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一種高蟲草素含量北冬蟲夏草膠囊的制備方法.pdf

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一種 蟲草 含量 冬蟲夏草 膠囊 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201210035541.9

申請日:

20120216

公開號:

CN103251034A

公開日:

20130821

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A23L1/28,A23L1/29,A01G1/04,C05G1/00 主分類號: A23L1/28,A23L1/29,A01G1/04,C05G1/00
申請人: 上海高博特生物保健品有限公司
發明人: 張剛,范培萍,費翅鯤,黃克文,范連花,沈珍芳,許瑨
地址: 201619 上海市松江區中山街道花橋村
優先權: CN201210035541A
專利代理機構: 上海新天專利代理有限公司 代理人: 王巍
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210035541.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種高蟲草素含量北蟲草膠囊的制備方法。本發明方法采用篩選的菌株北冬蟲夏草菌株CGMCC?NO.1823蛹蟲草擬青霉Cordyceps?militaris進行優化培養,經菌種制備、培養、采收、風干、粉碎、膠囊灌裝等步驟,制備高蟲草素含量的北冬蟲夏草膠囊,經檢測產品北冬蟲夏草中的蟲草素含量達到1.4%-1.7%,本發明方法簡單,適于規模型的工業化生產。

權利要求書

1.一種高蟲草素含量北蟲草膠囊的制備方法,其特征在于,該方法包括下列步驟:(1)菌種制備:從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草母種,蛹蟲草擬青霉Cordyceps?militaris,CGMCC?NO.1823接入改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中,18℃-25℃,避光培養10-12天,再接入改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中進行培養,18℃-25℃,搖床培養5天,培養好的北冬蟲夏草菌液原種液于溫度4-10℃儲存,備用;(2)配料裝瓶培養瓶體積為255ml,每個培養瓶中加入大米20-30g,水24-40ml,混勻后上蓋,準備滅菌;(3)滅菌將培養瓶排列整齊放入滅菌鍋內,在121℃下,高壓蒸汽滅菌20-30分鐘,冷卻后,取出,準備接種;(4)接種將步驟(1)培養的北冬蟲夏草菌液原種液,按每個滅菌后的培養瓶中加入2.5ml的原種液進行接種;(5)培養接種后的北冬蟲夏草培養瓶,移至培養架中,控制培養溫度18℃-25℃,濕度控制在65%-95%,每天光照9小時,光照強度為1500lx-3500lx,每天通風1-3小時,培養45-60天;?(6)采收將培養成熟的北冬蟲夏草,長度為6-10cm,直徑為0.2-0.4cm進行采收,擺放在采收盤;(7)風干將北冬蟲夏草采收盤置于風干架上,保持室內溫度40-48℃,20-24小時,測北冬蟲夏草子實體水分<12%;(8)粉碎風干后的北冬蟲夏草粉碎至80目;(9)膠囊充填粉碎后的北冬蟲草粉充填入膠囊。2.根據權利要求1所述的一種高蟲草素含量北蟲草膠囊的制備方法,其特征在于,所述步驟(1)改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基配方,每1000ml:土豆190-210g??蔗糖19-21g??瓊脂19-21g加水至1000ml;原種培養基配方,每1000ml:土豆190-210g??蔗糖9-11g??蛋白胨0.9-1.1g??胡蘿卜9-11g洋蔥9-11g??蘑菇9-11g??雞蛋4-6g??明礬0.04-0.06g??碳酸氫鈉0.9-1.1g加水至1000ml。3.根據權利要求1所述的一種高蟲草素含量北蟲草膠囊的制備方法,其特征在于,所述制得的的北冬蟲草膠囊中北冬蟲夏草的蟲草素含量為1.4%-1.7%。?4.一種用于權利要求1所述高蟲草素含量北蟲草膠囊制備方法的北冬蟲夏草菌株,其特征在于,所述菌株為蛹蟲草擬青霉Cordyceps?militaris,保藏號CGMCC?NO.1823。5.根據權利要求4所述的北冬蟲夏草菌株,其特征在于,所述菌株通過下列方法制備:(1)野生北冬蟲夏草先用野生北冬蟲夏草8-10倍量W/W?75%酒精清洗,再用1%HgCl溶液以完全浸沒樣品為準,浸泡2min,然后用野生北冬蟲夏草8-10倍量W/W無菌水分4次洗,每次2-2.5倍量W/W;(2)菌種培養:清洗干凈的野生北冬蟲夏草進行蛹蟲草孢子分離:野生北冬蟲夏草用改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板培養,形成分生孢子,再挑取分生孢子用10-20ml無菌水制成孢子菌懸液;將該孢子菌懸液,再接種至改良PDA培養基中進行第二次培養,分離得到純的菌株北冬蟲夏草菌株CGMCC?NO.1823。6.根據權利要求5所述的北冬蟲夏草菌株,其特征在于,所述步驟(2)的每次菌種培養條件:(1)改良PDA培養基配方:每1000ml:土豆190-210g??蔗糖19-21g??瓊脂19-21g加水補足1000ml;(2)避光,溫度18℃-25℃,培養10-12天。?

說明書

技術領域

本發明涉及保健食品。具體涉及一種高蟲草素含量北冬蟲夏草膠囊的制備方法。

背景技術

冬蟲夏草為珍貴中草藥,其主要成分為:蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖以及抗衰老、抗惡性腫瘤的活性物質等,具有滋肺補腎、益精定喘、擴展血管、降低血壓、抗病毒等多種功效。因而,冬蟲夏草的需求量不斷增加,但是,有限的天然資源,日趨枯竭,人工栽培也不易成功。因此,這是亟待解決的問題。

蛹蟲草,又稱北蟲草、北冬蟲夏草。經檢測,蛹蟲草的藥用成分及含量和藥用價值可與冬蟲夏草媲美,其中蟲草素含量為冬蟲夏草的3-5倍,其它主要成分的含量多數高于或相當于冬蟲夏草。蛹蟲草可以人工栽培,培養基的原料主要為大米。本發明通過對蛹蟲草菌株的篩選,得到蛹蟲草COB201,其蟲草素含量平均為1.4%,最高可達1.7%。目前,現在的北冬蟲夏草菌株蟲草素含量為0.5-0.7%,天然蟲草中蟲草素含量約為0.2%。而將北冬蟲夏草經低溫風干后進行粉碎,再將蟲草粉充填膠囊,能最大限度保持北冬蟲夏草中的活性成分,而膠囊產品有利于保存、服用和攜帶。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于研究設計高蟲草素含量北冬蟲夏草膠囊的制備方法。

本發明提供了一種高蟲草素含量北蟲草膠囊的制備方法。

本發明方法包括下列步驟:

(1)菌種制備:從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草母種,蛹蟲草擬青霉Cordyceps?militaris,CGMCC?NO.1823接入改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(改良PDA培養基)中,18℃-25℃,避光培養10-12天,再接入原種培養基中進行培養,18℃-25℃,搖床培養5天,培養好的北冬蟲夏草菌液于溫度4-10℃儲存,備用;

所述改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基配方,每1000ml:

土豆190-210g???????蔗糖19-21g????????瓊脂19-21g

加水補足1000ml;

原種培養基配方,每1000ml:

土豆190-210g??蔗糖9-11g??蛋白胨0.9-1.1g??胡蘿卜9-11g洋蔥9-11g??蘑菇9-11g??雞蛋4-6g??明礬0.04-0.06g??碳酸氫鈉0.9-1.1g

加水補足1000ml;

(2)配料裝瓶

培養瓶體積為255ml,每個培養瓶中加入大米20-30g,水24-40ml,混勻后上蓋,準備滅菌;

(3)滅菌

將培養瓶排列整齊放入滅菌鍋內,在121℃下,高壓蒸汽滅菌20-30分鐘,冷卻后,取出,準備接種;

(4)接種

將步驟(1)培養的北冬蟲夏草菌液原種液,按每個滅菌后的培養瓶中加入2.5ml的原種液進行接種;

(5)培養

接種后的北冬蟲夏草培養瓶,移至培養架中,控制培養溫度18℃-25℃,濕度控制在65%-95%,每天光照9小時,光照強度為1500lx-3500lx,每天通風1-3小時,培養45-60天;

(6)采收

將培養成熟的北冬蟲夏草進行采收,擺放在采收盤;

所述北冬蟲夏草的成熟標準:色澤:黃色或橙黃色;組織形態:長圓柱狀,表面粗糙,頭部呈棒狀,長度為6-10cm,直徑為0.2-0.4cm;

(7)風干

將北冬蟲夏草采收盤置于風干架上,保持室內溫度40-48℃,20-24小時,測北冬蟲夏草子實體水分<12%;

(8)粉碎

風干后的北冬蟲夏草粉碎至80目;

(9)膠囊充填

粉碎后的北冬蟲草粉充填入膠囊,包裝。

本發明的另一目的是提供了用于上述制備的一種北冬蟲夏草菌株(本申請人的菌種編號COB201),該菌株為蛹蟲草擬青霉Cordyceps?militaris,保藏號CGMCC?NO.1823。

本發明人通過長期研究和實驗,篩選到該菌株,經中國科學院微生物研究所進行菌種鑒定和毒理試驗,鑒定為蟲草屬菌種,蛹蟲草(蛹蟲草擬青霉)Cordyceps?militaris。已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。(地址:中國北京海淀區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所,郵編:100080)

(保藏日期:2006年9月22日,附保藏中心受理通知書及存活性報告書)能用于工業化生產制備

本發明所述北冬蟲夏草菌株CGMCC?NO.1823蛹蟲草擬青霉Cordyceps?militaris通過下列方法制備:

(1)野生北冬蟲夏草(采集自中國沈陽棋盤山)先用野生北冬蟲夏草8-10倍量W/W?75%酒精清洗,再用1%HgCl2溶液(以完全浸沒樣品為準)浸泡2min,然后用野生北冬蟲夏草8-10倍量W/W無菌水分4次洗,每次2-2.5倍量W/W;

(2)菌種培養:清洗干凈的野生北冬蟲夏草進行蛹蟲草孢子分離:野生北冬蟲夏草用改良PDA培養基(改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)平板培養,形成分生孢子,再挑取分生孢子用10-20ml無菌水制成孢子菌懸液;將該孢子菌懸液,再接種至改良PDA培養基中進行第二次培養,分離得到純的菌株北冬蟲夏草菌株CGMCC?NO.1823。

所述步驟(2)的菌種培養條件(每次):

改良PDA培養基配方,每1000ml:

土豆190-210g??蔗糖19-21g??瓊脂19-21g

加水補足1000ml;

避光,溫度18℃-25℃,培養10-12天。

本發明方法采用篩選的菌株北冬蟲夏草菌株CGMCC?NO.1823蛹蟲草擬青霉Cordyceps?militaris進行優化培養,制得高蟲草素含量的北冬蟲夏草膠囊,經檢測產品北冬蟲夏草中的蟲草素含量達到1.4%-1.7%,(現有的其他人工培養的北冬蟲夏草蟲中的草素含量小于1%,約為0.53%-0.9%)。本發明方法簡單,適于規模型的工業化生產。

具體實施方式

實施例1北冬蟲夏草CGMCC?NO.1823菌液制備

(1)篩選:野生北冬蟲夏草(采集自中國沈陽棋盤山)(10克)先用100ml75%酒精清洗,再用1%HgCl2溶液(以完全浸沒樣品為準)浸泡2min,然后用無菌水洗4次,(每次用量25ml)。清洗干凈的野生北冬蟲夏草(5克)進行蛹蟲草孢子分離,用改良PDA培養基平板培養10-12天,避光,溫度19℃,形成大量的分生孢子。挑取分生孢子,用無菌水(20ml)制成孢子菌懸液。將孢子菌懸液(0.2ml),接種至改良PDA培養基中(10ml)平板培養10-12天,避光,溫度19℃,分離得到純的北冬蟲夏草菌株。經中國科學院微生物研究所進行菌種鑒定和毒理試驗,鑒定為蟲草屬菌種,蛹蟲草(蛹蟲草擬青霉)Cordyceps?militaris。已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏號CGMCC?NO.1823。

(2)北冬蟲夏草CGMCC?NO.1823菌液制備

上述從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草,蛹蟲草擬青霉Cordyceps?militaris,CGMCC?NO.1823接入改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(改良PDA培養基10-15ml)中,19℃,避光培養10天,再接入改良PDA培養基中進行培養,19℃,搖床培養5天,培養好的北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823菌液放入冰箱,溫度4-10℃儲存,備用。

改良PDA培養基配方,每1000ml:

土豆190-210g??蔗糖19-21g??瓊脂19-21g

加水補足1000ml。

實施例2

(1)菌種制備

(改良PDA培養基):

土豆190g

蔗糖21g

瓊脂20g

加水補足1000ml;

(原種培養基):

土豆200g

蔗糖10g

蛋白胨1.0g

胡蘿卜10g

洋蔥10g

蘑菇10g

雞蛋5g

明礬0.05g

碳酸氫鈉1.0g

加水補足1000ml

實施例1從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823菌液,(0.2ml)接入改良PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)培養基(10ml)中,20℃,避光培養11天,再接入原種培養基中(200ml)進行培養,20℃,搖床培養5天,即得到北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823原種液。培養好的北冬蟲夏草菌液于溫度4-10℃儲存,備用;

每個培養瓶(200ml)中加入大米20g,水34ml,混勻后上蓋,滅菌(將培養瓶排列整齊放入滅菌鍋內,在121℃下,高壓蒸汽滅菌20分鐘,冷卻后,取出,準備接種);按每個培養瓶中加入2.5ml的北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823原種液進行接種。接好種的培養瓶,移至培養架中,控制培養溫度18℃,濕度控制在65%,每天光照9小時,光照強度為1500lx,每天通風1小時以上。培養45天,待北冬蟲夏草成熟后(直徑3mm,長8cm),進行采收,再移入風干室保持室內溫度40℃,24小時進行風干,風干后的北蟲草進行粉碎過80目篩,然后充填進無色透明膠囊后裝瓶,進行檢驗和包裝成品。經檢測,蟲草素含量為1.7%。

實施例3

(改良PDA培養基):

土豆200g

蔗糖20g

瓊脂20g

加水補足1000ml;

(原種培養基):

土豆204g

蔗糖9g

蛋白胨1.0g

胡蘿卜9g

洋蔥9g

蘑菇9g

雞蛋5g

明礬0.05g

碳酸氫鈉1.0g

加水補足1000ml

實施例1從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823菌液(0.2ml),接入改良PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)培養基中(約10ml),20℃,避光培養11天,再接入原種培養基中(200ml)進行培養,21℃,搖床培養5天,即得到北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823菌液原種液,于溫度4-10℃儲存,備用。

每個培養瓶(200ml)中加入大米25g,水35ml,混勻后上蓋,滅菌(將培養瓶排列整齊放入滅菌鍋內,在121℃下,高壓蒸汽滅菌25分鐘,冷卻后,取出,準備接種);按每個培養瓶中加入2.5ml的北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823原種液進行接種。接好種的培養瓶,移至培養架中,控制培養溫度22℃,濕度控制在75%,每天光照9小時,光照強度為2000lx,每天通風1小時以上。培養50天,待北冬蟲夏草成熟后(直徑3mm,長8cm),進行采收,再移入風干室保持室內溫度45℃,22小時進行風干,風干后的北蟲草進行粉碎過80目篩,然后充填進無色透明膠囊后裝瓶,進行檢驗和包裝成品。經檢測,蟲草素含量為1.5%。

實施例4

(改良PDA培養基):

土豆190g

蔗糖21g

瓊脂20g

加水補足1000ml;

(原種培養基):

土豆196g

蔗糖11g

蛋白胨1.0g

胡蘿卜11g

洋蔥11g

蘑菇11g

雞蛋5g

明礬0.05g

碳酸氫鈉1.0g

加水補足1000ml

實施例1從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823菌液(0.2ml),接入改良PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)培養基中(10ml),25℃,避光培養12天,再接入原種培養基中(200ml)進行培養,22℃,搖床培養5天,即得到北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823原種液,于溫度4-10℃儲存,備用。

每個培養瓶(200ml)中加入大米24g,水32ml,混勻后上蓋,滅菌(將培養瓶排列整齊放入滅菌鍋內,在121℃下,高壓蒸汽滅菌30分鐘,冷卻后,取出,準備接種);按每個培養瓶中加入2.5ml的北冬蟲夏草菌液CGMCC?NO.1823原種液進行接種。接好種的培養瓶,移至培養架中,控制培養溫度25℃,濕度控制在85%,每天光照9小時,光照強度為3500lx,每天通風1小時以上。培養60天,待北冬蟲夏草成熟后(直徑3mm,長8cm),進行采收,再移入風干室保持室內溫度48℃,20小時進行風干,風干后的北蟲草進行粉碎過80目篩,然后充填進無色透明膠囊后裝瓶,進行檢驗和包裝成品。經檢測,蟲草素含量為1.4%。

實施例5

本發明產品的檢測結果

北冬蟲夏草中腺苷和蟲草素的檢測方法

(該方法參考孫月等蛹蟲草蟲草酸蟲草素含量測定與分析中國食用菌第18卷第6期第19頁1999年)

1.原理

蟲草素和腺苷的酸堿性不同以及結構差異,導致他們與柱內載體吸附能力的不同,同時利用緩沖溶液加大蟲草素和腺苷的洗脫時間差,從而達到分離的目的。腺苷在256nm處有最大吸收,蟲草素在此波長接近最大吸收,且吸收值與濃度呈線形關系。

2.試劑

2.1磷酸二氫鉀(分析純)、乙醇(優級純)、甲醇(優級純)、腺苷標準品、蟲草素標準品、雙蒸水

2.2溶液的配制

腺苷標準溶液的配制:精確稱取腺苷標準品0.0100g,加水溶解并定容到50ml,放置冰箱,備用。

蟲草素標準溶液的配制:精密稱取蟲草素標準4.2mg,加水溶解并定容到100ml,放置冰箱,備用。

0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液:稱取磷酸二氫鉀1.3609g,加雙蒸水溶解,定容至1000ml。

3.儀器

高效液相色譜儀、超聲波清洗器、離心機

4.分析步驟

4.1樣品溶液的制備

精密稱取100目蟲草粉0.2g,于50ml三角燒瓶中,加20ml提取液,超聲提取15分鐘,3000rpm離心5分鐘,殘渣重復操作一次,合并濾液,定容至50ml,再吸取5ml定容到100ml。

4.2色譜柱條件:

色譜柱:C18柱??4.6×150mm,5μm??柱溫:室溫

紫外檢測器:檢測波長256nm????????流動相:甲醇:0.01mol/L

磷酸二氫鉀溶液=10∶90

流速:1.0mL/min

4.3測定

4.3測定

取20μL標準溶液和試樣溶液注入色譜柱,以保留時間定性,以峰面積比較定量。

4.4標準曲線的制備

腺苷標準溶液:分別配制濃度為0.200、1.00、2.00、5.00、10.00μg/ml腺苷標準溶液,在給定的儀器條件下進行液相色譜分析,以峰面積對濃度做標準曲線。

蟲草素標準曲線:分別配制濃度為0.42、1.005、5.025、10.050、15.075μg/ml腺苷標準溶液,在給定的儀器條件下進行液相色譜分析,以峰面積對濃度做標準曲線。

5.結果計算A=峰面積/100

蟲草素%=(0.0017A+0.0142)*20*50/1000/(M*1000)*100

本發明實施例2、3、4得到高蟲草素含量的北冬蟲夏草,經檢測產品中蟲草素含量為1.7%、1.5%、1.4%。

實施例6

市售得到樣品:隆力奇北冬蟲夏草(江蘇隆力奇生物科技股份有限公司)

經用實施例5方法檢測,產品中蟲草素含量為1.1%。

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