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鐵皮石斛莖段組培快繁方法.pdf

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鐵皮 石斛 莖段組培快繁 方法
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摘要
申請專利號:

CN201210527537.4

申請日:

20121210

公開號:

CN102972299B

公開日:

20140625

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 黃懷毅
發明人: 黃威祥,黃懷毅,農定霖
地址: 533500 廣西壯族自治區百色市西林縣八達鎮新建路11號
優先權: CN201210527537A
專利代理機構: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 代理人: 鄧曉安
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210527537.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種鐵皮石斛莖段組培快繁方法,屬于生物技術領域。該方法以為1年以上生長期的鐵皮石斛離根部三節以上的莖段為外植體材料進行組培快繁,包括以下步驟:莖段外植體的準備、消毒、誘導培養、繼代培養、壯苗培養、生根培養、光培煉苗。本發明具有取材容易、材料量大、不受季節限制優點,能較好的保持母本的生物學性狀,培養技術簡單易行,污染率低,繁殖速度快,對瀕危緊缺藥用植物資源再生和持續利用具有重要意義。

權利要求書

1.一種鐵皮石斛莖段組培快繁方法,其特征在于,包括以下步驟:(1)莖段外植體的準備:取成年態鐵皮石斛莖段,除去葉片,用流水沖洗干凈;所述成年態鐵皮石斛莖段為1年以上生長期的鐵皮石斛離根部三節以上的莖段;(2)莖段外植體的消毒:將清洗干凈的莖段外植體取出,置燒杯中,用0.1%的升汞溶液浸泡5分鐘,用無菌水沖洗4~5次,置超凈工作臺上,切成長度為1~2cm、帶2~3個節的小莖段,再用0.1%的升汞溶液浸泡3分鐘,用無菌水沖洗4~5次,備用;(3)誘導培養:將消毒好的小莖段接種于無菌誘導培養基中,該培養基配方為:MS+6-BA0.8~1.2mg/L+NAA0.8~1.2mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養40天后,莖段在節間處長出新芽;(4)第一次增殖培養:將新芽轉接到第一次增殖培養基中,第一次增殖培養基的配方為:MS+6-BA4.8~5.2mg/L+NAA0.8~1.2mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30天后,在切口處長出第一代叢生芽;(5)第二次增殖培養:將第一代叢生芽切割后轉接到第二次增殖培養基中,第二次增殖培養基的配方為:MS+6-BA3.8~4.2mg/L+NAA0.8~1.2mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30~40天,在切口處長出第二代叢生芽;(6)第三次增殖培養:將第二代叢生芽切割后轉接到第三次增殖培養基中,第三次增殖培養基的配方為:MS+6-BA1.5~2.5mg/L+NAA0.8~1.2mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30~40天,在切口處長出1cm高的第三代叢生芽,并開始有不定根生長;(7)壯苗培養:將第三代叢生芽切割后轉接于壯苗培養基中,該培養基配方為:MS+NAA1.0~1.5mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養30~45天,形成2~3cm高的不定芽;(8)生根培養:將不定芽接種于生根培養基中,該培養基配方為:MS+NAA0.8~1.2mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養60~75天,每株苗形成2~3條根,根長2~4cm,直徑約1mm;(9)光培煉苗:將已生根的苗連同培養瓶轉入大棚,在溫度為25~30℃下,放置7天,去掉瓶塞,煉苗5~7天,即可將種苗取出移栽。

說明書

技術領域

本發明屬于生物技術領域,涉及一種植物栽培方法,具體來說涉及鐵皮石斛莖段組培快繁方法。

背景技術

鐵皮石斛(Dendrobium?officinale?Kimura?et?Migo),屬蘭科附生蘭類,其藥材俗稱鐵皮楓斗,又稱黑節草,是一種傳統名貴中藥,具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、潤喉明目之功效。現代醫學研究表明,鐵皮石斛的多糖、生物堿、氨基酸等成分具有提高免疫功能、抑制血栓形成、抑制腫瘤和延緩衰老的作用。由于鐵皮石斛種子細小,種胚存在后熟現象,果實成熟時,種胚的發育不超過球型期,種子缺乏胚乳,且需要共生菌的存在,因此自然條件下繁殖率極低,加上長年無節制采挖,自然資源日漸枯竭,被列為國家重點保護藥用植物、中國珍稀瀕危二級保護植物和世界二類保護植物。

鐵皮石斛在生產中往往采用分株、扦插等營養繁殖的方法,但繁殖系數低的問題難以解決。自1960年法國人Gmorel利用石斛基尖組織培養無病毒植株的無性繁殖技術創立以來,石斛組織培養技術逐步深化,尤其近年來石斛組織培養育苗逐步趨向產業化。有研究表明由于石斛的特殊性,在石斛的組織培養中,外植體的選擇是十分關鍵的因素,不同的取材部位和時期,培養的結果也不一樣。在目前的研究中,鐵皮石斛離體組培方法,通常是以成熟或未成熟的種子以及幼嫩的莖尖、腋芽或幼莖莖段為外植體。盡管種子作為外植體具有操作簡單、成活率高,數量擴增迅速等優點,但外植體材料獲得的困難,卻又成為極大的限制因素,且用種子繁殖的后代有可能產生變異;以幼嫩的莖尖、腋芽或幼莖莖段為材料,又會對植株的生長產生極為不良的影響,同時也受到季節的限制。本發明以1年以上生長期的鐵皮石斛離根部三節以上的成年態莖段為外植體材料進行組培快繁,同時克服了上述兩種外植體材料的缺陷,不僅材料量大,而且在任何季節均可取材,目前未見有相關報道。

發明內容

本發明的目的是針對鐵皮石斛離體組培外植體材料獲得困難,提供了一種鐵皮石斛莖段組培快繁方法,該方法以1年以上生長期的鐵皮石斛的成年態莖段為外植體材料進行組培快繁,具有材料量大、不受季節限制優點,同時可增加擴繁速度和生產量,降低了組培生產成本,對瀕危緊缺藥用植物資源再生和持續利用具有重要意義。

本發明采用的技術方案是:

一種鐵皮石斛莖段組培快繁方法,包括以下步驟:

1.莖段外植體的準備:取成年態鐵皮石斛莖段,除去葉片,用流水沖洗干凈;所述成年態鐵皮石斛莖段為1年以上生長期的鐵皮石斛離根部三節以上的莖段;

2.莖段外植體的消毒:將清洗干凈的莖段外植體取出,置燒杯中,用0.1%的升汞溶液浸泡5分鐘,用無菌水沖洗4~5次,置超凈工作臺上,切成長度為1~2cm、帶2~3個節的小莖段,再用0.1%的升汞溶液浸泡3分鐘,用無菌水沖洗4~5次,備用;

3.誘導培養:將消毒好的小莖段接種于無菌誘導培養基中,該培養基配方為:MS+6-BA0.8~1.2mg/L+NAA0.8~1.2mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養40天后,莖段在節間處長出新芽;

4.第一次增殖培養:將新芽轉接到第一次增殖培養基中,第一次增殖培養基的配方為:MS+6-BA4.8~5.2mg/L+NAA0.8~1.2mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30天后,在切口處長出約0.5cm高的第一代叢生芽,新芽的增殖倍數為20倍以上;

5.第二次增殖培養:將第一代叢生芽切割后轉接到第二次增殖培養基中,第二次增殖培養基的配方為:MS+6-BA3.8~4.2mg/L+NAA0.8~1.2mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30~40天,在切口處長出約0.5cm高的第二代叢生芽,新芽的增殖倍數達10倍以上;

6.第三次增殖培養:將第二代叢生芽切割后轉接到第三次增殖培養基中,第三次增殖培養基的配方為:MS+6-BA1.5~2.5mg/L+NAA0.8~1.2mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30~40天,在切口處長出1cm高的第三代叢生芽,新芽的增殖倍數達5倍以上,并開始有不定根的生長;

7.壯苗培養:將第三代叢生芽切割后轉接于壯苗培養基中,該培養基配方為:MS+NAA1.0~1.5mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養30~45天,形成2~3cm高的不定芽;

8.生根培養:將不定芽接種于生根培養基中,該培養基配方為:MS+NAA0.8~1.2mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養60~75天,每株苗形成2~3條根,根長2~4cm,直徑約1mm;

9.光培煉苗:將已生根的苗連同培養瓶轉入大棚,在溫度為25~30℃下,放置7天,去掉瓶塞,煉苗5~7天,即可將種苗取出移栽。

以上所述的MS培養基為是目前使用最普遍的培養基,具有較高的無機鹽濃度,能夠保證組織生長所需的礦質營養,還能加速愈傷組織的生長。BA即:6-芐基腺嘌呤,是一種細胞分裂素。NAA即:α-萘乙酸,是一種植物生長素。

以幼嫩的莖尖、腋芽或幼莖莖段為外植體材料,因植物細胞活躍,加入濃度較低的植物生長調節劑即可快速誘導分化,但成年態的鐵皮石斛莖段,細胞分裂速度減慢,該莖段作為外植體進行組培,較幼嫩的莖尖、腋芽或幼莖莖段的腋芽萌發率低,植物生長調節劑的加入不好控制。試驗中發現,增殖培養基的配方為:MS+6-BA4.8~5.2mg/L+NAA0.8~1.2mg/L時,愈傷組織過多,繁殖速度快,但壯苗時長達6個月以上,并產出過弱過細不能用的苗;增殖培養基的配方為:MS+6-BA1.5~2.5mg/L+NAA0.8~1.2mg/L時,結果增殖太慢,每周期2~3苗,達不到快繁目的;而以增殖培養基:MS+6-BA3.8-4.2mg/L+NAA0.8~1.2mg/L為緩沖,并結合前兩個增殖培養基配方,則可以使新芽的增殖倍數達10000倍,形成約1cm高的健壯叢生芽,減短培育周期,并能快速培育出合格的鐵皮石斛培苗,為壯苗準備。

本發明的有益效果是:

1.本發明以1年以上生長期的鐵皮石斛離根部三節以上的莖段為外植體材料進行組培快繁,具有取材容易、材料量大、不受季節限制的優點。

2.本發明采用以芽生芽的莖段培養方式,誘導時間段,發生過程簡單,不存在分化的組織或基本植物結構的喪失,能較好的保持母本的生物學性狀,從而保證鐵皮石斛的藥用價值。

3.培養技術簡單易行,采用的消毒方法污染率低,繁殖速度快(增殖倍數可達10000倍),周期短(7~8個月),可增加擴繁速度和生產量,降低了組培生產成本,對瀕危緊缺藥用植物資源再生和持續利用具有重要意義。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步描述,以說明其有益效果,但本發明絕非限于這些例子。

實施例1

鐵皮石斛莖段組培快繁方法,包括以下步驟:

1.莖段外植體的準備:取1年生長期的鐵皮石斛離根部三節以上的莖段,除去葉片,用流水沖洗干凈;

2.莖段外植體的消毒:將清洗干凈的莖段外植體取出,置燒杯中,用0.1%的升汞溶液浸泡5分鐘,用無菌水沖洗5次,置超凈工作臺上,切成長度為1~2cm、帶2~3個節的小莖段,再用0.1%的升汞溶液浸泡3分鐘,用無菌水沖洗5次,備用;

3.誘導培養:將消毒好的小莖段接種于無菌誘導培養基中,該培養基配方為:MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.8mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養40天,莖段在節間處長出約0.5cm高的新芽;

4.第一次增殖培養:將新芽轉接到第一次增殖培養基中,第一次增殖培養基的配方為:MS+6-BA4.8mg/L+NAA0.8mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30天,在切口處長出約0.5cm高的第一代叢生芽,新芽的增殖倍數達20倍;

5.第二次增殖培養:將第一代叢生芽切割后轉接到第二次增殖培養基中,第二次增殖培養基的配方為:MS+6-BA3.8mg/L+NAA0.8mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30天,在切口處長出約0.5cm高的第二代叢生芽,新芽的增殖倍數達10倍;

6.第三次增殖培養:將第二代叢生芽切割后轉接到第三次增殖培養基中,第三次增殖培養基的配方為:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.8mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養40天,在切口處長出1cm高的第三代叢生芽,新芽的增殖倍數達5倍,并開始有不定根的生長;

7.壯苗培養:將第三代叢生芽切割后轉接于壯苗培養基中,該培養基配方為:MS+NAA1mg/L培養基,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養30天,形成2~3cm高的不定芽;

8.生根培養:將不定芽接種于生根培養基中,該培養基配方為:MS+NAA0.8mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養60天,每株苗形成2~3條根,根長2~4cm,直徑約1mm;

9.光培煉苗:將已生根的苗連同培養瓶轉入大棚,在溫度為25~30℃下,放置7天,去掉瓶塞,煉苗7天,即可將種苗取出移栽。

實施例2

鐵皮石斛莖段組培快繁方法,包括以下步驟:

1.莖段外植體的準備:取2年生長期的鐵皮石斛離根部三節以上的莖段,除去葉片,用流水沖洗干凈;

2.莖段外植體的消毒:將清洗干凈的莖段外植體取出,置燒杯中,用0.1%的升汞溶液浸泡5分鐘,用無菌水沖洗4次,置超凈工作臺上,切成長度為1~2cm、帶2~3個節的小莖段,再用0.1%的升汞溶液浸泡3分鐘,用無菌水沖洗4次,備用;

3.誘導培養:將消毒好的小莖段接種于無菌誘導培養基中,該培養基配方為:MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養40天,莖段在節間處長出約0.5cm高的新芽;

4.第一次增殖培養:將新芽轉接到第一次增殖培養基中,第一次增殖培養基的配方為:MS+6-BA5.0mg/L+NAA1.0mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30天,在切口處長出約0.5cm高的第一代叢生芽,新芽的增殖倍數達100倍;

5.第二次增殖培養:將第一代叢生芽切割后轉接到第二次增殖培養基中,第二次增殖培養基的配方為:MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養35天,在切口處長出約0.5cm高的第二代叢生芽,新芽的增殖倍數達10倍;

6.第三次增殖培養:將第二代叢生芽切割后轉接到第三次增殖培養基中,第三次增殖培養基的配方為:MS+6-BA1.8mg/L+NAA1.0mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30天,在切口處長出1cm高的第三代叢生芽,新芽的增殖倍數達10倍,并開始有不定根的生長;

7.壯苗培養:將第三代叢生芽切割后轉接于壯苗培養基中,該培養基配方為:MS+NAA1.2mg/L培養基,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養45天,形成2~3cm高的不定芽;

8.生根培養:將不定芽接種于生根培養基中,該培養基配方為:MS+NAA1.0mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養75天,每株苗形成2~3條根,根長2~4cm,直徑約1mm;

9.光培煉苗:將已生根的苗連同培養瓶轉入大棚,在溫度為25~30℃下,放置7天,去掉瓶塞,煉苗5天,即可將種苗取出移栽。

實施例3

鐵皮石斛莖段組培快繁方法,包括以下步驟:

1.莖段外植體的準備:取3年生長期的鐵皮石斛離根部三節以上的莖段,除去葉片,用流水沖洗干凈;

2.莖段外植體的消毒:將清洗干凈的莖段外植體取出,置燒杯中,用0.1%的升汞溶液浸泡5分鐘,用無菌水沖洗4次,置超凈工作臺上,切成長度為1~2cm、帶2~3個節的小莖段,再用0.1%的升汞溶液浸泡3分鐘,用無菌水沖洗5次,備用;

3.誘導培養:將消毒好的小莖段接種于無菌誘導培養基中,該培養基配方為:MS+6-BA1.2mg/L+NAA1.2mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養40天,莖段在節間處長出約0.5cm高的新芽;

4.第一次增殖培養:將新芽轉接到第一次增殖培養基中,第一次增殖培養基的配方為:MS+6-BA5.2mg/L+NAA1.2mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養30天,在切口處長出約0.5cm高的第一代叢生芽,新芽的增殖倍數達50倍;

5.第二次增殖培養:將第一代叢生芽切割后轉接到第二次增殖培養基中,第二次增殖培養基的配方為:MS+6-BA4.2mg/L+NAA1.2mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養40天,在切口處長出約0.5cm高的第二代叢生芽,新芽的增殖倍數達15倍;

6.第三次增殖培養:將第二代叢生芽切割后轉接到第三次增殖培養基中,第三次增殖培養基的配方為:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.8mg/L,溫度24~26℃、日光燈照射24小時/天、光照強度800~1200lx,培養35天,在切口處長出1cm高的第三代叢生芽,新芽的增殖倍數達8倍,并開始有不定根的生長;

7.壯苗培養:將第三代叢生芽切割后轉接于壯苗培養基中,該培養基配方為:MS+NAA1.5mg/L培養基,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養40天,形成2~3cm高的不定芽;

8.生根培養:將不定芽接種于生根培養基中,該培養基配方為:MS+NAA0.8mg/L,培養條件:溫度24~26℃、日光燈照射16小時/天、光照強度2000~2400lx,培養60天,每株苗形成2~3條根,根長2~4cm,直徑約1mm;

9.光培煉苗:將已生根的苗連同培養瓶轉入大棚,在溫度為25~30℃下,放置7天,去掉瓶塞,煉苗6天,即可將種苗取出移栽。

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