轉/min的攪拌條件下,將所述第二溶液和所述陽離子聚合物的水溶液加入到如上混合所得混合后的物料中,且所述第二溶液加入的速度為0.1-1ml/min。

根據本發明,步驟(3)中,相對于1體積的所述第二乳液,所述第二表面活性劑水溶液的用量沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(3)中,相對于1體積的所述第二乳液,所述第二表面活性劑水溶液的用量為2-20體積,進一步優選為10-15體積。

其中,步驟(3)中,所述第二表面活性劑水溶液中,相對于每毫升的水,所述第二表面活性劑的含量沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(3)中,所述第二表面活性劑水溶液中,所述第二表面活性劑的含量為0.3-3重量%,進一步優選為0.6-1重量%。

其中,步驟(3)中,所述第二表面活性劑的作用是提高所述沉淀物的穩定性,從而可以提高納米粒子藥物組合物的穩定性,其選擇沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,步驟(3)中,所述第二表面活性劑為聚乙烯醇、土溫80、司盤和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種。

其中,所述聚乙烯醇的選擇沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,例如,所述聚乙烯醇可以為醫藥級聚乙烯醇;所述聚乙烯醇的皂化度可以為70-95mol%;所述聚乙烯醇在25℃下的粘度可以為500-900mPa·s。符合上述要求的聚乙烯醇可以通過商購獲得,例如可以購買自國藥集團化學試劑有限公司的牌號為PVA-124的產品。

其中,在步驟(3)中,將所述第二乳液與第二表面活性劑水溶液混合的過程中,所述混合的方式沒有特別的要求,可以為納米粒子藥物組合物制備領域常規的選擇,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,在步驟(3)中,將所述第二乳液與第二表面活性劑水溶液混合的過程中,所述混合的方式包括:在100-1200轉/min的攪拌條件下,將所述第二乳液加入到所述第二表面活性劑水溶液中,且所述第二乳液加入的速度為0.1-3ml/min;加入所述第二乳液后,可在100-1200轉/min的攪拌條件下維持5-100min。

其中,在步驟(3)中,除去所述第一有機溶劑和第二有機溶劑的過程中,所述除去所述第一有機溶劑和第二有機溶劑的方法沒有特別的要求,例如,可以通過旋轉蒸發的方式除去所述第一有機溶劑和第二有機溶劑。

其中,在步驟(3)中,離心并分離得到沉淀物的過程中離心的速度可以為5000-15000g。

根據本發明,其中,步驟(4)中,相對于1重量份的所述沉淀物,水的用量可以為1-1000重量份,優選為10-100重量份。

其中,步驟(4)中,相對于1重量份的所述沉淀物,所述核酸藥物的用量可以為0.001-1重量份,優選為0.1-0.2重量份。

其中,所述核酸藥物包括各種以核酸為有效成分的藥物,例如DNA藥物和RNA藥物,優選為siRNA藥物。

其中,在步驟(4)中,將所述沉淀物用水溶液溶解的過程和隨后與核酸藥物混合的過程中,溶解的方式和混合的方式沒有特別的要求,為了進一步提高所述納米粒子藥物組合物的使用效果,優選情況下,在步驟(4)中,將將所述沉淀物用水溶液溶解后與核酸藥物混合的方式包括:在100-1200轉/min的攪拌條件下,將所述沉淀物和所述核酸藥物加入到水中,然后,可在100-1200轉/min的攪拌條件下維持5-100min。

其中,步驟(4)中,分離得到所述納米粒子藥物組合物的過程中,所述分離的方法沒有特別的要求,例如,可以通過離心并收集沉淀的方法(所得到的沉淀為所述納米粒子藥物組合物)進行分離,離心的速度可以為5000-15000g。

本發明還提供了一種納米粒子藥物組合物,該納米粒子藥物組合物由上述方法制備得到,其中,所述疏水性藥物為紫杉醇,所述親水性小分子藥物為阿霉素,所述核酸藥物為siRNA,所述兩親性聚合物為聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物,所述陽離子聚合物為ε-多聚賴氨酸,所述納米粒子藥物組合物中,所述疏水性藥物和所述親水性小分子藥物的重量比為1∶10000-10000∶1。

其中,優選情況下,所述疏水性藥物和所述親水性小分子藥物的重量比為1∶1000-1000∶1。

其中,所述核酸藥物可以按所需比例與納米粒子混合相對于1重量份的所述沉淀物,所述核酸藥物的用量可以為0.001-1重量份,優選為0.01-0.2重量份。

實驗證明,所述納米粒子藥物組合物用于小鼠時,以阿霉素的量計算,經靜脈給藥的有效量為0.1-10mg/kg體重。

本發明中,氣體和液體的體積均為20℃下,一個標準大氣壓下的數值。

以下,通過實施例進一步詳細說明本發明,但本發明的范圍并不限于以下實施例中。

實施例1

本實施例按照以下步驟制備納米粒子藥物組合物。

(1)將20mg的兩親性聚合物(聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸,PLGA-PEG,購自濟南岱罡生物科技有限公司,該聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物的親水基團為聚乙二醇單甲醚基團,疏水基團為聚乳酸-乙醇酸基團,所述聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物的重復單元的排列方式為嵌段,其中,乙二醇單元和乳酸-乙醇酸單元之間的摩爾比為1∶1-1∶8,按照SHT?1759-2007規定的方法測得的重均分子量為104-1.5×105)溶于1ml第一有機溶劑(二氯甲烷)中,得到第一溶液。將0.6mg的親水性小分子藥物(阿霉素,購自北京華豐科技有限公司,牌號為HF090516)溶于1ml水中,得到親水性小分子藥物的水溶液。將250μl的親水性小分子藥物的水溶液加入1ml的第一溶液中,得到混合后的物料。在25℃下,將1ml的上述得到的混合后的物料用功率為28.5W且頻率為23kHz的超聲波輻射3分鐘后,得到第一乳液。

(2)將第一表面活性劑(聚乙烯醇,購自國藥集團化學試劑有限公司,牌號為PVA-124,皂化度為85mol%;在25℃下的粘度為700mPa·s)配制為濃度2重量%的水溶液,得到第一表面活性劑水溶液。在1000轉/min的攪拌條件下,將1ml步驟(1)得到的第一乳液以1ml/min的速度加入到1ml第一表面活性劑水溶液中,得到混合后的物料。將0.125mg疏水性藥物(紫杉醇,購自北京諾瑞醫藥技術有限公司,牌號為090328)溶于1ml第二有機溶劑(二氯甲烷)中,得到第二溶液。將20mg的陽離子聚合物(ε-多聚賴氨酸,購自浙江銀象生物工程有限公司)溶解在0.1ml水溶液中,得到陽離子聚合物的水溶液。在1000轉/min的攪拌條件下,將0.25ml的上述得到的第二溶液和0.1ml的上述得到的陽離子聚合物的水溶液分別以1ml/min的速度加入上述得到的混合后的物料中,得到用于超聲的物料。在25℃下,將1ml上述得到的用于超聲的物料用功率為57W且頻率為23kHz的超聲波輻射5分鐘后,得到第二乳液。

(3)將第二表面活性劑(聚乙烯醇,購自國藥集團化學試劑有限公司,牌號為PVA-124,皂化度為85mol%;在25℃下的粘度為700mPa·s)配制為濃度0.6%的水溶液,得到第二表面活性劑水溶液。在800轉/min的攪拌條件下,將1ml步驟(2)得到的第二乳液以2ml/min的速度加入到10ml的上述第二表面活性劑水溶液中,然后在600-800轉/min的攪拌條件下維持10min。在室溫℃下,旋轉蒸發除去第一有機溶劑(二氯甲烷)和第二有機溶劑(二氯甲烷),得到旋蒸后的產物。將旋蒸后的產物在13000g的離心速度下離心10分鐘后,收集得到沉淀物。

(4)將得到的沉淀物(10mg左右)用2ml的水溶解后,加入0.05mg的核酸藥物(siRNA,正義鏈序列為5’-GAAUUAACCCUUGGUGAAUTT-3’(SEQ?ID?NO:1),反義鏈序列為5’-AUUCACCAAGGGUUAAUUCTT-3’(SEQ?ID?NO:2),購自英濰捷基(上海)貿易有限公司,該siRNA能夠沉默抗凋亡蛋白survivin基因的表達,從而抑制腫瘤細胞的生長),振蕩混勻后室溫放置30分鐘,13000g的離心速度下離心10分鐘后,收集沉淀,得到納米粒子藥物組合物。

按照文獻(Ashlynn?L.Z.Lee,等.生物材料(Biomaterials)2009,30,919-927)中所述的方法,在透射電鏡下觀察本實施例得到的納米粒子藥物組合物,結果如圖1所示,說明得到的納米粒子藥物組合物的粒徑大小約為200nm。

按照文獻(Ashlynn?L.Z.Lee,等.生物材料(Biomaterials)2009,30,919-927)中所述的方法,利用激光粒度儀測得本實施例得到的納米粒子藥物組合物的平均粒徑為200.63±12.36nm(圖2),分散度為0.131,zeta電位為29.6±0.14,表明該納米粒子藥物組合物的穩定性較好。

按照文獻(Ashlynn?L.Z.Lee,等.生物材料(Biomaterials)2009,30,919-927)中所述的方法,將本實施例得到的納米粒子藥物組合物冷凍干燥后用乙腈溶解,利用高效液相色譜檢測(標準品購自Agilent?Technologies,牌號Agilent?1200?series),可以看出本實施例得到的納米粒子藥物組合物同時具有阿霉素和紫杉醇的特征峰。并通過紫外分光光度計方法測得本實施例得到的納米粒子藥物組合物中含有siRNA,說明阿霉素和紫杉醇在本實施例得到的納米粒子藥物組合物中同時存在,且每克的本實施例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0.15mg,紫杉醇的含量為0.075mg,siRNA的含量為0.045mg。

對比例1

本對比例按照實施例1的方法制備納米粒子藥物組合物,所不同的是:將20mg的兩親性聚合物(聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物,PLGA-PEG,購自濟南岱罡生物科技有限公司)溶于1ml水中,得到的溶液作為第一溶液,即用水替換第一有機溶劑(二氯甲烷)。

按照與實施例1相同的測量方法,利用激光粒度儀測得本對比例得到的納米粒子藥物組合物的粒徑為300nm;測得每克的本對比例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0.05g,紫杉醇的含量為0g,siRNA的含量為0g。

對比例2

按照以下步驟制備納米粒子藥物組合物。

(1)將20mg的兩親性聚合物聚乙二醇單甲醚-聚乳酸-乙醇酸共聚物,PLGA-PEG,購自濟南岱罡生物科技有限公司)溶于1ml第一有機溶劑(二氯甲烷)中,得到第一溶液。將0.6mg的親水性小分子藥物(阿霉素,購自北京華豐科技有限公司,牌號為HF090516)溶于1ml水中,得到的溶液作為親水性小分子藥物的水溶液。將第一表面活性劑(聚乙烯醇,購自國藥集團化學試劑有限公司,牌號為PVA-124)配制為濃度2重量%的水溶液,得到第一表面活性劑水溶液。將0.125mg疏水性藥物(紫杉醇,購自北京諾瑞醫藥技術有限公司,牌號為090328)溶于1ml第二有機溶劑(二氯甲烷)中,得到第二溶液。

在1000轉/min的攪拌條件下,將上述得到的第一溶液、上述得到的第二溶液、上述得到的親水性小分子藥物的水溶液、上述得到的第一表面活性劑水溶液混合,得到用于超聲的物料。在25℃下,將1ml上述得到的用于超聲的物料先用28.5W的頻率為23kHz的超聲波輻射3分鐘后,再用57W的頻率為23kHz的超聲波輻射3分鐘,得到第二乳液。

(2)將第二表面活性劑(聚乙烯醇,購自國藥集團化學試劑有限公司,牌號為PVA-124)配制為濃度0.6重量%的水溶液,得到第二表面活性劑水溶液。在1000轉/min的攪拌條件下,將1ml步驟(1)得到的第二乳液以1ml/min的速度加入到10ml的上述第二表面活性劑水溶液中,然后在600-800轉/min的攪拌條件下維持10min。在室溫下,旋轉蒸發10min,除去第一有機溶劑(二氯甲烷)和第二有機溶劑(二氯甲烷),得到旋蒸后的產物。將旋蒸后的產物在13000g的離心速度下離心10分鐘后,收集得到沉淀物。

(4)將得到的沉淀物(10mg左右)用2ml的水溶解后,加入0.05mg的核酸藥物(siRNA,與實施例1中相同),振蕩混勻后室溫放置30分鐘,13000g的離心速度下離心10分鐘后,收集沉淀,得到納米粒子藥物組合物。

按照與實施例1相同的測量方法,利用激光粒度儀測得本對比例得到的納米粒子藥物組合物的粒徑為300nm;測得每克的本對比例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0g,紫杉醇的含量為0.02g,siRNA的含量為0g。

實施例2

本實施例按照實施例1的方法制備納米粒子藥物組合物,所不同的是,所述親水性小分子藥物的水溶液中阿霉素的濃度為0.4mg/ml,所述第二溶液中紫杉醇的濃度為10mg/ml,所述核酸藥物的用量為0.05mg。

按照與實施例1相同的測量方法,利用激光粒度儀測得本實施例得到的納米粒子藥物組合物的粒徑約為200nm;測得每克的本實施例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0.0005g,紫杉醇的含量為0.5g,siRNA的含量為0.000045g。

對比例3

本對比例按照對比例2的方法制備納米粒子藥物組合物,所不同的是,所述親水性小分子藥物的水溶液中阿霉素的濃度為0.4mg/ml,所述第二溶液中紫杉醇的濃度為10mg/ml,所述核酸藥物的用量為0.05mg。

按照與實施例1相同的測量方法,利用激光粒度儀測得本對比例得到的納米粒子藥物組合物的粒徑為300nm;測得每克的本對比例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0g,紫杉醇的含量為0.1g,siRNA的含量為0g。

實施例3

本實施例按照實施例1的方法制備納米粒子藥物組合物,所不同的是,所述親水性小分子藥物的水溶液中阿霉素的濃度為10mg/ml,所述第二溶液中紫杉醇的濃度為0.4mg/ml,所述核酸藥物的用量為0.05mg。

按照與實施例1相同的測量方法,利用激光粒度儀測得本實施例得到的納米粒子藥物組合物的粒徑為260nm;測得每克的本實施例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0.47g,紫杉醇的含量為0.00047g,siRNA的含量為0.000045g。

對比例4

本對比例按照對比例2的方法制備納米粒子藥物組合物,所不同的是,所述親水性小分子藥物的水溶液中阿霉素的濃度為10mg/ml,所述第二溶液中紫杉醇的濃度為0.4mg/ml,所述核酸藥物的用量為0.05mg。

按照與實施例1相同的測量方法,利用激光粒度儀測得本對比例得到的納米粒子藥物組合物的粒徑為300nm;測得每克的本對比例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0g,紫杉醇的含量為0.1g,siRNA的含量為0g。

對比例5

本對比例按照與對比例2相同的方法制備納米粒子藥物組合物,所不同的是,不使用第二溶液,并且親水性小分子藥物的水溶液中阿霉素的使用量為3.5mg,核酸藥物(siRNA,與實施例1中相同)的使用量為0.1mg。

按照與實施例1相同的測量方法,利用激光粒度儀測得本對比例得到的納米粒子藥物組合物的粒徑為300nm;測得每克的本對比例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0.3g,紫杉醇的含量為0g,siRNA的含量為0.09mg。

對比例6

本對比例按照與對比例2相同的方法制備納米粒子藥物組合物,所不同的是,不使用親水性小分子藥物的水溶液,并且第二溶液中紫杉醇的使用量為2mg。

按照與實施例1相同的測量方法,利用激光粒度儀測得本對比例得到的納米粒子藥物組合物的粒徑為300nm;測得每克的本對比例得到的納米粒子藥物組合物中阿霉素的含量為0g,紫杉醇的含量為0.15g。

測試實施例1

本測試實施例中,將實施例1制得載有多種藥物的納米粒子組合物作為實驗藥物;將對比例5得到的納米粒子藥物組合物和對比例6得到的納米粒子藥物等量混合,得到阿霉素的含量為15重量%,紫杉醇的含量為7.5重量%的納米粒子藥物組合物混合物。將該納米粒子藥物組合物混合物作為對照藥物。

將黑色素瘤細胞(B16細胞系,購自ATCC,編號B16-F10)以每35mm內徑的培養皿103個的密度分別接種于含有2ml的DMEM培養基(購自Gibco,牌號sh30022.01B,且含10體積%的胎牛血清)的兩個培養皿中,在37℃和5體積%的CO2濃度下培養24小時后,吸出培養基,將2ml溶有實驗藥物的培養基(以阿霉素計,藥物濃度為0.17μmol/ml)加入其中一只培養皿中,將2ml溶有對照藥物的培養基(以阿霉素計,藥物濃度為0.17μmol/ml)加入另一只培養皿中,將上述2只培養皿在37℃和5%的CO2濃度下孵育24小時后,按照文獻(Qinghua?Miao,等,生物材料(Biomaterials),2010,31(28):7364-75)中所述的CCK-8法檢測不同時間段細胞凋亡水平。可以發現,使用實驗藥物的培養皿中,細胞活性為90.2±1.2(4h),31.88±2%(8h),16.3±3.2%(12h),6.1±0.05%(24h);使用對照藥物的培養皿中,細胞活性為96.2±2.1%(4h),53.63±1.3%(8h),42.5±3.4%(12h),34.43±1.5(24h)。上述結果說明實驗藥物對黑色素瘤細胞具有更強的促凋亡效果。

使用黑色素瘤細胞(B16細胞系,購自ATCC,編號B16-F10)和C57小鼠(C57系,購自北京維通利華公司),按照文獻(Fariyal?Ahmed,等.分子藥物學(Molecular?Pharmaceutics),3,340-350)中的方法制備荷瘤裸鼠,待腫瘤長至0.5cm2大小時,將荷瘤裸鼠隨機分為實驗組荷瘤裸鼠和對照組荷瘤裸鼠,按照文獻(同上)中的方法,經尾靜脈,將溶有實驗藥物的磷酸鹽緩沖液(以阿霉素計,給藥量為3mg/kg體重)給藥至實驗組荷瘤裸鼠;將溶有對照藥物的磷酸鹽緩沖液(以阿霉素計,給藥量為3mg/kg體重)給藥至對照組荷瘤裸鼠。一周后,按照文獻(Fariyal?Ahmed,等.分子藥物學(Molecular?Pharmaceutics),3,340-350)中的方法測定腫瘤的大小,其中,實驗組荷瘤裸鼠的腫瘤大小平均為452mm3,對照組荷瘤裸鼠的腫瘤大小平均為8462mm3。上述結果說明說明實驗藥物對黑色素瘤具有更強的抑制效果。

以上結合附圖詳細描述了本發明的優選實施方式,但是,本發明并不限于上述實施方式中的具體細節,在本發明的技術構思范圍內,可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型,這些簡單變型均屬于本發明的保護范圍。

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