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刺木骨苷B1在治療或預防流感類抗病毒藥物中的應用.pdf

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刺木骨苷 B1 治療 預防 流感 抗病毒 藥物 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201210562381.3

申請日:

20121219

公開號:

CN103156874B

公開日:

20141224

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/7048,A61P31/16 主分類號: A61K31/7048,A61P31/16
申請人: 廣東省中醫院
發明人: 黎雄,楊子峰,曾星,黎旭釗
地址: 510000 廣東省廣州市越秀區大德路111號
優先權: CN201210562381A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210562381.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及刺木骨苷B1在治療或預防流感類抗病毒藥物中的應用,所述流感病毒包括了甲乙型流感病毒和可感染人的禽流感病毒。所述抗病毒藥物是以刺木骨苷B1作為單一有效成分制成抗流感病毒單方藥,或將刺木骨苷B1作為有效成分之一制成抗流感病毒復方藥物,刺木骨苷B1的重量含量為1~99%,將該藥物制成藥劑學上的任何劑型,應用于防治流感病毒引起的感染性疾病。

權利要求書

1.刺木骨苷B作為唯一活性成分在制備治療或預防流感類抗病毒藥物中的應用。2.如權利要求1所述應用,所述的刺木骨苷B來源是從天然提取或者化學合成。3.如權利要求1所述應用,所述流感病毒為甲、乙型流感病毒或禽流感病毒。4.如權利要求3所述應用,所述甲、乙型流感病毒或禽流感病毒為人流感病毒H1N1亞型、H3N2亞型、禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型以及INFB型。5.如權利要求4所述應用,所述的人流感病毒H1N1亞型為新甲型H1N1流感病毒。6.如權利要求1所述應用,所述藥物為藥劑學上的膠囊劑、片劑、顆粒劑、注射液、凍干粉針、糖漿、口服液、吸入劑、噴霧劑、乳膏、霜劑和凝膠劑。

說明書

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域,具體地,本發明涉及刺木骨苷B1在用于治療流感病毒引起的疾病中的用途。本發明還涉及含有該成分的藥物組合物在制備抗流感病毒的藥物和預防制劑的用途,以及治療流感病毒引起的疾病及與其并發的疾病、障礙或者病癥的方法。?

背景技術

目前用于治療和預防流感病毒的抗病毒藥物主要有神經氨酸酶抑制劑(NAI)奧司他韋和扎那米韋;以及M2離子通道抑制劑金剛烷胺類,包括金剛烷胺和金剛乙胺。但以上兩類化合藥物有著各種副作用以及局限性,如易產生耐藥性等,這也成為臨床治療及新藥開發的重要問題。抗病毒中藥具有療效穩定、毒副作用較小以及不易產生耐藥性、不促使病毒變異等優點,而且藥源豐富,價格低廉,因此抗病毒中藥以其獨特的療效優勢,在治療病毒性疾病中發揮著不可替代的作用,特別是當人類面臨病毒性疾病長期而嚴峻的挑戰時,抗病毒中藥將擁有巨大的市場和廣闊的開發前景。而抗病毒中藥有其獨特的作用物質基礎,從這些中藥中分離制備并篩選到抗流感病毒有效成分,發現其獨特藥效作用機制,并獲得自主知識產權,對于發掘祖國醫學寶庫,開發安全有效的一類中藥新藥或組分中藥新藥具有重要意義。刺木骨苷B1為來源于草珊瑚、刺五加等中藥的香豆素類化合物,原料中藥來源豐富,價廉,顯示良好的藥物應用前景。?

文獻已經公開了該化合物結構,刺木骨苷B1結構式為:?

但目前文獻報道中還沒有出現刺木骨苷B1抗流感病毒活性報道及其在抗流感病毒方面的應用。?

發明內容

本發明目的在于彌補現有技術的不足,提供刺木骨苷B1的新用途,即在預防和/或治療?流感病毒引起的疾病及其并發癥的新應用,為臨床流感病毒性疾病的治療提供一種安全有效、毒副作用小的天然藥物。?

本發明刺木骨苷B1在治療或預防流感類抗病毒藥物中的應用,是將刺木骨苷B1作為單一有效成分制成抗流感病毒藥物,或將刺木骨苷B1作為有效成分之一制成抗流感病毒復方藥物實現的。?

本發明的技術方案還包括:所述復方藥物包括刺木骨苷B1和醫藥學上可接受的載體,按照重量百分比計刺木骨苷B1用量為1%~99%,醫藥學上可接受的載體用量為1%~99%。?

本發明的技術方案還包括:所述的刺木骨苷B1是從天然植物提取或者化學合成的。?

本發明的技術方案還包括:所述流感病毒包括但不限于甲、乙型流感病毒和禽流感病毒;所述甲、乙型流感病毒和禽流感病毒包括但不限于人流感病毒H1N1亞型、H3N2亞型、禽流感病毒H6N2、H7N3、H9N2亞型以及INF?B型,所述的人流感病毒H1N1亞型包括新甲型H1N1流感病毒。?

本發明的技術方案還包括:將抗流感病毒藥物或抗流感病毒復方藥物制成藥劑學上的膠囊劑、片劑、顆粒劑、注射液、凍干粉針、糖漿、口服液、吸入劑、噴霧劑以及乳膏、霜劑、凝膠劑。?

上述的醫藥學上可接受的載體包括:填充劑:包括淀粉、糊精、糖粉、預膠化淀粉、乳糖、葡萄糖、微精纖維素、碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣。黏合劑:包括羥丙甲纖維素、聚維酮、淀粉漿、糊精漿、膠漿、糖漿、聚乙二醇、海藻酸鈉、阿拉伯膠、桃膠。崩解劑:包括交聯聚維酮、交聯羧甲基纖維素鈉、羥丙基淀粉、羧甲淀粉鈉、酒石酸、檸檬酸、碳酸氫鈉、碳酸鈉、酸酐。潤滑劑:包括滑石粉、硬脂酸鎂、液體石蠟、微粉硅膠、聚乙二醇。?

本發明利用現代分離手段與鑒定技術,從傳統無毒中藥草珊瑚中分離鑒定活性成分刺木骨苷B1,明確其抗病毒有效成分及部分抗病毒作用機制。?

本發明用刺木骨苷B1抗流感病毒是采用細胞病變抑制法在治療、保護、直接三種模式的實驗下確認刺木骨苷B1對甲型流感病毒的抑制作用,以利巴韋林為對照藥,觀察刺木骨苷B1對MDCK細胞的毒性作用和對甲型流感病毒的抑制作用,利用MTT法測得受試藥物的半數有毒濃度(TC50)為0.145mg/mL,經50%雞紅血球處理后的刺木骨苷B1的半數有毒濃度(TC50)大于0.5mg/mL,對照為0.644mg/mL,在治療模式下刺木骨苷B1抗甲型流感病毒的半數有效濃度IC50為0.04mg/mL,對照為0.005mg/mL,證實刺木骨苷B1在治療模式下對流感病毒有明顯抑制作用,其選擇指數SI是3.625,為低毒高效。?

為進一步研究刺木骨苷B1對甲型流感病毒的體外抗病毒作用機制,采用間接熒光法觀察刺木骨苷B1對甲型流感病毒感染MDCK細胞后的NP蛋白出核情況,并以Real-time?PCR和?細胞病變抑制法分別測定其病毒產量和TCID50,結果刺木骨苷B1在藥物濃度為0.04mg/mL(IC50)和0.08mg/mL時,在病毒感染兩小時后加入藥物后,其病毒合成的NP蛋白明顯減少,但是在細胞質中仍能觀察到NP蛋白;Real-time?PCR結果顯示,在病毒感染兩小時后加入藥物,均可降低病毒產量,加入0.08mg/mL藥物時,病毒產量與病毒組相比降低100倍,進一步驗證刺木骨苷B1對甲型流感病毒具有顯著的抑制作用,并且通過抑制病毒進入細胞,達到抑制病毒復制的效果。?

附圖說明

圖1是刺木骨苷B1質譜圖:ESI-MS(-);?

圖2是刺木骨苷B1質譜圖:ESI-MS(+);?

圖3是刺木骨苷B1核磁圖:1H-NMR(500MHz,DMSO-d6);?

圖4是刺木骨苷B1核磁圖:13C-NMR(125MHz,DMSO-d6);?

圖5是藥物凝血現象;?

圖6是熒光實驗;?

圖7是刺木骨苷B1時間點實驗Real-time?PCR病毒拷貝數(注:橫坐標分別為N:正常對照組,V:病毒對照組,加藥時間:-8h,-4h,-2h,0h,2h,4h,8h;縱坐標為病毒拷貝數);?

圖8是刺木骨苷B1時間點實驗Real-time?PCR病毒拷貝數(注:橫坐標分別為N:正常對照組,V:病毒對照組,加藥時間:-8h,-4h,-2h,0h,2h,4h,8h;縱坐標為病毒拷貝數)。?

具體實施方式

為更好理解本發明,下面結合具體實施實例以及試驗例對本發明內容作進一步說明,但本發明的保護內容不局限于以下實例。?

實施例1刺木骨苷B 1 單體成分分離純化、結構鑒定及制備

1.1.草珊瑚全草5kg,70%乙醇回流提取,濃縮至無乙醇味得草珊瑚全草70%乙醇提取物總流浸膏,將流浸膏混懸水溶,依次用乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3次,得草珊瑚乙酸乙酯、正丁醇萃取物。?

1.2.取正丁醇萃取物部分,2-3倍硅膠拌樣,濕法上硅膠柱,采用柱色譜分離,CH2Cl2:MeOH梯度洗脫,收集洗脫液約半個柱體積為一個流份,TLC分析,合并相同子流份。?

1.3.取正丁醇萃取物硅膠柱洗脫部分含有刺木骨苷B1成分子流份,經Sepadex?LH-20柱,MeOH.洗脫,其子流分再經ODS柱,MeOH:H2O梯度洗脫,得到含量大于80%的粗品約1.5g,進一步重結晶或制備液相進一步純化得到純度大于98%純品。ESI-MS確定其分子?量為384(見圖.1),1H-NMR,13C-NMR譜(見圖.2)鑒定其為刺木骨苷B1(eleutherosideB1),其質譜、核磁數據解析如下:?

ESI-MS?m/z?383[M-H]-;407[M+Na]+。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:6.40(1H,d,J=9.5Hz,H-3),7.96(1H,d,J=9.5Hz,H-4),7.13(1H,s,H-5),3.91(3H,s,OCH3-8),3.82(3H,s,OCH3-6),5.16(1H,d,J=6.5Hz,H-1′).13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:160.2(C-2),115.2(C-3),144.8(C-4),105.9(C-5),150.0(C-6),142.8(C-7),140.1(C-8),142.1(C-9),115.0(C-10),102.6(C-1′),70.3(C-2′),76.9(C-3′),70.3(C-4′),78.0(C-5′),61.2(C-6′),61.7(C-6-OCH3),57.0(C-8-OCH3).?

以下通過具體實施例說明刺木骨苷B1在本發明的新用途下,可制備成藥學上常規的制劑,但刺木骨苷B1的用量及制備劑型并不局限于所述實施例范圍內。?

實施例2刺木骨苷B 1 靜脈注射用注射液制備

處方:?

按照注射劑的常規操作制成2ml規格注射劑1000支,每支含刺木骨苷B12mg。用法:每次2.0ml,肌肉注射、靜脈注射或靜脈點滴,每天2次,三天為一療程。?

實施例3刺木骨苷B 1 含氯化鈉的無菌粉針劑制備

處方:?

按無菌粉針劑的常規操作共制成2ml粉針劑1000支,每支含刺木骨苷B12mg。用法:每次2.0ml,肌肉注射、靜脈注射或靜脈點滴,每天2次,三天為一療程。?

實施例4刺木骨苷B 1 片劑制備

處方:?

按片劑常規方法制備,共制成1000片,每片含刺木骨苷B15mg。用法:每次2-4片,每天3次,七天為一療程。?

實施例5刺木骨苷B 1 膠囊劑制備

處方:?

按膠囊常規方法制備,共制成1000粒,每粒膠囊含刺木骨苷B15mg。用法:每次2-4粒,每天3次,七天為一療程。?

下面提供的試驗例對刺木骨苷B1所具有的上述功效加以證實,用于進一步闡明本發明,而不構成對本發明范圍的限制?

試驗例1刺木骨苷B 1 甲型流感病毒的體外抗病毒作用

1.1.材料?

1.1.1藥物陽性對照藥物利巴韋林購自廣東肇慶星湖生物科技有限公司,批號:L20120325。受試樣品:刺木骨苷B1。?

1.1.2細胞狗腎細胞(MDCK)購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(ATCC);本次試驗所用代數為20~35代。?

1.1.3病毒株普通甲型H1N1流感病毒(A/PR/8/34,H1N1)購自ATCC,以Reed-Muench法測定其半數感染量(TCID50)為10-5.33作為病毒滴度。?

1.1.4試劑DMEM培養基(批號:20120503);PBS(批號:20120610),胎牛血清(批號:10099)均購自GIBCO公司;TPCK(批號:20120512)購自廣州捷倍斯公司。?

1.2、實驗方法?

1.2.1藥物溶解刺木骨苷B1以DMEM培養基溶解配制成工作母液(濃度4mg/ml),經0.22μm濾膜過濾后置4℃保存;陽性藥物利巴韋林用DMEM培養液溶解,過濾后置4℃保存。?

1.2.2.藥物毒性實驗(MTT法)?按每孔約2.5×104MDCK細胞接種到96孔板,24~48h待細胞長至單層后,棄丟培養液,加入不同稀釋度的藥物100μL/孔,空白對照組和正常細胞組加入100μL/孔的DMEM,37℃,5%CO2繼續培養36~48h,每孔加MTT溶液(5mg/ml)20ul,置37℃,5%CO2繼續孵育4小時。吸棄培養上清液,每孔加入100μL二甲亞砜(DMSO),低速振蕩10分鐘,使結晶物充分溶解。選擇490nm波長,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。按照下列公式計算抑制率,并用Reed-Muench法[1]計算50%毒性濃度為藥物半數有毒濃度(TC50)。?

(1)空白對照孔(培養基、MTT、DMSO)?

(2)正常細胞對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養基、MTT、DMSO)?

(3)計算抑制率=[(正常-空白)-(給藥-空白)]/(正常-空白)×100%?

1.2.3.抗甲型流感病毒檢測?

以100TCID50甲型流感病毒感染單層MDCK細胞,加入倍比稀釋的刺木骨苷B1,置37℃,5%CO2繼續培養48小時后觀察結果,細胞出現病變程度按以下6級標準記錄(表1)。?

采用細胞病變抑制法在治療、保護、直接三種模式的實驗下確認刺木骨苷B1對甲型流感病毒的抑制作用[3-5];在不同模式下,加藥物、病毒48小時后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)。試驗時設立陽性藥物對照、正常細胞對照及病毒對照。當病毒對照出現“++”則終止實驗,細胞出現病變程度同表1病變(CPE)6級標準;用Reed-Muench計算半數抑制濃度(IC50),并以選擇指數SI表示(SI=TC50/IC50),SI>2表示低毒高效;SI:1~2表示高毒低效;SI<1表示無效。?

表1病變(CPE)6級標準?

用Reed-Muench計算半數抑制濃度(IC50)。?

2.2.4藥物凝血現象50μL刺木骨苷B1單獨與50μL0.5%雞紅細胞在4℃孵育30~60分鐘后,觀察并記錄凝血結果。?

2.2.5藥物處理[6]配制1mg/mL的藥物1mL,加入50%雞紅血球100μL,室溫靜置1小時,1500rpm離心5分鐘,取上清,經0.22μm濾膜過濾后4℃保存,并運用上述的方法研究處理后的刺木骨苷B1對甲型流感病毒的體外抗病毒作用。?

1.3.刺木骨苷B1體外抗流感病毒作用實驗結果

1.3.1毒性實驗?

利用MTT法測得受試藥物的半數有毒濃度(TC50)為0.145mg/mL,經處理后的刺木骨苷B1的半數有毒濃度(TC50)大于0.5mg/mL,屬安全無毒,見表2。?

1.3.2抗甲型流感病毒作用藥效?

在治療模式草珊瑚對甲型流感病毒有抑制作用,SI是3.625;在預防和直接模式下草珊瑚對甲型流感病毒沒有抑制作用,SI<1,經處理后的刺木骨苷B1甲型流感病毒均無抑制作用,見表2。?

表2刺木骨苷B1對甲型流感病毒的抑制作用?

注:A為預防模式;B為治療模式;C為直接模式;NT:Not?Tested,未測試。?

選擇指數(SI),SI>2表示低毒高效;SI:1~2表示高毒低效;SI<1表示無效。?

1.3.3藥物凝血現象?

藥物在濃度大于0.0035mg/mL時,均發生凝血現象(見圖.3),因此,需要經雞紅血球處理后,去除其凝血因子,觀察其對甲型流感病毒是否有抑制作用。?

以上結果表明:在治療模式實驗下,可以看到刺木骨苷B1顯著的抗甲型流感病毒效果,具有體外抑制甲型流感病毒作用。?

試驗例2刺木骨苷B 1 的抗流感病毒藥物作用機制研究

2.1實驗材料?

2.1.1藥物受試樣品:刺木骨苷B1為自制,HPLC分析純度大于95%。?

21.2細胞狗腎細胞(MDCK)購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(ATCC);本次試驗所用代數為20~35代。?

2.1.3病毒株普通甲型H1N1流感病毒(A/PR/8/34,H1N1)購自ATCC,以Reed-Muench法?[1]測定其感染復數(M.O.I),以M.O.I=0.01作為病毒滴度感染細胞。?

2.1.4試劑DMEM培養基(批號:20120503);PBS(批號:20120610),胎牛血清(批號:10099)均購自GIBCO公司;TPCK(批號:20120512)購自廣州捷倍斯公司。特異性NP抗體(批號:SC80481),羊抗鼠FITC標記抗體(批號:SA00003-1),DAPI(批號:C1002)?

2.2實驗方法?

2.2.1.間接熒光法?

2.2.1.1MDCK細胞常規接種到有小玻片的48孔板,待細胞長成單層,棄去培養液,用PBS清洗細胞單層,分別在感染細胞前8h,4h,2h分別加入MEM溶解的刺木骨苷B1,以流感病毒PR8株(M.O.I=0.01)感染細胞。?

2.2.1.2病毒感染前細胞板4℃預冷30min,用預冷PBS清洗細胞一遍,分別加入病毒液200uL后置4℃孵育2h,棄病毒上清液,PBS清洗細胞一遍,加入含TPCK的培養液。?

2.2.1.3感染后0h,2h,4h,6h,8h,吸棄各孔病毒液,分別加入含TPCK的MEM溶解的刺木骨苷B1,同時設正常細胞和病毒對照孔。置34℃,5%CO2繼續培養24小時。?

2.2.1.4培養24小時后,收集病毒液上清液與細胞,分別用Real-time?PCR和細胞病變抑制法測定其病毒滴度,取出玻片同時進行熒光實驗。?

2.2.1.5用PBS緩沖液洗細胞單層2遍,然后每孔加入200μL4%多聚甲醛固定細胞,4℃保存。?

2.2.1.6固定后用PBS洗細胞單層3次(5min/次),0.5%Triton?100破膜15min室溫,PBS洗細胞單層3次;以PBS稀釋成5%羊血清室溫孵育20分鐘封閉。吸走封閉液,孵育流感病毒NP蛋白抗體(1∶200,用1%羊血清稀釋)100μL/孔,4℃過夜。PBS洗細胞3次,充分洗干凈。加入羊抗鼠FIT刺木骨苷B1標記抗體(1∶500,用1%羊血清稀釋)150μL/孔37度孵育30min,PBS洗細胞單層3次;孵育DAPI(5ug/mL)5min標記細胞核,PBS洗細胞單層3次,甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。?

2.2.2.Real-time?PCR?

2.2.2.1PCR反應擴增體系:PCR反應液20μL,TaqDNAPolymerase0.2μL,逆轉錄酶0.5μL,DNA模板5μL。?

2.2.2.2反應條件:48℃5min(1個循環),94℃2mi?n(1個循環);94℃10sec、55℃35sec(40個循環)。?

2.2.2.3結果判定標準:陽性結果判定標準:擴增曲線呈典型S型擴增曲線,且刺木骨苷B1t值≤35.0;陰性結果判定標準:無典型S型擴增曲線或刺木骨苷B1t值>35.0。?

2.3刺木骨苷B1抗流感病毒藥物作用機制實驗結果

2.3.1熒光實驗結果(見圖.4)?

2.3.2Real-time?PCR結果?

見表.3、圖.5、圖.6。?

表3刺木骨苷B1時間點實驗Real-time?PCR結果?

3.3.3TCID50結果?

表4刺木骨苷B1(0.08mg/mL)時間點實驗TCID50結果?

Real-time?PCR和TCID50結果顯示,在感染病毒前加入藥物,病毒產量并沒有明顯的減少,藥物對細胞無保護作用。在病毒感染兩小時后(0~6h)加入藥物,病毒產量與病毒對照組相下降了55~60%,在藥物濃度為008mg/mL時與病毒對照組相比降低了100倍。?

熒光實驗結果顯示,刺木骨苷B1在藥物濃度為0.04mg/mL(IC50)和0.08mg/mL時,在病毒感染兩小時后加入藥物后,其病毒合成的NP蛋白明顯減少,但是NP蛋白并不沒有被限制在細胞核內,在細胞質中仍能觀察到NP蛋白,說明該藥物并不是抑制病毒NP蛋白合成或輸出細胞核,在無毒的藥物濃度提高的前提下,病毒產量顯著減少,所以,該藥物可能在病毒感染早期,抑制病毒進入細胞,從而抑制病毒復制。其作用機制有可能是抑制神經氨酸酶(NA)或M2離子通道蛋白的活性,從病毒NP蛋白的熒光結果來看,蛋白合成產量減少,從而阻止病毒RNP(vRNPs)進入細胞核,但仍需要進一步探討刺木骨苷B1對NA和M2離子通道蛋白的抑制作用,深入闡明藥物作用的機制。?

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