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用于眼角膜移植的他克莫司眼用劑及其制備方法.pdf

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用于 眼角膜 移植 克莫司眼用劑 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310102296.3

申請日:

20130328

公開號:

CN103142468A

公開日:

20130612

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/06,A61K31/436,A61P27/02,A61P37/06,A61K9/48 主分類號: A61K9/06,A61K31/436,A61P27/02,A61P37/06,A61K9/48
申請人: 中山大學
發明人: 徐月紅,李琦
地址: 510006 廣東省廣州市大學城外環東路132號
優先權: 201210582885.1
專利代理機構: 江門創穎專利事務所(普通合伙) 代理人: 曹可芬
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310102296.3

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法律狀態類型:

摘要

用于眼角膜移植的他克莫司眼用劑及其制備方法,屬于藥物制劑領域,具體涉及用于角膜移植的他克莫司眼用前體囊泡劑及其制備方法。前體囊泡劑是由下列質量百分比的原料組成:他克莫司0.04~0.8%,表面活性劑4.0~41.0%,膽固醇1.6~8.0%,卵磷脂4.0~41.0%,醇1.2~30%,其余為水或0.1%甘油水溶液或PH7.4磷酸緩沖液,表面活性劑是為司盤、吐溫、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一種,醇為乙醇、異丙醇、丁醇、丙醇中的一種。他克莫司前體囊泡劑具有限量的水分,提高了制劑貯存穩定性;產品將前體囊泡劑的優點、眼部給藥系統的特點及他克莫司藥物的主治病癥有機結合,達到提高療效,減少副作用,給方便等優點;制備工藝簡便,適合工業化生產。

權利要求書

1.?一種用于眼角膜移植的他克莫司眼用劑,其特征在于將他克莫司制成前體囊泡劑,前體囊泡劑是由下列質量百分比的原料組成:他克莫司??????0.04~0.8%表面活性劑????24.0~41.0%膽固醇????????1.6~8.0%卵磷脂????????24.0~41.0%醇????????????1.2~30%其余為水或體積比0.1%甘油水溶液或PH7.4磷酸緩沖液,所說的表面活性劑是為司盤20、司盤40、司盤60、司盤80、吐溫20、吐溫60、吐溫80、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一種,所說的醇為乙醇、異丙醇、丁醇、丙醇中的一種。2.一種用于眼角膜移植的他克莫司眼用劑的制備方法是:(1)按下列質量百分比的原料配備:他克莫司??????0.04~0.8%表面活性劑????24.0~41.0%膽固醇????????1.6~8.0%卵磷脂????????24.0~41.0%醇????????????1.2~30%其余為水或體積比0.1%甘油水溶液或PH7.4磷酸緩沖液,所說的表面活性劑是為司盤20、司盤40、司盤60、司盤80、吐溫20、吐溫60、吐溫80、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一種,所說的醇為乙醇、異丙醇、丁醇、丙醇中的一種;(2)稱取表面活性劑、醇、卵磷脂、膽固醇、他克莫司加熱至65±5°C,攪拌均勻至各組分完全溶解,呈均一透明狀,作為溶液1;(3)攪拌下向溶液1中滴加水或體積百分濃度為0.1%的甘油水溶液或PH7.4的磷酸緩沖液,65°C繼續攪拌加熱至溶液混合均勻,將混合液取出繼續攪拌至室溫,呈黏稠凝膠態即得他克莫司前體囊泡劑。

說明書

技術領域

本發明屬于藥物制劑領域,更具體涉及一種用于眼角膜移植的他克莫司眼用前體囊泡劑及其制備方法。

背景技術

角膜疾病是目前主要的致盲角膜病,角膜移植手術是治療此類疾病最直接和有效的方法,而角膜移植手術后的免疫排斥反應是失敗的主要原因。目前臨床采用皮質類固醇、免疫抑制劑和環孢素A等一些藥物來降低免疫排斥反應發生率。糖皮質激素是防治術后移植排斥反應的主要手段,但是其長期應用不僅可以導致多種并發癥,而且往往不能有效的抑制高危角膜移植術后的排斥反應。環孢素A在眼科的應用越來越廣泛,但是環孢素滴眼液為油溶性溶劑,其滴入后患者順應性不好,且易發生過敏。臨床試驗表明,他克莫司在心、肺、腸、骨髓等移植中的應用有很好的療效。同時其在治療自身免疫性疾病、眼過敏性疾患,以及角膜移植后的免疫排斥反應均有良好的療效。

他克莫司(Tacrolimus,FK506)是一種大環內酯類新型免疫抑制劑,由一個半酮基,α、β雙酮基及23個環組成,其分子式為C44H69NO12·H2O,分子量為822.5。室溫下呈白色結晶或晶狀粉末,在固體狀態下相對穩定,不溶于水,溶于甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等非極性溶劑。呈親脂疏水性,其熔點為127~129°C。

目前,他克莫司在臨床廣泛上應用于器官移植的抗排斥反應和治療自身免疫系統疾病,在眼科領域已用于角膜移植術后與免疫相關眼病的治療。他克莫司屬鈣調蛋白磷酸酶抑制劑,其免疫抑制作用機制與環孢素A相似,但抑制T?細胞活性的能力比環孢素?A強100倍。其作用機制是通過抑制相關細胞因子轉錄因子的活性來抑制淋巴細胞活化。他克莫司通過與細胞內蛋白FKBP-12結合,形成由他克莫司-FKBP-12、鈣、鈣調蛋白和鈣調磷酸酶構成的復合物,從而抑制鈣調磷酸酶的激活,阻止活化T細胞核轉錄因子(NF-AT)的去磷酸化和易位,NF-AT這種核成分會啟動基因轉錄形成淋巴因子。他克莫司還可以抑制編碼IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSF和TNF-α的基因的轉錄,所有這些因子都參與早期階段的T細胞活化,細胞因而受到抑制,從而發揮強大的免疫抑制作用。經FK506治療的角膜植片,排斥反應的相關因子和細胞表達明顯降低。

目前,藤澤藥品工業公司的他克莫司膠囊、注射液已廣泛用于治療肝、腎和骨髓移植的急性排斥治療,現已經作為預防、治療排斥反應以及自身免疫性疾病的一線藥物。他克莫司獲批準上市的外用制劑為他克莫司軟膏(tacrolimus?ointment,商品名普特彼),其適應癥是中至重度特應性皮炎患者,作為短期或間歇性長期治療。基于眼部給藥的敏感性和刺激性,未見有他克莫司軟膏直接眼部局部給藥用于治療移植后免疫排斥反應的報道。

他克莫司吸收的個體差異較大,廣泛分布于各組織中,入血后大部分通過膽汁排泄,對肝功能不全的患者需調整劑量。同時,他克莫司與其他免疫抑制劑一樣存在毒副作用:可引起腎功能損傷、高血壓、高血糖、白細胞增多及高鉀低鎂血癥;腎毒性、神經毒性和消化道副作用較明顯。他克莫司的副作用與給藥途徑相關,靜脈給藥的副作用大于口服,文獻報道中動物實驗結果表明,眼局部給藥可明顯減少全身用藥時的副作用。目前他克莫司用于角膜移植免疫排斥反應的臨床使用方式有兩種:全身用藥和局部用藥。其中,全身用藥包括腹腔內注射和肌肉注射。

目前我國尚無上市的他克莫司眼用制劑,據文獻“中國醫院藥學雜志?2005,14(11):715-716”報道了他克莫司滴眼液的制備及臨床應用,其他克莫司滴眼液由他克莫司、羥丙甲纖維素、氯化鈉和硫柳汞等組成,在文獻“中國醫院藥學雜志?2009,29(22)1951-1952”?報道了他克莫司滴眼液的質量控制及穩定性考察,這類滴眼液穩定性很差,經典恒溫加速試驗預測儲存有效期結果表明,他克莫司滴眼液在25°C的有效期僅為46.69天,在4°C貯存的有效期約為2.55年。由文獻報道結果可知,他克莫司水溶液穩定性較差,不利于產品的運輸和貯存。另外,滴眼液用于局部滴眼時,易被快速清除,并且由于他克莫司具有分子量大和不溶于水的理化特點,使其局部應用時的眼內吸收差,不能產生有效的眼內藥物濃度。

隨著新劑型新技術的研究,文獻報道他克莫司眼用新劑型有脂質體、環糊精包合物、納米粒和緩釋膠原藥膜等。他克莫司脂質體制劑的主要缺點是滅菌消毒困難,制備復雜且成本較高,易氧化產生毒性,所以臨床應用較為困難;他克莫司環糊精包合物滴眼液用于眼部局部給藥后,眼表藥物易被快速清除,藥物難維持較長時間藥效;他克莫司納米粒制劑可以延長藥物在角膜的滯留時間并且提高藥物進入角膜濃度,但是納米粒制劑在制備過程中易帶入有機溶劑,殘留溶劑不被臨床所接受;他克莫司緩釋膠原藥膜是外型類似角膜接觸鏡的半透明柔軟的薄膜,由豬或牛鞏膜提取而成,其不易實現工業化生產,患者順應性差。

他克莫司的強疏水性和遇水不穩定的特點決定了它在局部眼用時存在的問題:遇水易于異構化,眼內通透性差,難于在眼內達到有效治療水平,使其生物利用度較低。因此,為克服上述問題研制和開發一種良好的他克莫司眼部局部應用的制劑:可以提高他克莫司的穩定性,延長藥物作用時間;有效增強藥物在眼角膜移植術后治療和預防免疫排斥反應的療效,減少眼睛局部用藥的刺激性、并且避免他克莫司全身應用的毒副作用;易于實現工業化大生產,具有較強實用性。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于眼角膜移植的眼局部用藥制劑及提供其制備方法。

為達到本發明的目的,采用的技術方案是提供一種眼角膜移植的他克莫司眼用劑,它是將他克莫司制成眼用前體囊泡劑,前體囊泡劑是由下列質量百分比的原料組成,

他克莫司??????0.04~0.8%

表面活性劑????24.0~41.0%

膽固醇????????1.6~8.0%

卵磷脂????????24.0~41.0%

醇????????????1.2~30%

其余為水或體積百分濃度為0.1%的甘油水溶液或PH7.4的磷酸緩沖液,

所說的表面活性劑是為司盤20、司盤40、司盤60、司盤80、吐溫20、吐溫60、吐溫80、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一種,

所說的醇為乙醇、異丙醇、丁醇、丙醇中的一種。

為達到本發明的另一目的,本發明所提供的眼角膜移植的他克莫司眼用劑的制備方法是:

(1)按下列質量百分比的原料配備

他克莫司??????0.04~0.8%

表面活性劑????24.0~41.0%

膽固醇????????1.6~8.0%

卵磷脂????????24.0~41.0%

醇????????????1.2~30%

其余為水或體積百分濃度為0.1%的甘油水溶液或PH7.4的磷酸緩沖液,

所說的表面活性劑是為司盤20、司盤40、司盤60、司盤80、吐溫20、吐溫60、吐溫80、聚氧乙烯醚蓖麻油、泊洛沙姆中的一種,

所說的醇為乙醇、異丙醇、丁醇、丙醇中的一種;

(2)稱取表面活性劑、醇、卵磷脂、膽固醇、他克莫司于容器中,攪拌下加熱至65±5°C,攪拌均勻至各組分完全溶解,呈均一透明狀,作為溶液1;

(3)攪拌下向溶液1中滴加水或體積百分濃度為0.1%的甘油水溶液或PH7.4的磷酸緩沖液,在65°±5°C下繼續攪拌加熱至溶液混合均勻,將混合液取出繼續攪拌至室溫,呈黏稠凝膠態即得他克莫司前體囊泡劑。

依照中國藥典2010版緩沖液項下規定配制PH7.4的磷酸緩沖液,配制方法為:甲液:取無水磷酸二氫鈉8g,加水溶解,并稀釋至1000ml。乙液:取無水磷酸氫二鈉9.47g,加水溶解,并稀釋至1000ml。取上述甲液6ml與乙液400ul混合,搖勻,即得。

成品制劑可另配有瓶裝的生理鹽水,根據成品制劑的不同規格,分別分裝至5ml、10ml、20ml滴眼液塑料瓶中,病人使用前將瓶裝生理鹽水全部加入他克莫司前體囊泡制劑中,振搖使前體囊泡制劑充分遇水水化為囊泡,最終為含他克莫司0.01%~1%囊泡滴眼液。

本發明采用安全、無刺激性的表面活性劑作為主要組分,適合應用到眼部敏感部位,具有無刺激性、生物相容性好、長期使用無毒副作用等優點。他克莫司作為高疏水性的大環內酯類藥物,遇水會不穩定,易于異構化。本發明將他克莫司制備成眼用前體囊泡制劑,制劑體系含限量的水,既增強了藥物在載體中的溶解度,又避免藥物遇見水快速異構化。前體囊泡制劑外觀呈現凝膠態,使用前加生理鹽水振搖即能迅速自組裝成囊泡而將藥物包載起來,囊泡滴眼液滴入眼睛具有增強治療,刺激性小的特性。該體系是一種有效的眼用新劑型,有廣闊的開發前景。

本發明的優點:

1、囊泡劑是繼脂質體之后具有更多優良特性的藥物載體,不僅可以增加藥物的角膜通透性,而且能起到緩釋、靶向、降低毒性等作用,在眼部給藥系統中顯示出了良好的開發潛能。前體囊泡劑具有限量的水分,提高了制劑貯存穩定性,為難溶性藥物及穩定性差的藥物研究提供了新的思路。2、本發明的產品將前體囊泡劑的優點、眼部給藥系統的特點及他克莫司藥物的主治病癥有機結合,達到提高療效的目的,降低毒性,減少副作用,給藥方便、非侵入性、無痛等特點,可提高患者的順應性;3、制備工藝簡便,適合工業化生產。

下面通過實施例進一步闡述本發明的技術方案和進步。

制備得到的前體囊泡制劑穩定性好,遇水水化后得到的囊泡平均粒徑約為1um,制備工藝簡單,重復性好。該體系具有相當好的熱力學穩定性,不僅適合于實驗室研究,更易于實現工業化大生產。總之,該囊泡體系適合于他克莫司等難溶性藥物的傳遞及載體應用。

具體實施方式

下面提供了本發明制劑有代表性的實施例,這些實施例僅僅用于說明本發明,而不對保護范圍造成限制。

實施例1??他克莫司眼用前體囊泡劑的制備

制備工藝:

稱取吐溫-80?24.3g、乙醇?27g、大豆卵磷脂?24.3g、膽固醇?2.7g,在水浴65±5°C加熱并不斷攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,在磁力攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥0.08g?,繼續在65±5°C下攪拌至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;磁力攪拌下向溶液1中逐滴加入注射用水21.62g,65±5°C繼續加熱攪拌至溶液混合均勻,將混合液從水浴中取出并磁力攪拌至其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得100g他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2.5g、6.25g、12.5g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得含他克莫司藥量為0.1%的囊泡劑,可直接用于滴眼。

實施例2??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備:

制備工藝:?

稱取司盤-80、乙醇、大豆卵磷脂、膽固醇,在水浴65±5°C加熱并不斷攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥,繼續在65±5°C下攪拌至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中逐滴加入注射用水,65±5°C繼續加熱攪拌至溶液混合均勻,將混合液從水浴中取出并攪拌至其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得224g他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2g、5g、10g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量為0.5%,可直接用于滴眼。

實施例3??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備

制備工藝:?

稱取泊洛沙姆-188、乙醇、蛋黃卵磷脂、膽固醇,在水浴65±5°C加熱并不斷攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,在攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥0.5g?,繼續在65±5°C下攪拌至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中逐滴加入0.1%甘油水溶液,65±5°C繼續加熱攪拌至溶液混合均勻,攪拌下讓其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得100g他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2g、5g、10g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量為0.5%,可直接用于滴眼。

實施例4??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備

制備工藝:?

稱取司盤60、乙醇、蛋黃卵磷脂、膽固醇,在水浴65±5°C加熱并攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,向混合液中加入他克莫司原料藥0.4g?,繼續在65±5°C下攪拌至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中逐滴加入PH7.4磷酸鹽緩沖溶液15g,至溶液混合均勻,攪拌下讓其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得100g他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡劑自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2.5g、6.25g、12.5g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量為0.5%,可直接用于滴眼。

實施例5??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備

稱取如下原料:

制備工藝:?

稱取聚氧乙烯醚蓖麻油、乙醇、卵磷脂、膽固醇,在水浴65±5°C加熱并攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥0.5g?,至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中逐滴加入純水3.5g,繼續加熱攪拌至溶液混合均勻,攪拌下讓其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得100g他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2g、5g、10g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量為0.5%,可直接用于滴眼。

實施例6??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備

制備工藝:?

稱取泊洛沙姆407、乙醇、卵磷脂、膽固醇,在水浴65±5°C加熱并不斷攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,在攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥,繼續攪拌至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中逐滴加入PH7.4的磷酸鹽緩沖溶液,繼續加熱攪拌至溶液混合均勻,然后攪拌下讓其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2.5g、6.25g、12.5g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量為1%,可直接用于滴眼。

?實施例7??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備

稱取吐溫20、乙醇、卵磷脂、膽固醇于容器中,水浴65±5°C下加熱并不斷攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,在攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥0.08g,攪拌至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中逐滴加入體積百分濃度為0.1%的甘油水溶液,繼續加熱攪拌至溶液混合均勻后讓其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2.5g、6.25g、12.5g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量0.01%,可直接用于滴眼。

實施例8??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備

稱取如下原料:

稱取司盤40、乙醇、大豆卵磷脂、膽固醇,水浴加熱并攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,在攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥,至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中逐滴加入體積百分濃度為0.1%的甘油水溶液,繼續加熱攪拌至溶液混合均勻,并攪拌至其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2.5g、6.25g、12.5g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量為0.1%,可直接用于滴眼。

實施例9??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備

稱取吐溫60、乙醇、大豆卵磷脂、膽固醇于容器,水浴65±5°C加熱并攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥,繼續攪拌至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中逐滴加入純水,加熱攪拌至溶液混合均勻,并讓其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2.5g、6.25g、12.5g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量為0.1%,可直接用于滴眼。

實施例10??他克莫司眼用前體囊泡制劑的制備

稱取泊洛沙姆188、乙醇、大豆卵磷脂、膽固醇于容器,水浴65±5°C下加熱并不斷攪拌至各組分完全溶解呈均一透明狀,在攪拌下向混合液中加入他克莫司原料藥0.08g,繼續在65±5°C下攪拌至藥物完全溶解在混合液中,作為溶液1;攪拌下向溶液1中滴加PH7.4的磷酸鹽緩沖液12g,繼續加熱攪拌至溶液混合均勻,并讓其溫度降至室溫,混合物呈黏稠凝膠態即得他克莫司前體囊泡劑。

將他克莫司前體囊泡自動灌裝至5ml、10ml、20ml滴眼瓶中,三種規格,裝量分別為2.5g、6.25g、12.5g,臨床使用時隨成品制劑另分別附2ml、5ml和10ml注射用生理鹽水,臨用前將生理鹽水加入他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使其完全水化即得他克莫司囊泡液,含藥量為0.1%,可直接用于滴眼。

下面用試驗例來說明本發明的前體囊泡劑的有益效果

試驗例1他克莫司前體囊泡理化性狀研究

取本發明前體囊泡劑實施例3的產品?0.2g,加入10ml生理鹽水進行稀釋振搖即可得到他克莫司囊泡,超聲3min后取100ul稀釋至1ml,Malven粒徑儀對囊泡粒徑進行測定。經過測定,前體囊泡水化后形成囊泡的粒徑在1um左右。

表1???????????他克莫司囊泡理化性狀

?

試驗例2他克莫司前體囊泡粘度測定實驗

制備得到的前體囊泡制劑為粘稠凝膠狀液體,采用旋轉式流變儀評價樣品的流變學性質,取本發明實施例3產品進行試驗,考察溫度25°C下,不同剪切速度對凝膠粘度的影響。

表2??????????他克莫司前體囊泡凝膠態粘度測量

從流變學實驗結果可知,他克莫司前體囊泡制劑在室溫條件下,其粘度隨剪切速率的增大而減小,具有剪切變稀的性質,呈現出假塑性流體行為。

試驗例3本發明的前體囊泡制劑對家兔眼部的刺激性實驗

實驗目的:觀察動物眼睛接觸他克莫司前提囊泡制劑后所產生的刺激反應情況,為臨床安全用藥提供依據。

????實驗樣品:取本發明他克莫司前體囊泡劑實施例10的產品進行試驗。

實驗方法:以新西蘭兔為模型動物,根據《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》,用眼刺激性試驗法評價他克莫司眼用前體囊泡的粘膜刺激性。

健康新西蘭大白兔4只,無眼疾,雌雄各半。實驗前24小時內對每只動物的雙眼進行檢查,2%熒光素鈉溶液滴眼,裂隙燈檢查角膜的完整性。采用同體左右側自身對比法進行實驗,每只兔子右眼涂敷0.1g前體囊泡劑,左眼滴入生理鹽水0.1ml作為空白對照,給藥后輕合眼瞼10s,使制劑與眼睛局部有充分接觸。給動物連續給藥21天,每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48、72小時對眼部進行檢查,檢查儀器為裂隙燈顯微鏡。觀察眼睛的局部反應情況,按表1的眼部刺激反應評分標準對角膜、虹膜及結膜分別進行評分。將每一個觀察時間每一動物的眼角膜、虹膜和結膜的刺激反應分值相加得總積分,將一組的積分總和除以動物數,即得該受試動物對眼刺激性的最后分值。然后按表2的評價標準,判斷制劑是否具有刺激性。

表3????????????眼刺激反應分值標準

表4???????????????眼刺激性評價標準

實驗結果:

觀察各組兔眼給藥后的狀況進行評分,統計評分結果后進行計算分析。各實驗時間點兔刺激性分值見表5。

表5??????他克莫司前體囊泡長期給藥對兔眼刺激評分結果(n=4)

刺激性實驗評分結果表明,他克莫司眼用前體囊泡制劑長期給藥后,經評分標準判定兔給藥眼與對照眼刺激反應積分差異不大,各兔各時間點刺激反應積分均<3,結果表明他克莫司前體囊泡對眼睛沒有刺激性。

試驗例4他克莫司前體囊泡對大鼠眼角膜移植排斥反應的藥效學實驗:

實驗目的:建立大鼠眼角膜移植模型,探究他克莫司前體囊泡水化后囊泡滴眼液對角膜移植后免疫排斥反應的藥效作用。

實驗樣品:取本發明他克莫司前體囊泡劑實施例10中含藥量0.1%他克莫司囊泡液;1%環孢素滴眼液(中山大學中山眼科中心制劑室,規格:10ml:0.1g);0.1%他克莫司滴眼液(中山大學中山眼科中心制劑室,規格:10ml:10mg)。

實驗方法:

本發明建立了SD與Wistar大鼠異種異體穿透性眼角膜移植動物模型,將他克莫司前體囊泡經水化后的囊泡滴眼液用于大鼠角膜移植模型中,探究其對角膜移植術后免疫排斥反應的抑制作用。據文獻報道,他克莫司用于滴眼等局部給藥方式時,所含藥物濃度有0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1%,并且他克莫司的治療效果隨藥物濃度升高而逐漸增強。本試驗選用于滴眼的囊泡滴眼液載藥量為0.1%,給藥4次/日,滴入劑量為20ul/次。本試驗選擇1%環孢素滴眼液和0.1%他克莫司滴眼液為陽性對照藥,生理鹽水為空白對照組,給藥4次/日,滴入劑量為20ul/次,觀察前體囊泡經水化后囊泡眼用的療效。

穿透性角膜移植模型的建立:術前10min注射過量氯胺酮處死供體Wistar鼠,以直徑3.25mm環鉆鉆取供眼中央角膜植片,置于1%透明質酸鈉中備用。

受體SD大鼠均選擇右眼為術眼,術前3天術眼滴用妥布霉素滴眼液,每日4次。術前裂隙燈檢查術眼情況。肌肉注射水合氯醛進行全身麻醉,術前15min起點匹羅卡品滴眼液。常規消毒鋪巾,無菌操作。

在手術顯微鏡下取3.25mm角膜中央全層植片立即植入3.0mm角膜中央穿透性植床,用10-0進口尼龍線間斷縫合8針,線結不埋藏。術畢前房內注入少量粘彈劑(1%透明質酸鈉),形成前房,眼內均勻涂抹妥布霉素眼膏,瞼緣縫合。術后第1天拆除瞼緣縫線,術后3天局部常規應用妥布霉素滴眼液每日4次,3d后根據分組應用不同滴眼液。

試驗動物分組及給藥:角膜移植術后第3天,排除由于手術因素造成的感染、前房出血、前房消失或術后發生虹膜嵌頓、前房積血及晶體渾濁眼,并及時補充動物。隨機分為五組,每組7只。A組:生理鹽水組(陰性對照);B組:環孢素A組;C組:自制制劑組(實驗組);D組:自制空白載體組;E組:他克莫司0.1%滴眼液組。各組給藥均從術后第三天開始,每日4次,每次100ul,直至排斥反應發生。

觀察方法及指標:術后第1天起,每天在裂隙燈下觀察角膜植片的情況,對渾濁、水腫及新生血管三項指標進行評分。三項評分之和為當日排斥反應指數(rejection?index,RI)。當RI》6時,視為免疫排斥反應發生,角膜植片評分參照Holland的評分標準,記錄角膜植片存活時間。

表6???????????????Holland’s分級:

統計學處理:?采用SPSS?statistics?19統計軟件包進行單因素方差分析和LSD-t統計學檢驗,P<0.05為有統計學意義。

試驗結果:對各組角膜植片存活時間及統計學分析見表7。從角膜植片存活時間統計分析可知,他克莫司囊泡組與生理鹽水組比較,角膜植片存活時間延長,統計學分析有差異性,同時,他克莫司囊泡組與市售環孢素滴眼液組相比,角膜植片存活時間有統計學差異。結果表明他克莫司前體囊泡經水化形成載藥0.1%囊泡后給藥能顯著抑制大鼠角膜移植的免疫排斥反應。

表7?????各組大鼠角膜植片存活時間

?注:*與生理鹽水組相比,P<0.05

對各組大鼠角膜移植后角膜植片混濁、水腫、新生血管觀察狀況進行評分,對觀察期內每天的評分分數進行綜合分析處理,觀察結果如表8-表10所示。

表8????角膜移植后觀察期內角膜透明度各天評分

表9??角膜移植后觀察期內角膜水腫各天評分

表10??角膜移植后觀察期內角膜新生血管各天評分

從各組角膜植片存活時間統計表及移植后觀察期內植片的透明度、水腫和新生血管的觀察結果可知,與空白對照組和生理鹽水組相比,0.1%他克莫司囊泡組都顯示出了良好的治療效果,延長角膜植片的存活時間,起到良好的藥效作用。根據文獻報道以及處方篩選結果可知,他克莫司載藥量為0.01%~1%時,用于局部滴眼都能表現出明顯的免疫抑制作用,并且隨濃度增高藥效逐漸增強。

試驗例5?制劑穩定性研究

實驗目的:考察原料藥或藥物制劑在溫度、濕度、光線的影響下隨時間變化的規律,為藥品的生產、包裝、貯存、運輸條件提供科學依據,同時通過試驗建立藥品的有效期。

實驗樣品:取本發明他克莫司前體囊泡劑實施例3產品;實施例3中他克莫司前體囊泡劑經水化后囊泡劑,各自分別取3批進行實驗。

實驗方法:影響因素試驗用一批制劑進行,平行做3份。取他克莫司前體囊泡,將樣品敞口置于所處環境中。考察其在高溫、高濕和強光條件下,前體囊泡制劑性狀變化,加生理鹽水稀釋成囊泡后主藥他克莫司含量的變化,以及有關物質的生成情況。實驗設置對照組為他克莫司囊泡組,即將制劑所配的水相加入到他克莫司前體囊泡滴眼液瓶中,振搖使他克莫司前體囊泡完全水化為囊泡后,按影響因素條件要求進行實驗。

高溫試驗:分別將供試品他克莫司前體囊泡和他克莫司囊泡開口置于西林瓶中,分別在60°C和40°C溫度下放置10天,于第5天和第10天取樣,按穩定性重點考察項目進行檢測。

高濕試驗:分別將他克莫司前體囊泡和他克莫司囊泡供試品置于恒濕密閉容器中,在25°C分別于相對濕度90%±5%條件下放置10天,于第5天和第10天取樣,按穩定性重點考察項下項目要求檢測,同時準確稱量試驗前后供試品的重量,以考察供試品的吸濕潮解性能。

強光照射試驗:分別將他克莫司前體囊泡和他克莫司囊泡放置于強光照射試驗箱中,于照度為4500lx±500lx的條件下放置10天,于第5天和第10天取樣,按穩定性重點考察項目進行檢測。

加速試驗:加速試驗是在超常條件下進行的,通過加快市售包裝中藥品的物理或化學變化速度來考察藥品穩定性,對藥品在運輸、保存過程中可能會遇到的短暫的超常條件下的穩定性進行模擬考察,并初步預測樣品在規定的貯存條件下的長期穩定性。前體囊泡的加速試驗選用的實驗條件如下:40°C±2°C、RH75%±5%條件下;25°C±2°C、RH60%±5%條件下;4°C±2°C、RH75%±5%條件下分別貯存,在試驗期間第0、1、2、3個月末取樣檢測考察指標,測定他克莫司前體囊泡的載藥量和包封率在貯存期間的變化。

試驗結果:

表11?????????他克莫司前體囊泡穩定性實驗研究結果(n=3)

?表12?????????他克莫司水化后囊泡的穩定性研究結果(n=3)

表13?????????他克莫司前體囊泡加速試驗研究結果(n=3)

從穩定性實驗結果可知,他克莫司前體囊泡制劑穩定性良好,在60°C高溫下放置10天,取出制劑加生理鹽水水化為囊泡后,載藥量和包封率與0天相比仍沒有顯著性變化,從液相圖譜可知藥物主峰分離良好,無大量有關物質的產生。而他克莫司囊泡組的影響因素結果表明,在4°C下保存時,第5天和第10天的載藥量無明顯變化;60°C和光照條件下保存時,第5天和第10天與第0天相比可見載藥量明顯降低,表明囊泡形式存在時,藥物需在4°C條件下儲存。穩定性結果表明,他克莫司前體囊泡系統含限量的水,限制了他克莫司藥物在制劑中的異構化,與他克莫司囊泡組相比,增強了藥物儲存穩定性。

從加速實驗結果可知,他克莫司前體囊泡在40°C加速條件下保存3個月,載藥量和包封率與第0天相比仍無明顯降低,與文獻報道他克莫司滴眼液穩定性相比,他克莫司前體囊泡劑穩定性更好,在室溫下避光能長期保存。

試驗例6他克莫司前體囊泡體外釋放研究

實驗目的:與市售他克莫司軟膏進行對比,考察他克莫司前體囊泡的體外透角膜特性,?并且比較二者角膜滯留量的差異。

實驗樣品:本發明他克莫司前體囊泡劑實施例10中產品;市售他克莫司0.1%軟膏(美國?Fujisawa?Healthcare,Inc.,規格?10g:10mg)。

實驗方法:

按處方劑量制備他克莫司前體囊泡,使用前加生理鹽水振搖使其水化成囊泡,囊泡含藥量為0.1%。

試驗方法:使用Franz透皮擴散儀進行滲透實驗,水浴溫度為34°C,離體兔眼角膜固定于供給室與接收室之間,有效透過面積為50.24mm2,接收液為25%乙醇/人工淚液,接收室體積為5ml。分別將含藥量0.1%軟膏0.1g與載藥0.1%囊泡100ul置于供給池中離體兔眼角膜一側,開啟透皮擴散儀電動磁力攪拌器以250rpm/min的速度攪拌,分別于0.5h、1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h取接收液1ml,過濾后進HPLC進行含量測定,同時補充等量空白接收液于接收池中。體外透角膜試驗終止后,從擴散池中取出兔眼角膜,用水洗滌表面,棉花擦干,剪碎,加甲醇2ml勻漿,離心10?min,取上清液,用0.22?μm濾膜過濾,取續濾液,采用高效液相色譜法測定角膜中他克莫司的滯留量(Qm)。

試驗結果:體外釋放實驗中24h內,他克莫司前體囊泡在角膜中的累積透過百分量為(68.56±0.10)%;他克莫司軟膏在角膜中的累積透過百分量為(41.41±0.07)%。每個時間點他克莫司囊泡的累積透過量均比他克莫司軟膏高,經t檢驗,24h兩者的數據有x統計學差異,P<0.05,體外累積釋放實驗說明他克莫司囊泡更有利于藥物透過角膜,提高治療作用。體外釋放24h角膜滯留量結果,他克莫司囊泡的滯留量高于軟膏,二者數據有統計學差異,?P<0.05,角膜滯留量結果表明,他克莫司囊泡能提高藥物在角膜滯留量,延長藥物作用時間,提高治療效果。

表14??????他克莫司前體囊泡、軟膏各時間點累積釋放度(%)

表15?他克莫司前體囊泡、軟膏體外實驗角膜累積滯留量結果

?

*??P<0.05

結論:他克莫司前體囊泡及軟膏的體外透角膜試驗表明,他克莫司囊泡更有利于藥物透過角膜,提高治療作用;角膜滯留量結果表明,他克莫司囊泡能提高藥物在角膜滯留量,延長藥物作用時間,提高治療效果。

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