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用于控制果園中蘋果蠹蛾的藥劑.pdf

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用于 控制 果園 蘋果蠹蛾 藥劑
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摘要
申請專利號:

CN200580034693.5

申請日:

20051011

公開號:

CN101072501A

公開日:

20071114

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A01N25/32,A01N31/02 主分類號: A01N25/32,A01N31/02
申請人: EFAL化學工業有限公司,耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司
發明人: O·索塞約夫,S·韋,I·弗盧克斯曼
地址: 以色列內坦亞
優先權: 60/617,679
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 程淼;劉玥
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200580034693.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種用于鑒定揮發性昆蟲驅逐劑和/或引誘劑的方法,所述昆蟲驅逐劑和/或引誘劑是通過β-葡糖苷酶對植物組織提取物的作用,從它們的非揮發性葡糖苷釋放的。通過該方法,將香葉醇鑒定為蘋果蠹蛾驅除劑,將水楊酸甲酯、(2R,5R)-茶螺烷和(2S,5R)-茶螺烷,以及在較低的程度上,將芳樟醇和苯甲醇鑒定為蘋果蠹蛾引誘劑。本發明提供了包含所述驅逐劑和引誘劑的組合物和控制果園,優選蘋果園中蘋果蠹蛾的方法。

權利要求書

1.包含香葉醇的組合物,其用作蘋果蠹蛾驅逐劑。2.根據權利要求1的組合物,其中將香葉醇與其它成分如橙花醇和香茅醇混合。3.根據權利要求2的組合物,其包含按重量計約50到高達約70%的香葉醇、按重量計0到高達約20%的橙花醇和按重量計約20到高達約40%的香茅醇。4.根據權利要求1到3任一項的組合物,其中香葉醇或者香葉醇混合物包含在聚合物基質中。5.根據權利要求1到4任一項的組合物,其為可噴霧的形式。6.根據權利要求1到4任一項的組合物,其作為濃縮物提供,用于在水中稀釋、分散或者溶解,以提供可噴霧的組合物。7.根據權利要求1到6任一項的組合物,其包含含有香葉醇或者香葉醇混合物的微膠囊。8.根據權利要求7的組合物,其用于香葉醇或者香葉醇混合物的緩慢釋放。9.驅逐蘋果蠹蛾的方法,其包括用包含香葉醇的蘋果蠹蛾驅逐組合物處理受到所述蘋果蠹蛾侵襲或者即將能夠被所述蘋果蠹蛾侵襲的環境。10.根據權利要求9的方法,其中所述組合物包含與其它成分如橙花醇和香茅醇形成的香葉醇混合物。11.根據權利要求9或10的方法,其中所述組合物是可噴霧的組合物,其包含含有香葉醇或者香葉醇混合物的微膠囊。12.根據權利要求9到11任一項的方法,其中所述環境是果園,包括梨、蘋果、柑橘、核桃、山楂和海棠果園。13.根據權利要求12的方法,其中所述果園是蘋果園。14.根據權利要求12或13的方法,其中所述組合物在所述果園中噴霧。15.驅逐蘋果園中的蘋果蠹蛾的方法,所述方法包括用香葉醇驅逐劑組合物處理蘋果園。16.用作蘋果蠹蛾引誘劑的組合物,其包含選自由水楊酸甲酯、茶螺烷異構體、芳樟醇、苯甲醇和其組合構成的組的活性劑。17.根據權利要求16的組合物,其中所述活性劑是水楊酸甲酯、(2R,5R)茶螺烷、(2S,5R)茶螺烷或者其組合。18.根據權利要求16或17的組合物,其中所述引誘劑或者其組合包含在聚合物基質中。19.根據權利要求16到18任一項的組合物,其為可噴霧的形式。20.根據權利要求16到18任一項的組合物,其作為濃縮物提供,用于在水中稀釋、分散或者溶解以提供可噴霧的組合物。21.根據權利要求16到20任一項的組合物,其為微膠囊的形式。22.根據權利要求21的組合物,其用于緩慢釋放蘋果蠹蛾引誘劑或者引誘劑組合。23.將蘋果蠹蛾吸引到昆蟲陷阱的方法,其包括用選自由水楊酸甲酯、茶螺烷異構體、芳樟醇、苯甲醇和其組合構成的組的蘋果蠹蛾引誘劑處理所述陷阱周圍受到蘋果蠹蛾侵襲或者即將能夠被蘋果蠹蛾侵襲的環境。24.根據權利要求23的方法,其中所述環境是果園,包括梨、蘋果、柑橘、核桃、山楂和海棠果園。25.根據權利要求24的方法,其中所述果園是蘋果園。26.綜合控制果園中蘋果蠹蛾的方法,其包括用包含香葉醇的蘋果蠹蛾驅逐劑組合物和包含選自由水楊酸甲酯、茶螺烷異構體、芳樟醇、苯甲醇和其組合組成的組的引誘劑的蘋果蠹蛾引誘劑組合物處理受到蘋果蠹蛾侵襲或者即將能夠被蘋果蠹蛾侵襲的果園環境。27.一種用于鑒定揮發性昆蟲驅逐劑和/或引誘劑的方法,所述昆蟲驅逐劑和/或引誘劑是通過β-葡糖苷酶對植物組織提取物的作用,從它們的非揮發性葡糖苷釋放的,該方法包括:(i)勻漿植物組織并用提取緩沖液對植物組織勻漿物進行處理;(ii)用β-葡糖苷酶或者用β-葡糖苷酶抑制劑處理植物提取物;(iii)通過GC-MS鑒定步驟(ii)中釋放的特定揮發物,相對于用β-葡糖苷酶抑制劑處理的提取物,在用β-葡糖苷酶處理的提取物中所述揮發物的水平提高;和(iv)測試步驟(iii)中鑒定的每種揮發物對昆蟲行為的影響,從而,鑒定出是每種測試的昆蟲的驅逐劑或者引誘劑的揮發物。28.根據權利要求27的方法,其中所述β-葡糖苷酶是重組β-葡糖苷酶,所述β-葡糖苷酶抑制劑是葡糖咪唑。

說明書

?用于控制果園中蘋果蠹蛾的藥劑

發明領域

本發明涉及用于鑒定昆蟲驅逐劑和引誘劑的方法,以及某些昆蟲 驅逐劑和引誘劑用于對果園中蘋果蠹蛾的綜合控制的用途。

發明背景

蘋果蠹蛾幼蟲是破壞力非常大的害蟲。蘋果蠹蛾成蟲很小,具有 1/2到3/4英寸的翼展,大約為普通家蠅的大小。它們的灰色花斑裝外 觀與樹皮相似,使得它們難以被察覺。如果捕捉成蟲,可以通過它們 的暗褐色翼尖將蘋果蠹蛾與其它和果樹相關的蛾子相區別,所述翼尖 具有光澤的紫銅色的斑紋。它們將卵逐一地產在果實、堅果或者附近 的葉子上。在梨樹中,卵還可以被產在葉簇的根部。在蘋果和梨樹上, 幼蟲穿透果實并鉆入果核中,在果實中留下褐色的孔,其中充滿蛀屑 (幼蟲糞便)。在李樹中,偶爾在其它核果中,蘋果蠹蛾鉆入果實中 一直到達果核。

蘋果蠹蛾(CM)(Cydia?pomonella(L.))在世界范圍內是對蘋果栽 培而言的經濟上最重要的昆蟲。它與蘋果以及其它一些植物具有密切 的生態關聯(Shel’deshova,1967)。Bengtsson等人觀察了在風洞中蘋果 蠹蛾成蟲對有或者沒有綠色果實的蘋果樹枝的行為反應,并且發現僅 僅蘋果綠色果實和葉子都吸引雌性蘋果蠹蛾(Bengtsson等人,2001)。 已知這種關聯很大程度上由宿主植物釋放的一些揮發性引誘劑所介導 (Bengtsson等人,2001;Sutherland和Hutchins,1972;Yan等人,1999; Knight和Light,2001;Light等人,2001)。(E,E)-α-金合歡烯 (Sutherland和Hutchins,1972;Wearing和Hutchins,1973),芳樟醇 (linalool),和β-石竹烯(Bengtsson等人,2001)已被鑒定為蘋果蠹蛾或 者新生幼蟲的引誘劑(Knight和Light,2001;Light等人,2001)。然而, 這些化合物的一些也存在于多種非宿主植物的揮發物譜中。因此,設 想改變宿主植物的揮發物組成可以改變它們與蘋果蠹蛾昆蟲的關聯是 合情理的。

公知許多植物含有大量通過糖苷鍵結合的揮發物。通常,植物葉 子顯示出最高的糖苷配基揮發性,接著是花、莖干和根(Stahl-Biskup 等人,1993)。已經分離和鑒定出了蘋果葉和果實中的一些通過糖苷鍵 結合的揮發性化合物(Schwab和Schreier,1988;Stingl等人,2002)。 此外,已經展示:通過外源應用β-糖苷酶成功地增強了果汁和酒的香 味。

蘋果蠹蛾非常難以控制,特別當允許它的種群積累了一季或者兩 季時。當種群非常高并且許多被侵襲的樹在附近時,必須應用殺蟲劑 使種群下降到非常低的水平。然而,殺蟲劑非常難以準確定時,并且 可用的唯一高效的物質對天敵和蜜蜂有毒。因此,非化學方法是優選 的。商業果園中蘋果蠹蛾的控制可以依賴于非化學方法,包括定期檢 查樹和果實(稱作偵察(scouting))、信息素誘捕,和使用天氣監視 和度-日(degree-day)模型。人們非常希望發現可以用于抗果園中 的蘋果蠹蛾的天然非毒性化合物。

在The?Merck?Index(13th?Edition,2001,#4415)中描述了在許多精 油,如玫瑰油、玫瑰草油、香茅油和檸檬草油中發現的烯屬萜醇香葉 醇作為昆蟲引誘劑。然而,一些出版物將香葉醇描述為揮發性驅蟲劑。

US?4,774,081公開了香葉醇作為針對蟑螂和其它爬行昆蟲的接觸 驅蟲劑。Chem.Abstracts,Vol.105:204742q公開來自月桂樹(Laurus nobilis?L.)的葉子的化合物是Tribolium?castaneum(Herbst)的有用的驅 蟲劑,并且這些化合物包括以50ppm存在的香葉醇等。Chem. Abstracts,Vol.113:110945w(JP?02/67202的摘要)公開:當摻入多孔無 機微膠囊時,芳樟醇、香葉醇、香茅醇和橙花醇等是針對蟑螂、蛞蝓、 螞蟻等等的驅蟲劑。

US?5,227,406、US?5,346,922、US?5,648,398和US?5,621,013公開了 用于人和動物的驅蟲劑,用于驅逐攜帶Lyme氏疏螺旋體病的壁虱,以 及叮人的蚊子和triatomes(Chagas?bugs),所述驅蟲劑包含松油醇、香 茅油和羅丁醇提取物(extra)和香葉醇作為運送介質中提供的活性物。 活性物以少量使用,例如,少至0.01%,優選0.05%到0.08%,優選小 于1%,但仍然是協同有效的,對于攜帶Lyme氏疏螺旋體病的壁虱尤 其協同有效。

US?5,633,236公開了在限定的時間期限內驅逐家蠅(Musca domestica?L.(Diptera:Muscidae)、埃及伊蚊(Aedes?aegypti)、Culex nigripalpus、大西洋伊蚊(Aedes?atlanticus)、鹽水庫蚊(Culex salinarius)、刺擾伊蚊(Aedes?vexans)、庫蚊(Culex?spp.)、蚋(Simulium spp.)、Psoroferia?ferox、Aedes?infirmatus、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、Coccinellidae、Anopheles?crucians、Psoroferia columbiae、庫蠓(Culicoides?spp.)、和伊蚊(Aedes?spp.)的方法, 其基本上由下述步驟構成:將三維空間暴露于有效的驅逐濃度和量的 香葉醇或者含有香葉醇前體的組合物,該組合物基本上由50-100%香 葉醇或者香葉醇前體(例如,香葉氧基-1,3,2-dioxaborinane、二香葉 氧基二甲基甲硅烷和香葉基糖苷,例如,香葉基6-O-(α-L-吡喃 鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷)構成,該組合物的剩余物(如果組 合物實際上不是100%香葉醇)為選自香茅醇和橙花醇構成的組的化合 物。上面所述的驅蟲劑被描述為照這樣使用或者包含在下述聚合物中 時是有用的,該聚合物可以是生物可降解的聚合物,如含有大部分聚 (ε己內酯)均聚物的組合物。US?5,401,500、US?6,143,288、US?5,635,173 和US?5,665,781描述了此類驅逐家蠅(Diptera:Muscidae)和/或埃及伊蚊 的方法,所述方法包括暴露于含有香葉醇的組合物,所述組合物基本 上由50-100%的香葉醇組成,該組合物的剩余物為選自香茅醇和橙花 醇構成的組的化合物。

US?5,753,686描述了從:(i)擾血蠅Haematobia?irritans(Linnaeus) (通常稱作角蠅);和(ii)Solenopsis?invicta?Buren(通常稱作“紅色 外來火蟻”)的至少一種昆蟲物種棲息的表面或者大塊(volume)驅逐 至少一種昆蟲物種的方法,該方法由對所述表面或者所述體積應用“紅 色外來火蟻”和/或角蠅驅逐量和濃度的含有香葉醇的混合物的步驟組 成,該混合物包含:(i)按重量計0到高達約20%的橙花醇;(ii) 按重量計約20到高達約40%的香茅醇;和(iii)按重量計約50到高 達約70%的香葉醇,該香葉醇混合物根據附圖中給出的特定GLC譜和 所述專利的說明書中給出的折射率和密度定義。

含有香葉醇的產品可以以用作帶、藥巾和泵式噴霧瓶形式的驅蟲 劑商購得到。通過直接將液體噴霧在布或者皮膚上,香葉醇蒸發形成 保護屏障制止吸血昆蟲叮咬。已經證明這些產品有效抗蚊子、跳蚤、 壁虱、黑蠅、蚋、恙螨、蠓和許多其它昆蟲。

就本發明人所知,文獻中還沒有描述香葉醇作為蘋果蠹蛾的驅蟲 劑。

發明內容

一方面,本發明涉及一種方法,用于鑒定通過β-葡糖苷酶對植物組 織提取物的作用從它們的非揮發性糖苷釋放的揮發性昆蟲驅逐劑 (repellent)和/或引誘劑。

通過在蘋果葉子提取物中應用該方法,鑒定香葉醇為蘋果蠹蛾 (codling?moth)驅蟲劑,并鑒定水楊酸甲酯、(2R,5R)-和(2S,5R)- aspirane異構體、芳樟醇和苯甲醇為蘋果蠹蛾引誘劑。

從而,在另一方面,本發明涉及用作蘋果蠹蛾驅蟲劑的包含香葉 醇的組合物,以及通過用所述香葉醇驅蟲劑組合物處理果園來驅逐果 園中的蘋果蠹蛾的方法。

在又一方面,本發明涉及包含水楊酸甲酯、aspirane異構體、芳樟 醇、苯甲醇或者其組合的組合物,用作蘋果蠹蛾引誘劑,還涉及通過 用所述引誘劑組合物處理果園來引誘果園中蘋果蠹蛾的方法。

在再一方面,本發明涉及通過用所述香葉醇驅蟲劑和引誘劑組合 物兩者處理果園來綜合控制果園中蘋果蠹蛾的方法。

附圖簡述

圖1顯示了用重組β-葡糖苷酶(BGL1)和葡糖咪唑 (glucoimidazole)(β-葡糖苷酶抑制劑)處理的蘋果葉提取物的引誘。 葉BGL1——使用β-葡糖苷酶處理的葉子提取物的陷阱;葉Inhi——使 用葡糖咪唑處理的葉子提取物的陷阱;葉子——使用葉子提取物的使 用;水——使用水的陷阱。相同的小寫和大寫字母分別表示在不同陷 阱和陷阱周圍捕獲的昆蟲數目沒有顯著差異,p=0.05,多重Turkey檢 驗。

圖2A-2B顯示了加入外部β-葡糖苷酶從蘋果(cv.Anna)葉提取物 釋放的化合物的增加的水平。(2A)加入β-葡糖苷酶(BGL1)、葡糖咪 唑(抑制劑)或者不加任何物質的蘋果葉提取物的GC色譜。峰1,苯 甲醇;2,芳樟醇;3,水楊酸甲酯;4,香葉醇;5,(2R,5R)-茶螺烷;6, (2S,5R)-茶螺烷。相同的字母表示在不同陷阱中捕獲的昆蟲數目沒有顯 著差異,p=0.05,多重Turkey檢驗。

圖3顯示了β-葡糖苷酶增強的化合物對蘋果蠹蛾昆蟲的引誘/驅逐 效果。在具有成對陷阱和60只成蟲的篩選籠中進行誘捕試驗。記錄陷 阱中捕獲的昆蟲數目并通過t-檢驗(p<0.05)分析。+G:加入濃度為39.4 ng?ml-1的香葉醇;混合的:在葉提取物中檢測濃度下的所有引誘劑混 合物。

發明詳述

一方面,本發明涉及一種方法,其用于鑒定通過β-葡糖苷酶對植物 組織提取物的作用從非揮發性糖苷釋放的揮發性昆蟲驅逐劑和/或引誘 劑,其包括:

(i)勻漿植物組織,并用提取緩沖液對植物組織勻漿物進行處理;

(ii)用β-葡糖苷酶或者用β-葡糖苷酶抑制劑處理植物提取物;

(iii)通過GC-MS鑒定步驟(ii)中釋放的特定揮發物,相對于用β- 葡糖苷酶抑制劑處理的提取物,在用β-葡糖苷酶處理的提取物中所述揮 發物的水平提高;和

(iv)測試步驟(iii)中鑒定的每種揮發物對昆蟲行為的影響,

從而,鑒定出是每種測試的昆蟲的驅逐劑或者引誘劑的揮發物。

任何β-葡糖苷酶都可以用于本發明的方法中,優選重組的β-葡糖苷 酶,可以使用任何β-葡糖苷酶抑制劑,其例如但不限于,葡糖咪唑。

在本申請中,用巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)中產生的重組 黑曲霉(Aspergillus?niger)β-葡糖苷酶(下文中稱作BGL1)來水解蘋 果樹(Malus?domestica,cv.Anna)葉子中存在的揮發物的糖苷。評估酶 促釋放的揮發性化合物對蘋果蠹蛾成蟲的行為的影響,與用葡糖咪唑 處理的葉子提取物相比,用BGL1處理的葉子提取物中所述化合物的 水平更高。

根據本發明,通過SPME-GC-MS分析從蘋果樹葉提取物(cv. Anna)釋放的糖苷結合的揮發物,并在籠子生物測定中評價它們對蘋果 蠹蛾(CM)的行為影響。與含有葡糖咪唑的提取物相比,在含有黑曲霉 β-葡糖苷酶(BGL1)的葉子提取物中,1-辛醇、芳樟醇、香葉醇、苯甲 醇、水楊酸甲酯、(2R,5R)-茶螺烷和(2S,5R)-茶螺烷的水平顯著提高。 發現各化合物對CM成蟲的吸引力遵循下面的遞減順序:水楊酸甲酯 和兩種茶螺烷異構體的混合物,接著是芳樟醇和苯甲醇。發現香葉醇 是CM成蟲的驅逐劑。向各揮發物或者向這些引誘劑的混合物中加入 香葉醇(39.4ng?ml-1)消除了它們的引誘力。我們的數據表明可能應用香 葉醇作為驅蟲劑和水楊酸甲酯或者茶螺烷作為引誘劑用于蘋果園中 CM的綜合控制。

本發明的一些實驗的目的是通過寬特異性黑曲霉BGL1確定蘋果 葉中釋放植物揮發物的潛力,和確定釋放的揮發物和蘋果的最重要昆 蟲蘋果蠹蛾之間的潛在的相互作用。

從而,根據本發明,已經發現香葉醇是蘋果蠹蛾的驅逐劑。

從而本發明涉及包含香葉醇的組合物,其用作蘋果蠹蛾驅逐劑。

該組合物可以僅含有天然或者合成的香葉醇,或者它可以包含其 它成分,如橙花醇和香茅醇,優選按重量計約50到高達(up?to)約70% 的香葉醇,按重量計0到約20%的橙花醇和按重量計約20到約40%的 香茅醇。

根據本發明,還發現水楊酸甲酯、(2R,5R)和(2S,5R)茶螺烷異構 體、芳樟醇和苯甲醇是蘋果蠹蛾的引誘劑。

從而,本發明還涉及用作蘋果蠹蛾的引誘劑的組合物,其包含選 自水楊酸甲酯、茶螺烷(theaspirane)異構體、芳樟醇、苯甲醇和其組合 的活性劑。這些引誘劑單獨或者組合,可以用作誘餌增強劑用于劇毒 毒素和/或誘捕裝置。在優選實施方案中,引誘劑是甲基水楊酸酯、 (2R,5R)茶螺烷、(2S,5R)茶螺烷,或者其組合。

如本文定義的揮發性昆蟲驅除劑和引誘劑由于它們的快速蒸發和/ 或被所處理的基質吸收而具有相對短的保護期的缺點。吸收和蒸發這 兩種因素導致需要頻繁應用,其是煩人的和耗時的。本領域已知的多 種物質可以用于延長根據本發明的揮發性昆蟲驅除劑和引誘劑的殘留 活性,并且它們都被本發明包括。

如本文定義的包含香葉醇或者蘋果蠹蛾引誘劑的組合物可以與天 然或者合成的相容聚合物組合,所述聚合物可以是或不是生物可降解 的。聚合物可以是纖維素衍生物,其包括但不限于,纖維素醚,例如, 甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖 維素;纖維素酯,例如,乙酰基纖維素。聚合物還可以是基于明膠和 其它材料的包衣材料,以制造攜帶或者包衣玉米淀粉的微型膠囊。聚 合物還可以是高密度聚乙烯或者低密度聚乙烯,或者生物可降解的聚 合物,如生物可降解的熱塑性聚氨基甲酸酯、在主鏈中具有酯鍵的生 物可降解的乙烯聚合物以及如美國專利號4,496,467;4,469,613和 4,548,764(通過引用將它們并入本文)中公開的聚(ε-己內酯)均聚 物。

本發明的組合物可以是可噴霧的,在該情況中,它還包含水性稀 釋劑,或者它可以是濃縮物,需要在水中稀釋、分散或者溶解以提供 可噴霧的組合物。

在本發明的一個優選實施方案中,本發明的組合物包含含有香葉 醇或者本發明的一種或多種引誘劑的微膠囊。這些微膠囊提供了一些 優點,包括香葉醇或者引誘劑的緩釋。此外,這些微膠囊可以足夠小 而可以合適地用于噴霧組合物,而不堵塞噴嘴。此外,香葉醇或者引 誘劑將例如以小滴的形式“膠粘”或者有效保留在植物的葉子(例如, 葉子或者其它光合器官)上或者樹皮上。

在本發明的另一實施方案中,還可以將香葉醇或者引誘劑組合物 摻入顆粒中,其能夠緩慢并且以可控的方式釋放。像上述微膠囊一樣, 顆粒存在于基質中并且以小滴或者小滴樣單位分布。顆粒可以由小顆 粒的無機載體或者有機聚合物,如本領域技術人員已知的那些組成。

本發明還提供了驅逐蘋果蠹蛾的方法,其包括用包含香葉醇的蘋 果蠹蛾驅逐組合物處理所述蘋果蠹蛾侵襲或者即將要被侵襲的環境。

本發明還涉及在限定的時間內驅逐蘋果蠹蛾可居住的果園中蘋果 蠹蛾的方法,所述方法包括用香葉醇驅逐組合物處理果園。

另一方面,本發明涉及引誘果園中的蘋果蠹蛾的方法,所述方法 包括用選自水楊酸甲酯、茶螺烷異構體、芳樟醇、苯甲醇和其組合構 成的組的引誘劑處理果園。

在一個實施方案中,本發明提供了將蘋果園中的蘋果蠹蛾引誘到 昆蟲陷阱的方法,其包括將所述陷阱周圍的環境暴露于含有昆蟲引誘 劑的聚合物的步驟,所述聚合物由聚合物和所述聚合物的重量的至少1 %的引誘劑的混合物組成,該引誘劑選自水楊酸甲酯、茶螺烷異構體、 芳樟醇、苯甲醇和其組合構成的組。

本發明還涉及在限定的時間內綜合控制蘋果蠹蛾可居住的果園中 蘋果蠹蛾的方法,所述方法包括用香葉醇驅逐組合物和包含選自水楊 酸甲酯、茶螺烷異構體、芳樟醇、苯甲醇和其組合構成的組的蘋果蠹 蛾引誘劑的組合物處理果園。

可以用香葉醇驅逐組合物和本發明的引誘組合物處理的果園是被 蘋果蠹蛾害蟲攻擊的果園,其包括蘋果、梨、柑橘(quince)、核桃、山 楂和海棠(crab?apple)果園。在最優選的實施方案中,本發明的方法應 用于蘋果園,并且在結果季節對樹進行噴霧。

現在將通過下面的非限定性實施例闡明本發明。

實施例

材料和方法

(i)昆蟲-將CM?Cydia?pomonella?L.的卵在培養皿中于室溫下孵 化。對幼蟲喂飼人工食物(Manduca?Premix-Heliothis?Premix,Stonefly Inc.,Bryan,TX),在25±0.5℃、60±1%的相對濕度和16:8h(L:D) 的光周期下保持直到第五齡幼蟲,將其轉移到波狀紙條(corrugated paper?strip)(2cm2)。當出現時,混合性別和年齡(2天內)的成年昆 蟲,用于籠子生物測定法。

(ii)蘋果葉提取處理-2004年6月在以色列Rehovot的郊區中的商 業果園切除具有葉子和果實的蘋果(cv.Anna)樹枝。從樹枝切下葉子, 用雙蒸水(DDW)洗滌,然后用濾紙干燥。在液氮中勻漿干燥的葉子。 向葉子勻漿物(每次處理4-5g)加入三倍重量的含有50mM檸檬酸 鹽緩沖液中的10mM?EDTA和4mM?DTT的冰預冷的提取緩沖液。然 后將混合物在4℃旋轉1h并在6,000g離心5分鐘。收集上清液(每次 處理10ml)。在一種處理中,加入巴斯德畢赤酵母中產生的1單位重 組黑曲霉BGL1產物(Dan等人,2000)并將溶液在37℃保持4h。在另 一處理中,加入提取緩沖液后立即向葉子勻漿物中加入2μM葡糖咪唑 (β-葡糖苷酶抑制劑),以便阻斷任何內源β-葡糖苷酶活性。按照 Shoseyov等人(1990)所述,使用對-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 (pNPG)作為底物,測定定量β-葡糖苷酶活性。

(iii)揮發物收集和GC-MS(氣相色譜(GC)和質譜法(MS))分析- 用包衣有100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)的固相微萃取(SPME)纖維收 集從葉子提取物和果汁釋放的頂空揮發物。將纖維暴露于頂空揮發物 30分鐘。在SPME期間,瓶內的葉子提取溫度為60℃,沒有攪拌。然 后在裝備30m,0.25mm?ID?DB-5毛細管柱(J&W,Folson,CA)的 Varian-3?GC-MS系統的注射口中用裝載的SPME纖維解吸3分 鐘。通過Varian?8200自動采樣器(Varian,Palo?Alto,CA)精確控制采 樣和解吸時間。向每個樣品加入3-辛醇(0.1ppm)作為內部標準。以獨 立的一式三份分析每個樣品。根據Shalit等人(2003)設置GM-CS參 數。注射器溫度是250°,設置用于無分流注射。設置柱子為50℃1分 鐘,然后以4℃min-1的速率將溫度升高到200℃。從45到450質荷 比,用70eV的電子能記錄質量范圍。

通過將它們的質譜和保留數據與真實化合物的比較來鑒定多數揮 發性化合物,所述真實化合物補充有Wiley質譜庫(McLafferty,1994) 和文獻數據(Adams,1995)。通過相對于內部標準計算濃度來鑒定揮發 物。通過內部標準峰的面積歸一化揮發性組分峰的面積。

(iv)化學藥品-多數合成的標準都從Sigma/Aldrich(St.Louis, MO)購買。純度為98到99.5%。(2R,5R)-茶螺烷和(2S,5R)-茶螺烷的混 合物來自Fluka(Buchs?SG,Switzerland)。

(v)籠子生物測定法-基于Zhu等人(2003)的方法,在實驗室中室 溫下(23℃±3℃)在篩選籠子(96×68×45cm)中進行誘捕測試。將混合 性別和年齡(蛹出現后2天)的60只蘋果蠹蛾成蟲釋放到籠子中,籠 子含有使用不同處理的陷阱。從在中心具有孔(直徑5mm)的白紙蓋 覆蓋的100ml燒杯構造陷阱。Whatman紙芯(10cm長)用作分配器。 為了檢查向葉子提取物加入重組BGL1的效果,構造四個陷阱并放入 相同的籠子中。第一個陷阱含有加入重組BGL1的10ml葉子提取物。 第二個陷阱含有相同量的葉子提取物,其加入葡糖咪唑。第三個陷阱 僅含有葉子提取物并且第四個陷阱含有水。在它們釋放后12小時計數 陷阱中或者陷阱周圍捕獲的昆蟲。陷阱周圍的昆蟲如下定義:將篩選 籠子的空間等分成四部分。每個陷阱放入每個部分的中央。在實驗中 得到每個特定空間中存在的昆蟲數目(不包括陷阱中的昆蟲)。為了 測試合成化合物的吸引力,首先用各化合物制備陷阱,首先將所述化 合物溶解在乙醇中,通過用BGL1處理的葉提取物中的SPME-GC- MS分析確定化合物的濃度。乙醇的終濃度為0.01%。每個陷阱保持在 籠中,其具有僅僅包括0.01%乙醇的對照水陷阱。過夜進行實驗(從 下午9點到上午9點)以覆蓋在早晨黎明前它們的活動時間。每個實 驗重復5次,只是對照1-辛醇除外,其在初步實驗中不顯示出對蘋果 蠹蛾的行為活性。該實驗重復3次。將陷阱隨機安排在重復實驗中以 避免陷阱的可能的位置效應。因為昆蟲信息素的復雜牽涉,跳過對捕 獲的昆蟲的性別比例的研究。

實施例1.?β-葡糖苷酶活性對蘋果葉提取物對蘋果蠹蛾成蟲的吸引力/ 排斥的影響

使用對-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作為底物進行的 定量β-葡糖苷酶活性測定證實了蘋果葉提取物中內源β-葡糖苷酶的殘 留活性(0.24單位g-1鮮重.min-1)。用葡糖咪唑(Heightman和Vasella, 1999)處理導致葉提取物中檢測不到β-葡糖苷酶活性的水平。

含有蘋果葉提取物和2μM葡糖咪唑的陷阱比含有葉提取物、葉提 取物處理的BGL1或水的陷阱捕獲了明顯更多的成年蘋果蠹蛾。此外, 在葉加上抑制劑陷阱周圍,比任何其它陷阱捕獲明顯更多的昆蟲(圖 1)。這些相當一致的結果提示β-葡糖苷酶活性釋放的糖苷配基對蘋果 蠹蛾昆蟲具有驅逐效果。此外,葡糖咪唑對β-葡糖苷酶活性的完全抑制 和用該β-葡糖苷酶抑制劑處理的葉子提取物的顯著吸引表明這些糖苷 和β-糖苷酶位于完整葉子中不同的區間。

食植物昆蟲對宿主食物香味的吸引或者定向反應可以通過損傷植 物來增強或者增加。已經報導了蘋果蠹蛾幼蟲和成蟲對其它蘋果蠹蛾 幼蟲侵襲的蘋果果實的增加的反應(Landolt等人,2000;Reed和 Landolt,2002)。在該研究中,我們證明具有葡糖咪唑的粉碎的蘋果葉 保留它們對蘋果蠹蛾成蟲的吸引力。

實施例2.對用BGL1或者β-葡糖苷酶抑制劑處理的蘋果葉提取物的 GC-MS分析

用SPME纖維收集用BGL1、β-葡糖苷酶抑制劑處理或者不處理的 葉提取物的頂空揮發物并通過GC-MS分析。通過比較它們的質譜和 保留指數與真實的合成標準品,對所檢測的揮發物進行鑒定和定量。 相對于用β-葡糖苷酶抑制劑處理的葉子提取物,用BGL1處理的葉子提 取物中1-辛醇(CV,變異系數,32.6%)、芳樟醇(28.6%)、香葉醇 (22.4%)、苯甲醇(32.1%)、水楊酸甲酯(41.9%)、(2R,5R)-茶螺烷(38.7%) 和(2S,5R)-茶螺烷(32.4%)的水平顯著增加(圖2),表明這些化合物主 要作為糖苷存在于蘋果樹葉中。

與不存在外源β-葡糖苷酶或者β-葡糖苷酶抑制劑時的葉子提取物 相比,黑曲霉BGL1從葉子提取物釋放明顯更多的糖苷配基。這可以 反映黑曲霉BGL1和蘋果β-葡糖苷酶之間的底物特異性的差異或者簡 單地反映了反應瓶中黑曲霉BGL1的更高的活性。

人們認為所鑒定的揮發物中的大部分是許多植物物種中的常見糖 苷配基(Stahl-Biskup等人,1993)。關于蘋果糖苷配基的數據相當有 限。已經發現大量C13-noriprenoids作為糖苷鍵結合的芳族化合物存 在于蘋果果實和葉子中(Schwab和Schreier,1988;Stingl等人,2003)。 然而,以前還沒有關于香葉醇、水楊酸甲酯和茶螺烷異構體作為蘋果 糖苷配基的報導。

一些糖苷配基的存在也可以在蘋果栽培種之間不同。在自然界中 發現了非對映異構體茶螺烷(Schmidt等人,1992)。將它們中的兩種鑒 定為紫色西番蓮(purple?passion?fruit)(Passiflora?edulis?Sims)中的糖 苷配基(Winterhalter,1990)。Schmidt等人(1992)合成了在其感官性質 明顯不同的茶螺烷的四種異構體。發現(2R,5R)-茶螺烷具有弱的樟腦樣 標記,而(2S,5R)-茶螺烷顯示出強的樟腦樣,幾乎萘樣的標記。在該研 究中,鑒定基于這兩種合成的茶螺烷異構體標準品。根據我們的知識, 這是首次報導茶螺烷異構體作為糖苷配基存在于蘋果葉中。

僅在黑曲霉BGL1存在下檢測到1-辛醇、苯甲醇和水楊酸甲酯。 這可能是由于BGL1和內源蘋果β-葡糖苷酶的底物特異性的不同或者 對內源β-葡糖苷酶的無效提取。已知一些植物葡糖苷酶,如葡萄漿果葡 糖苷酶是膜結合的酶(Günata等人,1998)。它們的提取需要特定條件。 據詳細記載,β-葡糖苷酶的糖苷配基部分特異性隨著酶的來源而顯著不 同(Hsel和Conn,1982;Günata等人,1990;Babcock?and?Esen,1994)。 在該研究中,在用葡糖咪唑處理的葉子提取物中檢測到低水平的芳樟 醇和茶螺烷,葡糖咪唑完全抑制測試條件中的β-葡糖苷酶活性,暗示在 蘋果葉中存在這些化合物的游離形式。Bengtsson等人(2001)還在 “Jonathan”蘋果葉的頂空檢測到少量游離芳樟醇,但是他們沒有提到 茶螺烷。

應該知道,除了上面提到的化合物,從蘋果葉提取物還釋放了許 多其它揮發物。因為GC-MS的有限的靈敏度,在蘋果葉頂空中可能 存在一些其他昆蟲引誘劑或者驅逐劑。

實施例3.β-葡糖苷酶增強的化合物對蘋果蠹蛾昆蟲的引誘/驅逐效果

在籠子生物測定中,將具有在葉提取物中檢測的濃度的各自化合 物的陷阱與僅含有水和乙醇的對照陷阱配對。化合物對成蟲的吸引力 遵循下降的順序:水楊酸甲酯和兩種茶螺烷異構體的混合物,接著是 芳樟醇,然后是苯甲醇。所有這些化合物都比作為空白的水更有吸引 力(圖3)。有趣的是,具有所有這些化合物的混合物的陷阱并不捕獲 最多的昆蟲。根據我們的知識,這是首次報導將茶螺烷異構體作為蘋 果蠹蛾引誘劑。除了廣泛接受的昆蟲交配破壞技術(Calkins和Faust, 2003)外,這些化合物可以用作成蟲的大量捕獲中的誘餌。

具有70ng?ml-11-辛醇的陷阱不捕獲任何昆蟲,并且向其它化合 物加入相同量的1-辛醇與僅僅這些化合物相比,不顯著影響捕獲的昆 蟲的數目(數據未示出)。這表明1-辛醇對于蘋果蠹蛾成蟲的行為沒 有顯著影響。

顯著地,39.4ng?ml-1香葉醇對蘋果蠹蛾成蟲顯示出驅逐效果。具 有任一種前述引誘劑化合物加上相同量的香葉醇的陷阱不能捕獲任何 昆蟲,這表明,該濃度的香葉醇消除了用于實驗的這些化合物的吸引 力。已經報導香葉醇作為一些商業驅蚊產品中的關鍵成分(Xue等人, 2003),并且作為柑橘植物的天然精油的主要成分(Matsuda等人, 1996),它已經作為生物驅蚊劑上市。

昆蟲控制集中在對作物和動物的保護和維持公眾健康。一個重要 的領域涉及開發和生產環境安全的和無毒的驅蟲劑。我們的結果表明 在蘋果蠹蛾的蘋果植物宿主中,香葉醇作為失活的糖苷/蘋果蠹蛾驅逐 劑存在。僅當葉子損傷時,發生糖苷和β-葡糖苷酶的去隔室化,導致釋 放香葉醇。最近,我們已經證明在轉基因煙草中表達黑曲霉β-葡糖苷酶 基因(BGL1)導致完整和壓碎的葉子中揮發物的顯著改變(Wei等人, 2004)。

實施例4.包含香葉醇的微膠囊

通過首先將液體香葉醇吸收到磷酸三鈣(TCP)中,然后用表1的第 1-3和5行中,或如表1的第4行中所述的物質包衣來制備包含香葉 醇的微膠囊:

表1.包含香葉醇的微膠囊

吸收載體 包衣材料 顆粒 大小 外觀 香葉醇 含量 1 磷酸三鈣25% 甘油一酯60% <850μm 自由流動的 粒狀粉劑 15% 2 磷酸三鈣50% 乙基纖維素 CAS?9004-57-320% (纖維素乙醚) <850μm 自由流動的 粒狀粉劑 30% 3 磷酸三鈣64% 乙基纖維素+羥丙基 纖維素20% <850μm 自由流動的 粒狀粉劑 16% 4 基于玉米淀粉的 基質(填充劑) 40% 將基于明膠的溶液倒在 基質上并加入香葉醇 以產生微型膠囊50% <850μm 自由流動的 粒狀粉劑 10% 5 磷酸三鈣54% 乙基纖維素+ 羥丙基纖維素30% <850μm 自由流動的 粒狀粉劑 16%

參考文獻

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