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耐酸、穩定的益生菌微膠囊及其制備方法和應用.pdf

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耐酸 穩定 益生菌 微膠囊 及其 制備 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201611254327.7

申請日:

20161230

公開號:

CN106617093A

公開日:

20170510

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A23L33/135,A23P10/30,A61K35/744,A61K35/747,A61K35/745,A61K9/50,A61K8/99,A61K8/11,A61K8/98,A61K8/73,A61K8/60,A61K8/34,A61Q19/00 主分類號: A23L33/135,A23P10/30,A61K35/744,A61K35/747,A61K35/745,A61K9/50,A61K8/99,A61K8/11,A61K8/98,A61K8/73,A61K8/60,A61K8/34,A61Q19/00
申請人: 廣州新濟藥業科技有限公司
發明人: 李革,周煥彬,李順怡,潘昕,朱春娥,陳航平
地址: 510660 廣東省廣州市天河區中山大道中262號503房
優先權: CN201611254327A
專利代理機構: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 代理人: 曾鳳云;萬志香
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法律狀態
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CN201611254327.7

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法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種益生菌微膠囊及其制備方法和應用,益生菌微膠囊包括芯材和壁材,所述芯材為益生菌,所述壁材為含有天然高分子材料和凍干保護劑的混合溶液。其是通過將益生菌菌泥加入至含天然高分子材料和凍干保護劑的混合溶液中,再在微膠囊造粒儀的供入噴嘴系統中形成微滴,固化后得到的。本發明采用凍干保護劑與天然高分子材料作為壁材,調整噴嘴以及振動頻率調整,使得制備得到的益生菌微膠囊制劑具有很好的活菌數性能、較好的穩定性和耐酸性,操作簡便、工藝參數易控、生產效率高、經濟易行,適合工業化規模生產。

權利要求書

1.一種耐酸、穩定的益生菌微膠囊,包括芯材和壁材,所述芯材為益生菌,其特征在于,所述壁材為含有天然高分子材料和凍干保護劑的混合溶液,所述益生菌與所述混合溶液的質量比為1:1-1:8;所述混合溶液中天然高分子材料的質量百分比為0.5-7.0%,所述混合溶液中凍干保護劑的質量百分比為5.0-15.0%。2.根據權利要求1所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊,其特征在于,所述益生菌與所述混合溶液的質量比為1:2-1:5。3.根據權利要求1所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊,其特征在于,所述混合溶液中天然高分子材料的質量百分比為1-5%,所述混合溶液中凍干保護劑的質量百分比為5-12%。4.根據權利要求1所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊,其特征在于,所述壁材外還涂覆有包衣材料,所述包衣材料為殼聚糖鹽酸鹽。5.根據權利要求1~4任一項所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊,其特征在于,所述益生菌為保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌中的一種或幾種;所述凍干保護劑為葡萄糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇、右旋糖酐40和脫脂牛奶中的一種或幾種;所述天然高分子材料為膠凝糖、黃原膠、阿拉伯膠、明膠和海藻酸鈉中的一種或幾種。6.權利要求1~5任一項所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:1)將經活化增殖培養的益生菌菌液離心,得到益生菌菌泥;2)將步驟1)所述益生菌菌泥加入至含天然高分子材料和凍干保護劑的混合溶液中,混合均勻,得到菌懸液;所述益生菌菌泥與所述混合溶液的質量比為1:1-1:8;所述凍干保護劑在所述混合溶液中的質量百分比為5-15%;所述天然高分子材料在所述混合溶液中的質量百分比為0.5-7.0%;3)步驟2)的菌懸液在微膠囊造粒儀的供入噴嘴系統中形成微滴,滴入固化劑或者交聯劑中,即得到益生菌微膠囊。在其中一些實施例中,步驟2)中所述益生菌菌泥與所述水溶液的質量比為1:2~5。7.根據權利要求6所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊的制備方法,其特征在于,還包括對所述益生菌微膠囊進行包衣30-60min的步驟,所述包衣液為體積百分含量為5.0-10.0%的殼聚糖鹽酸鹽溶液。8.根據權利要求6所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊的制備方法,其特征在于,還包括冷凍干燥的步驟:將所述益生菌微膠囊放入體積百分比為8.0-18.0%的凍干保護劑溶液中平衡30min后,再在-45℃下預凍3-6h,最后在-40℃下真空冷凍干燥24-40h。9.根據權利要求6~8任一項所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊的制備方法,其特征在于,步驟3)中所述菌懸液經蠕動泵勻速供入微膠囊造粒儀的供入噴嘴系統中,所述蠕動泵泵速為3~15ml·min,供入噴嘴系統的震動頻率為600-2500Hz。10.權利要求1~5任一項所述的耐酸、穩定的益生菌微膠囊在制備保健食品、飲料食品、臨床營養制劑、藥物微制劑或化妝品中的應用。

說明書

技術領域

本發明屬于益生菌制劑領域,具體涉及一種耐酸、穩定的益生菌微膠囊制劑及其制備方法和應用。

背景技術

益生菌包括乳桿菌類、雙歧桿菌類和革蘭氏陽性球菌類三大類,是一種可以改善人體胃腸道微生物平衡并且對人體健康產生積極影響的活性有益微生物的總稱。微生態制劑是利用對宿主有益無害的正常微生物群成員或促進物質制成的制劑。益生菌作為狹義的微生態制劑,具有廣泛的市場,主要應用于促進腸道系統健康、抑制腸道致病菌、改善乳糖不耐受癥以及改善腹瀉等。FHO/WHO對益生菌發揮作用的最低活菌數目要求是定植于腸道中的活菌數目不得少于106-107CFU mL-1(g-1)。

目前人體各個部位的菌群平衡都和人體的健康密切相關,常見的菌群失調性疾病主要包括腹瀉、乳糖不耐受和便秘等。目前我國臨床上使用的益生菌制劑主要包括單菌制劑和復合菌種兩種。傳統的益生菌產品基于“饑餓存活”的原理,利用冷凍干燥技術降低益生菌中的含水量,使其可以長期存活。但是這類菌種對溫濕度和光照等因素非常敏感,使得應用上存在一定的限制。同時,目前國內許多益生菌產品,著重于突出其使用前所含有的活菌數量,避開益生菌經過胃部胃酸影響后的存活率以及定植于腸道發揮作用的活菌數目,同時長期儲存穩定性也對益生菌制劑有著很重要的影響。這些因素在一定程度上會影響消費者對益生菌產品實際作用的認識,也會對安全有效益生菌制劑的開發造成一定的影響。

為了改善益生菌本身的不耐酸、長期儲存穩定性差等缺點,近些年來,大量研究致力于通過微型顆粒或者微型膠囊包裹益生菌活菌,然后通過冷凍干燥或者噴霧干燥來生產相關產品。真空冷凍干燥法是一種最常用于降低益生菌含水量的方法,菌種在真空冷凍干燥后,酶的活性喪失、凍干燥菌粉復水性好、脫水徹底、保存期長、儲存運輸和使用都很方便,為直投式發酵劑提供良好的基礎。但是在冷凍干燥過程中,過低的溫度可能會導致細胞內水結晶、細胞失水或者蛋白質失活的情況,導致菌體損傷甚至死亡,會對菌種的生產和保存產生不良影響。因此,在制備益生菌制劑中使用冷凍干燥保護劑,可以在一定程度上保護菌種免受低溫的侵害。

微囊化技術是一種利用天然或合成的高分子材料作為囊材(壁材),制備囊膜后將性能不穩定的液體或者固體藥物包埋成微膠囊的技術,其內部物質為芯材。使用這種技術可以有效地抵御外界環境對益生菌的影響,有效提高益生菌的活菌數目、耐酸性及存儲穩定性。

另外,微囊化使用的壁材一般要求都要達到食品級以上。

單凝聚法以及復凝聚法是微膠囊常用的制備方法,具有操作簡單、條件溫和、成本較低以及無毒等優點,但是這些辦法制備的微囊粒徑常常受限于所采用的噴嘴大小。而如果噴嘴孔徑過小,又容易造成制備過程中效率降低的問題。這些因素都會限制微膠囊的使用以及生產,因此在單凝聚法以及復凝聚法的基礎上,開發一種可以快速制備微米級粒徑、粒徑分布均一和可控的微膠囊制備方法對益生菌微膠囊的適用性有著重大的應用和經濟學意義。

基于擠出法制備的微膠囊的物理本質,可以通過一定外加作用力,使得液滴可分散成更細小的微滴,這些細小的液滴滴入固化劑或者交聯劑之后,可以通過物理化學的作用形成微膠囊。而穩定可控的外加作用力則對微膠囊的形態、微膠囊的可控規模化生產以及產品的優良率有著密切關系。當微滴在氣體中形成球狀的時候,由于液氣界面張力較大,可以維持球形,且益生菌不易擴散,微滴滴入固化劑中后可以形成粒徑均且有效包埋益生菌的微膠囊。微膠囊造粒儀,可以通過控制菌懸液的泵速使其成為射流,再通過儀器本身的疊加振動,使得噴嘴射出的射流分散成粒徑大小相等的液滴,再將液滴滴入固化劑中形成微膠囊。粒徑的大小可以通過控制噴嘴以及振動頻率來控制。使用微膠囊造粒儀所生產的益生菌微膠囊不僅保持了固化法制備簡單和條件溫和等特點,還可以有效降低微膠囊的粒徑,生產出的微膠囊粒徑均一可控,可以連續化生產,且具有良好的包埋保護效果,具有工業化生產應用的潛力。

發明內容

基于此,為了克服上述現有技術的缺陷,本發明提供了一種益生菌微膠囊及其制備方法和應用,本發明的益生菌微膠囊具有耐酸、穩定的優異性能。

為了實現上述發明目的,本發明采取了以下技術方案:

一種耐酸、穩定的益生菌微膠囊,包括芯材和壁材,所述壁材為含有天然高分子材料和凍干保護劑的混合溶液,所述益生菌與所述混合溶液的質量比為1:1-1:8;所述混合溶液中天然高分子材料的質量百分比為0.5-7.0%,所述混合溶液中凍干保護劑的質量百分比為5.0-15.0%。

在其中一些實施例中,所述益生菌與所述混合溶液的質量比為1:2-1:5。

在其中一些實施例中,所述混合溶液中天然高分子材料的質量百分比為1-5%,所述混合溶液中凍干保護劑的質量百分比為5-12%。

在其中一些實施例中,所述壁材外還涂覆有包衣材料,所述包衣材料為殼聚糖鹽酸鹽。

在其中一些實施例中,所述益生菌為保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌中的一種或幾種;所述凍干保護劑為葡萄糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇、右旋糖酐40和脫脂牛奶中的一種或幾種;所述天然高分子材料為膠凝糖、黃原膠、阿拉伯膠、明膠和海藻酸鈉中的一種或幾種。

在其中一些實施例中,所述凍干保護劑為乳糖、海藻糖、甘油和右旋糖酐40中的一種或幾種;所述天然高分子材料為阿拉伯膠、明膠和海藻酸鈉中的一種或幾種。

本發明還提供了上述益生菌微膠囊的制備方法,包括以下步驟:

1)將經活化增殖培養的益生菌菌液離心,得到益生菌菌泥;

2)將步驟1)所述益生菌菌泥加入至含天然高分子材料和凍干保護劑的混合溶液中,混合均勻,得到菌懸液;所述益生菌菌泥與所述混合溶液的質量比為1:1~8;所述凍干保護劑在所述混合溶液中的質量百分比為5-15%;所述天然高分子材料在所述混合溶液中的質量百分比為0.5-7.0%;

3)步驟2)的菌懸液在微膠囊造粒儀的供入噴嘴系統中形成微滴,滴入固化劑或交聯劑中后,即得到益生菌微膠囊。

在其中一些實施例中,還包括對所述益生菌微膠囊進行包衣30-60min的步驟,所述包衣液為體積百分含量為5.0-10.0%的殼聚糖鹽酸鹽溶液,優選為體積百分含量為6.0-10.0%的殼聚糖鹽酸鹽溶液。

在其中一些實施例中,還包括冷凍干燥的步驟,具體步驟為:將所述益生菌微膠囊放入體積百分比為8.0-18.0%的凍干保護劑溶液中平衡30min后,再在-45℃下預凍3-6h,最后在-40℃下真空冷凍干燥24-40h。

在其中一些實施例中,步驟2)中所述益生菌菌泥與所述水溶液的質量比為1:2~5。

在其中一些實施例中,步驟3)中所述菌懸液經蠕動泵勻速供入微膠囊造粒儀的供入噴嘴系統中,所述蠕動泵泵速為3~15ml·min-1,供入噴嘴系統的震動頻率為600-2500Hz。

在其中一些實施例中,所述蠕動泵泵速10ml·min-1,震動頻率為1200Hz。

在其中一些實施例中,步驟1)中,所述益生菌在MRS肉湯培養基中活化增殖,所述活化條件為35.0-38.0℃,22-26h;所述增殖培養中,接種比例為每100mL培養基中接種2.0-8.0mL菌種;步驟1)中,所述離心條件為0.0-15.0℃,2000-4000r/min離心10-30min。

在其中一些實施例中,步驟3)中所述固化液為0.1M-0.3M的CaCl2溶液,所述固化時間為15-45min。

本發明還提供了上述益生菌微膠囊在制備保健食品、飲料食品、臨床營養制劑、藥物微制劑或化妝品中的應用。

與現有技術相比,本發明具有以下有益效果:

1、本發明采用凍干保護劑與天然高分子材料作為壁材,通過控制凍干保護劑與天然高分子材料在混合溶液中的濃度,使得制備得到的益生菌微膠囊制劑具有較好的穩定性和耐酸性;凍干保護劑的濃度過低,則單體積溶液的凍干保護劑分子過少,菌體不能充分的包裹在凍干保護劑分子中,這樣會達不到最佳的凍干存活率,濃度過高,其滲透壓可能很大,對菌體造成不利的影響,而且,濃度過高也會造成工業成本的提高;而天然高分子材料的濃度過低,則會使得微膠囊在固化過程中成球性差,導致部分益生菌未包埋在微膠囊內部;濃度過高,則天然高分子材料溶液黏度增大,擠出過程可控性低;

2、本發明通過調整益生菌菌泥與混合溶液的質量比,使得得到的微膠囊具有很好的性能;益生菌菌泥與混合溶液的比例中,如果混合溶液比例過低,會不足以完全包裹益生菌,使得活菌數偏低;如果比例過高,等量的菌分散在更多量的微膠囊當中,所以測得的每1.0g凝膠珠中益生菌的數量相比于低比例時就會偏低;

3、本發明的益生菌微膠囊的處方簡單,使用凍干保護劑以及天然高分子材料的混合材料作為本發明的益生菌微膠囊壁材,可以在冷凍干燥過程中對益生菌起到保護作用,既能達到使益生菌休眠的效果,同時又不會使益生菌的活性產生較大的影響,對益生菌的耐酸性和長期儲存性有明顯的改善,所制備的微膠囊粒徑可以根據實驗儀器的參數進行調整,粒徑可控且分布集中;

4、本發明的益生菌微膠囊的制備方法,通過調整噴嘴以及振動頻率調整,使得微膠囊粒徑均一和相等,微膠囊包埋效果好,可以有效提高益生菌制劑的耐酸性和穩定性,操作簡便、工藝參數易控、生產效率高、經濟易行,適合工業化規模生產。

附圖說明

圖1為實施例1中的益生菌微膠囊經冷凍干燥后,600倍掃描電鏡圖;

圖2為實施例2~5中不同保護劑添加比例對嗜熱鏈球菌益生菌微膠囊的凍干存活率的影響;

圖3為實施例6中凍干菌粉和所制備的微膠囊制劑的儲存穩定性對比。A為4℃下凍干菌粉的存活率變化,B為4℃下含有凍干保護劑的存活率變化,C為25℃下凍干菌粉的存活率變化,D為25℃下含有凍干保護劑的存活率變化。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例進一步敘述本發明,本發明未述及之處適用于現有技術。下面給出本發明的具體實施例,但實施例僅是為了進一步詳細敘述本說明,并不限制本發明的權利要求。以下實施例中所使用的試劑或原料,如無特殊說明,均來源于市售。

以下實施例中的益生菌微膠囊以益生菌為芯材,益生菌選自保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸鏈球菌、乳酸乳球菌中的一種或幾種;優選自長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嗜酸鏈球菌中的一種或幾種。在本發明中,活菌數采用平板稀釋法進行計數。

以下實施例中,含有天然高分子材料和凍干保護劑的水溶液所用溶劑為無菌水,且MRS肉湯、混合溶液、殼聚糖鹽酸鹽溶液和交聯劑或者固化劑都經過濕熱滅菌,滅菌溫度為121.0℃,滅菌時間為15min。

以下實施例中的“凍干保護劑”是指可以在冷凍干燥過程及凍干后儲存階段保護菌體抵抗低溫損害的物質。其分類方法有多種:根據物質的種類可以分為糖類、多元醇類、聚合物類、氨基酸類、鹽類等;根據滲透性可以分為高滲透性物質(如甘油、DMSO)、中滲透性物質(如葡萄糖、甘氨酸)和低滲透性物質(如可溶性淀粉、HPMC)等;根據分子量可以分為高分子物質和低分子物質。

其中,海藻糖、右旋糖酐40、甘油、乳糖等具有優異的凍干保護作用。甘油可以起到緩沖作用,降低低溫作用對菌體的損害,而且還能夠在細胞表面形成保護層,減少細胞暴露在介質中的面積,起到保護作用。右旋糖酐能夠聚集在嗜熱鏈球菌周圍,從而能夠有利于細胞膜保持完整并能夠起到平衡滲透壓的作用,使得嗜熱鏈球菌取得較高的凍干存活率。冷凍干燥過程中海藻糖可以在菌體內部聚集二糖尤其是海藻糖分子。這些海藻糖分子能夠代替水分子通過氫鍵與細胞膜上的蛋白質連接從而保證膜在凍干過程中的完整性。

以下是實施例和對比例部分。

實施例1耐酸、穩定的益生菌微膠囊及其制備方法

本實施例提供一種耐酸、穩定的益生菌微膠囊及其制備方法,該制備方法包括以下步驟:

1)菌種活化與增殖培養

將嗜酸鏈球菌種接種到已滅菌的MRS液體培養基中,于37.0℃下培養26h,再按體積比為5.0%的比例(即每100mL培養基中接種5mL菌種)接種于MRS液體培養基中,并在相同條件下活化至第三代,得到菌液。

2)收集菌體

將菌液在10.0℃、3000rpm下離心20min,棄去上清液,獲得菌泥。

3)益生菌微膠囊的制備

稱取8.5g的海藻糖加入到100.0mL的蒸餾水中,攪拌溶解,再稱取3g海藻酸鈉粉末靜置溶解在上述制備的海藻糖溶液中,隨后將所得溶液在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻后,按照質量比為4:1的比例與菌泥混合均勻后,通過微膠囊造粒儀,在蠕動泵泵速10ml·min-1、1200Hz的振動頻率下,形成液滴,垂直滴入0.3M CaCl2溶液中,固化30min,洗滌過濾,備用。

4)殼聚糖鹽酸鹽包衣

稀釋殼聚糖鹽酸鹽至12%(m/v),在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻。將步驟3)所得物加入到殼聚糖鹽酸鹽溶液中,磁力攪拌45min,洗滌過濾,得到殼聚糖鹽酸鹽-海藻糖-海藻酸鈉微膠囊。

5)冷凍干燥

將步驟4)所得微膠囊加入到體積分數為8.5%的海藻糖溶液中,平衡30min,隨后放到-45.0℃冰箱中預凍4h,再在-40.0℃下真空冷凍干燥36h,得到殼聚糖鹽酸鹽-海藻糖-海藻酸鈉微膠囊制劑,即為本實施例的益生菌微膠囊制劑。

采用掃描電鏡觀測微膠囊形態,可以看到在600倍視野下,微膠囊的形態及粒徑均一,對益生菌有良好的包埋效果(圖1)。

實施例2~5耐酸、穩定的益生菌微膠囊及其制備方法

本實施例提供一種耐酸、穩定的益生菌微膠囊及其制備方法,該制備方法包括以下步驟:

1)菌種活化與增殖培養

將保加利亞乳桿菌菌種接種到已滅菌的MRS液體培養基中,于37.0℃下培養20h,再按體積比為5.0%的比例(即每100mL培養基中接種5mL菌種)接種于MRS液體培養基中,并在相同條件下活化至第三代,得到菌液。

2)收集菌體

將菌液在5.0℃、2500rpm下離心20min,棄去上清液,獲得菌泥。

3)益生菌微膠囊的制備

稱取12.0g甘油加入到100.0mL的蒸餾水中,溶解,再稱取4.0g明膠粉末溶解在上述制備的甘油溶液中,靜置溶解。隨后將所得溶液在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻后,按照質量比為1:1(實施例2)、2:1(實施例3)、4:1(實施例4)及5:1(實施例5)的比例與菌泥混合均勻后,通過微膠囊造粒儀,在蠕動泵泵速6ml·min-1、1000Hz的振動頻率下,形成液滴,在垂直滴入硫酸鈉水溶液溶液中,交聯30min,分別制備得到四個不同的處方,洗滌過濾,備用。

4)殼聚糖鹽酸鹽包衣

稀釋殼聚糖鹽酸鹽至8%(m/v),在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻。將步驟3)所得物加入到殼聚糖鹽酸鹽溶液中,磁力攪拌30min,洗滌過濾,得到殼聚糖鹽酸鹽-甘油-明膠微膠囊。

5)冷凍干燥

將步驟4)所得微膠囊加入到體積分數為12%的甘油溶液中,平衡30min,隨后放到-45.0℃冰箱中預凍4h,再在-40.0℃下真空冷凍干燥40h,得到殼聚糖鹽酸鹽-甘油-明膠微膠囊制劑,即為實施例2~5的益生菌微膠囊制劑。

實施例6耐酸、穩定的益生菌微膠囊及其制備方法

本實施例提供一種耐酸、穩定的益生菌微膠囊及其制備方法,該制備方法包括以下步驟:

1)菌種活化與增殖培養

將雙歧桿菌菌種接種到已滅菌的MRS液體培養基中,于38.0℃下培養26h,再按體積比為8.0%的比例(即每100mL培養基中接種8mL菌種)接種于MRS液體培養基中,并在相同條件下活化至第三代,得到菌液。

2)將菌液在0.0℃、4000rpm下離心10min,棄去上清液,獲得菌泥。

3)益生菌微膠囊的制備

稱取5.0g右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸餾水中,溶解。再稱取2.0g海藻酸鈉粉末溶解在上述制備的右旋糖酐40溶液中,靜置溶解。隨后將所得溶液在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻后,按照質量比為4:1的比例與菌泥混合均勻后,通過微膠囊造粒儀,在蠕動泵泵速15ml·min-1、2000Hz的振動頻率下,形成液滴,在垂直滴入0.3M CaCl2溶液中,固化40min,洗滌過濾,備用。

4)殼聚糖鹽酸鹽包衣

稀釋殼聚糖鹽酸鹽至7%(m/v),在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻。將步驟3)所得物加入到殼聚糖鹽酸鹽溶液中,磁力攪拌60min,洗滌過濾,得到殼聚糖鹽酸鹽-右旋糖酐40海藻酸鈉微膠囊。

5)冷凍干燥

將步驟4)所得微膠囊加入到體積分數為5.0%的右旋糖酐40溶液中,平衡30min,隨后放到-45.0℃冰箱中預凍6h,再在-40.0℃下真空冷凍干燥36h,得到殼聚糖鹽酸鹽-右旋糖酐40海藻酸鈉微膠囊制劑,即為實施例6的益生菌微膠囊制劑。

對比例1

本對比例提供一種殼聚糖鹽酸鹽-明膠微膠囊及其制備方法,該制備方法包括以下步驟:

1)菌種活化與增殖培養

將嗜熱鏈球菌菌種接種到已滅菌的MRS液體培養基中,于37.0℃下培養24h,再按體積比為5.0%的比例接種于MRS液體培養基中,即每100mL培養基中接種5mL菌種,并在相同條件下活化至第三代,得到菌液。

2)收集菌體

將菌液在5.0℃、3000rpm下離心15min,棄去上清液,獲得菌泥。菌泥用滅菌純化水重新分散后即獲得芯材;

3)微膠囊的制備

稱取3g明膠溶于100.0mL的蒸餾水中,攪拌溶解,隨后將所得溶液在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻后,按照質量比為2:1的比例與芯材混合均勻,通過微膠囊造粒儀,在600HZ的振動頻率下,滴入硫酸鈉水溶液中,交聯30min,洗滌過濾,備用。

4)殼聚糖鹽酸鹽包衣

稀釋殼聚糖鹽酸鹽至10%(m/v),在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻。將步驟3)所得物加入到殼聚糖鹽酸鹽溶液中,磁力攪拌60min,洗滌過濾,得到殼聚糖鹽酸鹽-明膠微膠囊。

5)冷凍干燥

將步驟4)所得微膠囊放到-45.0℃冰箱中預凍4h,再在-40.0℃下真空冷凍干燥36h,得到嗜熱鏈球菌明膠微膠囊制劑。

對比例2

本對比例提供一種海藻糖-明膠微膠囊及其制備方法,該制備方法包括以下步驟:

1)菌種活化與增殖培養

將雙歧桿菌菌種接種到已滅菌的MRS液體培養基中,于38.0℃下培養28h,再按體積比為6.0%的比例(即每100mL培養基中接種6mL菌種)接種于MRS液體培養基中,并在相同條件下活化至第三代,得到菌液。

2)將菌液在0.0℃、3000rpm下離心15min,棄去上清液,獲得菌泥。

3)益生菌微膠囊的制備

稱取5.0g海藻糖加入到100.0mL的蒸餾水中,溶解。再稱取3.0g海藻酸鈉粉末溶解在上述制備的海藻糖溶液中,靜置溶解。隨后將所得溶液在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻后,按照質量比為4:1的比例與菌泥混合均勻后,通過微膠囊造粒儀,在蠕動泵泵速10ml·min-1、2200Hz的振動頻率下,形成液滴,在垂直滴入硫酸鈉水溶液中,交聯30min,洗滌過濾,備用。

4)冷凍干燥

將步驟3)所得微膠囊加入到體積分數為5.0%的海藻糖溶液中,平衡30min,隨后放到-45.0℃冰箱中預凍6h,再在-40.0℃下真空冷凍干燥36h,得到海藻糖-明膠微膠囊制劑,即為對比例2的益生菌微膠囊制劑。

對比例3

本對比例提供一種殼聚糖鹽酸鹽-右旋糖酐40-海藻酸鈉微膠囊及其制備方法,該制備方法包括以下步驟:

1)菌種活化與增殖培養

將保加利亞乳桿菌菌種接種到已滅菌的MRS液體培養基中,于37.0℃下培養26h,再按體積比為5.0%的比例(即每100mL培養基中接種5mL菌種)接種于MRS液體培養基中,并在相同條件下活化至第三代,得到菌液。

2)將菌液在0.0℃、3000rpm下離心15min,棄去上清液,獲得菌泥。

3)益生菌微膠囊的制備

稱取5.0g右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸餾水中,溶解。再稱取3.0g海藻酸鈉粉末溶解在上述制備的右旋糖酐40溶液中,靜置溶解。隨后將所得溶液在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻后,按照質量比為3:1的比例與菌泥混合均勻后,通過點膠機,利用空壓機空氣壓力將溶液通過針筒崩出,形成液滴,在垂直滴入0.2M CaCl2溶液中,固化30min,洗滌過濾,備用。

4)殼聚糖鹽酸鹽包衣

稀釋殼聚糖鹽酸鹽至8%(m/v),在121.0℃下高壓滅菌15min,放置冷卻。將步驟3)所得物加入到殼聚糖鹽酸鹽溶液中,磁力攪拌40min,洗滌過濾,得到殼聚糖鹽酸鹽-右旋糖酐40-海藻酸鈉微膠囊。

5)冷凍干燥

將步驟4)所得微膠囊加入到體積分數為5.0%的右旋糖酐40溶液中,平衡30min,隨后放到-45.0℃冰箱中預凍5h,再在-40.0℃下真空冷凍干燥38h,得到殼聚糖鹽酸鹽-右旋糖酐40-海藻酸鈉微膠囊制劑,即為實施例6的益生菌微膠囊制劑。

試驗例1本發明實施例和對比例的益生菌微膠囊制劑凍干前后的活性

通過活菌計數法計數,檢測本發明實施例和對比例的益生菌微膠囊制劑凍干前后的活性,結果見表1。

表1凍干前后存活率的比較結果

比例 凍干前的活菌數(CFU/g) 凍干后的活菌數(CFU/g) 實施例1 4.63×109 2.16×108 實施例2 6.63×1011 3.24×108 實施例3 4.86×1010 2.04×109 實施例4 1.32×1010 1.78×109 實施例5 9.36×109 1.02×109 實施例6 6.48×109 8.33×107 對比例1 3.76×109 2.63×106 對比例2 2.86×109 7.63×108 對比例3 6.76×109 8.32×108

通過表1中各實施例與對比例凍干前后的活性結果可得,含有凍干保護劑的組別冷凍干燥之后活性維持較高,對比例1中因不含凍干保護劑,其活性下降較多。實施例2-5中,隨著比例的上升,冷凍干燥前每個單位的微膠囊活菌數呈現將趨勢,這是因為比例的上升會使使用的菌泥量下降,但通過冷凍干燥后活性對比可以發現,原始活菌數較多并不能保證冷凍干燥后活性也高,這可能是因為實施例2中冷凍干燥前一部分益生菌并沒有被包埋到微膠囊里,在冷凍干燥過程中未能受到凍干保護劑的保護。對比例2中,因添加了凍干保護劑,即使在沒有包衣的情況下,凍干保護劑也可以對益生菌產生一定的保護作用,因此其冷凍干燥后結果與實施例相差不大。對比例3中采用了點膠機配合針筒針頭的設備進行制備微膠囊,其凍干前后活性與實施例相比沒有明顯差別,但是在外觀上明顯粒徑較大,且分布不均勻。

試驗例2實施例6的益生菌微膠囊制劑的長期儲存性試驗

將雙歧桿菌凍干菌粉和實施例6的益生菌微膠囊制劑分別在4℃下和25℃下分別儲存0d、30d、60d、90d后,檢測微膠囊中的益生菌活菌數,結果如圖3所示。

由檢測結果可以看出,隨著時間的延長,微膠囊中的活菌數均有下降,在25℃下下降的幅度更大,無論溫度為4.0℃還是25.0℃時,與雙歧桿菌凍干菌粉相比,本發明實施例6的雙歧桿菌微膠囊經過長時間的儲存后,穩定性較佳,活菌數下降并不明顯,仍然能夠保持較好的活菌數(b和d),活菌數達到7.72log CFU/g。說明本發明的益生菌微膠囊具有良好的長期儲存性。

試驗例3本發明實施例和對比例的益生菌微膠囊的耐酸試驗

對對比例和實施例1-6中制備的凍干后的益生菌微膠囊進行酸處理,酸處理方法為:放置在模擬人工胃液中2h,再分離出微膠囊,洗滌后,測定活菌數,結果如表2所示。

表2酸處理后不同微膠囊中的活菌數對比

項目 酸處理前活菌數(CFU/g) 酸處理后活菌數(CFU/g) 實施例1 2.16×108 1.67×107 實施例2 3.24×108 5.73×107 實施例3 2.04×109 5.34×107 實施例4 1.78×109 4.25×107 實施例5 1.02×109 0.45×107 實施例6 8.33×107 6.81×106 對比例1 2.63×106 3.21×105 對比例2 7.63×108 2.73×105 對比例3 8.32×108 3.32×107

由表2數據可以看出,本發明的益生菌微膠囊在經過酸處理后,活菌數能夠保持106CFU/g的活菌數,而對比例1-2的益生菌微膠囊酸處理后活菌數下降較為明顯,且未能達到106CFU/g的最低標準,主要是因為對比例1中因為不含有凍干保護劑因此原始活性較低,而對比例2中因為含有凍干保護劑,原始活性較高,但是沒有包衣的情況下,其耐酸性較實施例有明顯差別。對比例3中采用了點膠機配合針筒針頭的設備進行制備微膠囊,其耐酸性保持也較好,但是在外觀上明顯粒徑較大,且分布不均勻。

說明本發明實施例的益生菌微膠囊能夠保持優異的耐酸性能。

試驗例4本發明實施例和對比例的益生菌微膠囊的穩定性測試

對對比例、實施例1-6中制備的益生菌微膠囊分別進行穩定性測試,測試方法為:在4.0℃下儲存90天,測定活菌數,結果如表3所示。

表3儲存90天后不同微膠囊中的活菌數對比

項目 儲存前活菌數(CFU/g) 儲存90天后活菌數(CFU/g) 實施例1 2.16×108 9.23×107 實施例2 3.24×108 8.73×108 實施例3 2.04×109 6.95×108 實施例4 1.78×109 4.23×108 實施例5 1.02×109 4.11×108 實施例6 8.33×107 7.58×107 對比例1 2.63×106 4.25×105 對比例2 7.63×108 3.73×106 對比例3 8.32×108 5.73×107

由表3數據可以看出,本發明的益生菌微膠囊在4℃下儲存90天后,活菌數能夠保持107CFU/g的活菌數。而對比例1中的益生菌微膠囊在90天后活性下降較為明顯,主要是因為凍干后原始活性較低,對比例2中因為缺少殼聚糖的包衣,在儲存過程中容易受到空氣中水分的影響,降低其存活率,因此活性下降也較快。對比例3中采用了點膠機配合針筒針頭的設備進行制備微膠囊,其長期穩定性有一定的保持效果,但是在外觀上明顯粒徑較大,且分布不均勻。說明本發明的益生菌微膠囊具有優異的儲存穩定性。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合,為使描述簡潔,未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述,然而,只要這些技術特征的組合不存在矛盾,都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式,其描述較為具體和詳細,但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是,對于本領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明構思的前提下,還可以做出若干變形和改進,這些都屬于本發明的保護范圍。因此,本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。

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