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淫羊藿苷在制備促血管新生藥物中的應用.pdf

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淫羊藿 制備 血管 新生 藥物 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201310099332.5

申請日:

20130326

公開號:

CN103156875A

公開日:

20130619

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/7048,A61P9/10 主分類號: A61K31/7048,A61P9/10
申請人: 遵義醫學院
發明人: 龔其海,李菲,石京山
地址: 563000 貴州省遵義市大連路201號
優先權: CN201310099332A
專利代理機構: 貴陽中新專利商標事務所 代理人: 李亮;程新敏
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310099332.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種淫羊藿苷在制備促血管新生藥物中的應用。本發明采用淫羊藿苷來制備促血管新生的藥物,經過動物實驗驗證得知,制備得到的藥物組合物能防治肢體缺血性損傷及腸道(小腸、大腸)缺血性損傷,包括永久性缺血性損傷和缺血-再灌注損傷。本發明材料來源廣泛,易于獲取,用于制備藥物簡單易行、治療效果好。

權利要求書

1.淫羊藿苷在制備促血管新生藥物中的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及藥學領域,尤其是一種淫羊藿苷在制備促血管新生藥物中的應用。

背景技術

肢體缺血是指任何病因所致突發肢體灌注減少,并潛在危及肢體活力。與慢性嚴重肢體缺血相比,急性肢體缺血時限不超過2周。引發肢體缺血的病因很多,其中常見有重建/移植物血栓形成、栓塞、自體動脈血栓形成、周圍動脈瘤附壁血栓脫落/血栓形成、創傷(包含醫源性),其中移植物血栓形成是急性肢體缺血的最常見病因。癥狀的劇烈程度與病因有關,早期(數小時以內)出現突發劇烈疼痛的病因以栓塞、周圍動脈瘤附壁血栓脫落/血栓形成、創傷最常見;后期(數天)才表現癥狀的病因多見移植物或自體動脈血栓形成。癥狀出現早晚與側支循環多少,或血栓延長是否累及重要側支引起流出道阻塞有關。導管介導下的局部溶栓可能恢復循環,但其帶來的再灌注損傷可能引起更加嚴重的后果。這不僅見于臨床,而且也為不同種屬(兔、大鼠、豚鼠、狗、豬等)的大量動物實驗所證明。所以,肢體缺血和/或再灌注損傷在經溶栓、擴血管藥物等治療無效的情況下,難以脫離截肢的厄運。

腸缺血性損傷,又稱缺血性腸病,系因腸壁缺血、乏氧,最終發生梗死的疾病。本病多見于患動脈硬化,心功能不全的老年患者。病變多以結腸脾曲為中心呈節段性發生。造成結腸缺血的直接原因多為腸系膜動、靜脈,特別是腸系膜上動脈因粥樣硬化或血栓形成引起的血管閉塞及狹窄。心力衰竭、休克引起血壓降低,腸局部供血不足也可成為發病原因。對于由缺血性腸病引起的腸功能紊亂的治療,應以治療原發疾病為主。如積極糾正休克,禁食、靜脈高營養,使腸道充分休息,并給予廣譜抗生素。心功能正常時則盡可能撤去造成腸系膜血管收縮的藥物如洋地黃和血管加壓素。嚴重的腸功能紊亂不僅不利于缺血病變的恢復,而且可以加重缺血,甚至引起水電解質紊亂、蛋白缺失性結腸病、結腸穿孔等并發癥。因此,應予以積極對癥治療,如結腸脹氣者給予腸管排氣減壓和經鼻飼管抽氣減壓;惡心、嘔吐者給予止吐藥物和胃腸動力藥物;腹瀉者給予腸道黏膜保護劑如思密達、次碳酸鉍劑。解痙劑如阿托品、山莨菪堿等和鴉片類制劑如苯乙哌啶、洛哌丁胺等可以減少腸蠕動,使鹽和水由于增加了與腸道接觸時間而增加重吸收,從而減少大便次數和緩解腹部疼痛,但由于些藥物有誘發腸麻痹和腸穿孔的可能,故在實際工作中應慎重選擇。糖皮質激素對缺血性病變恢復無幫助,且有促發腸穿孔的可能,故不提倡使用。大部分非壞疽性患者經過上述治療在1周內可以得到改善,如仍繼續腹瀉、出血或有明顯梗阻癥狀,一般即需外科手術。

鑒于目前肢體缺血性損傷及腸缺血性損傷至今尚無完美的解決辦法,故有學者提出了治療性血管新生的策略對其治療。機體組織缺血時往往有側枝形成,而漸進性閉塞時,血管新生側枝形成則對血流量的維持更為重要。由于機體自身血管新生的能力有限,故治療性血管新生正是通過強化血管新生過程來治療該類疾病。

中草藥治療缺血性疾病歷史悠久,但按照現代醫學,尤其是循證醫學的的標準,目前尚無確切證據。如果從中草藥活性成分中能夠發現一種有效的促血管新生化合物,這對中草藥治療缺血性疾病的解釋及該化合物用于缺血性疾病的治療意義重大。

淫羊藿苷(Icariin)為一種已知化合物,分子式:C33H40O15,其結構式為:

該化合物為小檗科植物淫羊藿Epimedium?brevicornum?Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium?sagittatum?Maxim.?、柔毛淫羊藿Epimedium?pubescens?Maxim.、巫山淫羊藿Epimedium?wushanense?T.S.Ying或朝鮮淫羊藿Epimedium?koreanum?Nakai?的干燥莖葉提取物。

已知該化合物具有增加心腦血管血流量、促進造血功能、提高免疫功能及骨代謝等作用,具有補腎壯陽、抗衰老、抗腫瘤等功效。淫羊藿苷能促進性功能是陰氣科室精液分泌亢進,精囊充滿后,刺激感覺神經,間接興奮性欲而引起。淫羊藿苷可以從不同方面影響衰老機制,如影響細胞傳代,延長生長期,調節免疫和分泌系統,改善機體代謝和各器官功能。在心血管系統,淫羊藿苷對垂體后葉素引起的大鼠心肌缺血有一定保護作用,具有明顯的降壓作用。此外,淫羊藿苷還具有抑菌、抗病毒、抗炎等作用,以及降血脂、降血糖作用和抗腫瘤等作用。但迄今尚無促血管新生的報道。

發明內容

本發明的目的是:提供一種淫羊藿苷在制備促血管新生藥物中的應用,將淫羊藿苷用于制備防治肢體缺血性損傷及腸道缺血性損傷的藥物組合物中,具有良好的促血管新生作用,以克服現有技術的不足。

本發明是這樣實現的:淫羊藿苷在制備促血管新生藥物中的應用。

本發明采用血管內皮生長因子受體抑制劑?(VRI)?Axitinib誘導的斑馬魚血管損傷模型,觀察淫羊藿苷的促血管新生作用。VRI誘導3?h后,給予不同濃度的ICA?(10,30,100,300?μM),分別作用24和48?h。結果發現,淫羊藿苷具有防治VRI誘導的斑馬魚血管損傷的作用,顯著地促進斑馬魚體節間血管和腸下靜脈的發生,呈劑量和時間依賴性;

采用股動脈離斷所致的在體大鼠肢體缺血模型,觀察淫羊藿苷的促血管新生作用,并檢測缺血區肌肉血管內皮生長因子的mRNA表達。將所有大鼠的左側股動脈結扎離斷制備大鼠肢體缺血模型,右側肢體不做處理,作為內在對照。動物清醒后開始給藥,分別給淫羊藿苷10、20、40?mg/kg,每日2次,連續4周。結果顯示,淫羊藿苷具有明顯的促進肢體缺血區血管新生作用,增加缺血區肌肉血管內皮生長因子的mRNA表達。

實驗結果證明,所述的淫羊藿苷具有促血管新生作用,可應用于制備藥物組合物防治肢體缺血性損傷及腸道缺血性損傷。

為了進一步驗證本發明的技術效果,進行了如下實驗:

實驗1:淫羊藿苷(ICA)促進斑馬魚體節間血管和腸下靜脈新生實驗

斑馬魚的飼養:Tg(fli1-EGFP)轉基因斑馬魚,它能在內皮細胞中表達綠色熒光蛋白(green?fluorescent?protein,?GFP),是由ZFIN(Oregon)所提供的。而一般野生型的斑馬魚是從本地的寵物店所購取。斑馬魚的飼養方法是根據斑馬魚手冊的描述而設定。簡而言之,斑馬魚飼養在25升的反滲水中,水溫控制在攝氏28℃,光照按14小時日光和10小時無光為周期,并控制在每天早上9:30開始光照,每日以豐年蝦及熱帶魚糧于早上及下午喂飼兩次。

????斑馬魚胚胎的收集:于光照后一小時進行胚胎收集,收集后的胚胎以反滲水在培養冊中以28.5℃的環境下培養。于4?hpf(hours?post?fertilization)從培養皿挑出未受精及發育不健全的胚胎,剩下健康胚胎仍在反滲水在28.5℃的條件下培養。

淫羊藿苷(ICA)對斑馬魚體節間血管和腸下靜脈新生的影響:采用血管內皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑?(VRI)?Axitinib誘導斑馬魚血管損傷模型,觀察ICA促血管新生的作用。VRI誘導3?h后,給予不同濃度的ICA?(10,30,100,300?μM),分別作用24和48?h。結果發現,ICA具有治療VRI誘導的斑馬魚血管損傷的作用,顯著地促進斑馬魚體節間血管和腸下靜脈的新生,呈劑量和時間依賴性。

實驗2:淫羊藿苷(ICA)促進大鼠肢體小血管新生實驗

雄性SD大鼠(體重300-350?g)隨機分為Model對照組;Model+ICA10、ICA20、40?mg/kg治療組,所有動物的左側股動脈結扎離斷制備大鼠肢體缺血模型,右側肢體不做處理,作為內在對照。動物清醒后開始給藥,每日2次,連續給藥4周。模型制備步驟:10%水合氯醛(IP.?350?mg/kg)麻醉,固定大鼠,剪左下肢股骨處內側被毛,消毒,在左下肢股骨中斷處,做一總行皮膚切口,長約1.5?cm,逐層分離皮膚、筋膜、肌肉,暴露股動脈,結扎股動脈兩側,并剪斷5?mm,創面滴青霉素液體,縫合皮膚。整個手術過程在保溫墊進行,術后大鼠肌注青霉素。放射造影技術:給藥結束后,大鼠麻醉固定,剪開腹腔暴露腹主動脈,在腎下腹主動脈處結扎,從腎下腹主動脈處結扎向遠心端穿刺動脈留置針于腹主動脈內1?cm,注入溫肝素鈉2?mL/只(10?U/mL),1?min后注入硝酸甘油3?mL/只(0.2?mg/mL),1?min后注入生理鹽水2?mL/只,1?min后注入60%碘化對比劑3?mL/只,立即采用X線攝影術觀察肢體小血管情況。結果發現,淫羊藿苷具有明顯的促進肢體缺血區肢體小血管新生作用。

實驗3:淫羊藿苷(ICA)促進大鼠腓腸肌VEGFmRNA表達實驗

雄性SD大鼠(體重300-350?g)隨機分為Model對照組;Model+ICA10、ICA20、40?mg/kg治療組,所有動物的左側股動脈結扎離斷制備大鼠肢體缺血模型,右側肢體不做處理,作為內在對照。動物清醒后開始給藥,每日2次,連續給藥4周。模型制備步驟同實施例2。給藥結束后分離雙側腓腸肌,采用real?time?RT-PCR法測定其VEGFmRNA表達。結果發現,淫羊藿苷具有明顯增加缺血側腓腸肌VEGFmRNA表達的作用。

根據以上動物實驗結果表明,本發明采用淫羊藿苷來制備促血管新生的藥物,制備得到的藥物組合物能防治肢體缺血性損傷及腸道(小腸、大腸)缺血性損傷,包括永久性缺血性損傷和缺血-再灌注損傷。本發明材料來源廣泛,易于獲取,用于制備藥物簡單易行、治療效果好。

附圖說明

圖1是淫羊藿苷促進斑馬魚胚胎魚體節間血管和腸下靜脈的新生的熒光圖;

其中,Control表示未給血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib,VRI?500?ng/ml表示培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml,ICA?10μM表示在培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml作用3小時后,再用含淫羊藿苷10μM的培養液置換,ICA?30μM表示在培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml作用3小時后,再用含淫羊藿苷30μM的培養液置換,ICA?100μM表示在培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml作用3小時后,再用含淫羊藿苷100μM的培養液置換,ICA?300μM表示在培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml作用3小時后,再用含淫羊藿苷300μM的培養液置換,hrs代表小時,hpf代表正常培養多少小時后,ISVs代表肌節間血管,Defective?ISVs代表缺失的肌節間血管,Intact??ISVs代表未受損的肌節間血管;

圖2是淫羊藿苷促進斑馬魚胚胎魚體節間血管和腸下靜脈的新生的量化圖;

Control表示未給血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib,VRI?500?ng/ml表示培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml,ICA?10μM表示在培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml作用3小時后,再用含淫羊藿苷10μM的培養液置換,ICA代表淫羊藿苷,ICA?30μM表示在培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml作用3小時后,再用含淫羊藿苷30μM的培養液置換,ICA?100μM表示在培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml作用3小時后,再用含淫羊藿苷100μM的培養液置換,ICA?300μM表示在培養液中血管內皮生長因子受體抑制劑Axitinib?的濃度為500?ng/ml作用3小時后,再用含淫羊藿苷300μM的培養液置換,hrs代表小時,hpf代表正常培養多少小時后,ISVs代表肌節間血管,Defective?ISVs代表缺失的肌節間血管,Intact??ISVs代表未受損的肌節間血管;

圖3是淫羊藿苷(ICA)促進大鼠肢體小血管新生實驗X線攝影圖;

其中Model代表模型,ICA-10代表淫羊藿苷10mg/kg治療,ICA-20代表淫羊藿苷20mg/kg治療,ICA-40代表淫羊藿苷40mg/kg治療,L代表左側,R代表右側;

圖4是淫羊藿苷(ICA)促進大鼠肢體小血管新生實驗X線攝影后的血管造影評分;

其中,ICA代表淫羊藿苷,Angiographic?score為血管造影評分,分值越高,表明新生血管越多,Model設定為1。**代表淫羊藿苷治療組與Model比較,p<0.01;

圖5是淫羊藿苷(ICA)促進大鼠腓腸肌VEGFmRNA表達實驗;

其中,肌VEGF代表血管內皮生長因子,relative?transcript?levels?(%?of?Model)代表VEGFmRNA的相對轉錄水平,Model設定為100,以占模型組的百分之多少表示,**代表淫羊藿苷治療組與Model比較,p<0.01。

具體實施方式

本發明的實施例1:取淫羊藿苷5g、藥用淀粉75?g、微晶纖維素20?g,將藥用淀粉先干燥,過120目篩,再與淫羊藿苷、微晶纖維素混合,過兩次120目篩,填入硬膠囊中,制成1000粒本發明膠囊。每粒硬膠囊含主藥成分0.5?mg。

本發明的實施例2:淫羊藿苷?5g、羥丙甲纖維素6g、羧甲淀粉鈉10g,微晶纖維素8g,乳糖115g、淀粉50g,硬脂酸鎂1g;將主藥與輔料充分混勻后投入高速攪拌機中,噴霧加水適量,整粒,水分控制在3~4%,然后壓片,制成1000片,包薄膜衣。

本發明的實施例3:淫羊藿苷5g,加入400?ml聚乙二醇200溶解,再加入適量蒸餾水進行稀釋,然后再加入適量蔗糖并調整體積至1000?ml,攪勻,過濾,灌裝成10?ml?或20?ml?每只,滅菌包裝。

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