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一種鯰魚飼料復合酶及其制備方法.pdf

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一種 鯰魚 飼料 復合 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201611217284.5

申請日:

20161226

公開號:

CN106615692A

公開日:

20170510

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A23K20/189,A23K10/14,A23K50/80 主分類號: A23K20/189,A23K10/14,A23K50/80
申請人: 田崗
發明人: 田崗,邢曉慧
地址: 751500 寧夏回族自治區吳忠市鹽池縣解放街108號
優先權: CN201611217284A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201611217284.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種鯰魚飼料復合酶及其制備方法,以鯰魚營養需求、水體環境為基礎,結合其消化特性,優化原料配方,科學復配具有強大營養性、生物活性和抗氧化性等功能特性的釀酒酵母培養物;可有效補充鈣、鐵及可溶性纖維、具有強大包埋作用、延長飼料復合酶保質期的鈣果提取物;可顯著提高飼料復合酶抗凍效果和穩定性,提高鯰魚飼料耐水性和光澤性,降低飼料含粉率的蒿草籽粉;可大幅提高飼料適口性和消化率的適口劑;可提供豐富營養物質、生物活性物質和植物酶源的小麥芽粉;最終提供一種可顯著提高鯰魚消化率和生產性能、降低飼料系數,防止水體污染、維持優良水質的鯰魚飼料復合酶。

權利要求書

1.一種鯰魚飼料復合酶,主要由以下重量份數的原料制備:酵母培養物20-40份,鈣果提取物15-30份,小麥芽粉10-20份,酸性木聚糖酶10-20份,酸性蛋白酶10-20份,植酸酶10-20份,β-葡聚糖酶6-10份,纖維素酶5-9份,淀粉酶5-9份,β-甘露聚糖酶3-7份,果膠酶3-7份,脂肪酶2-6份,磷酸酯酶2-6份,適口劑1-5份,蒿草籽粉1-3份。2.如權利要求1所述的鯰魚飼料復合酶,其特征在于,所述酵母培養物的制備方法,包括如下步驟:取1環活化后的釀酒酵母tlj2016斜面菌種,接種至裝有100mL種子培養基的500mL三角瓶中培養,在28~30℃、搖床轉速150~200r/min條件下培養25~30h,得到一級種子液;將一級種子液按5~10%(v/v)的接種量,接種至裝有100mL發酵培養基的500mL三角瓶中進行發酵培養,發酵時間25~30h,溫度28~30℃,搖床轉速150~200r/min,得到二級種子液;將二級種子液以5~10%(v/v)接種量接入到裝3L發酵培養基的5L發酵罐恒溫發酵,溫度28~30℃,通風量4~6L/min,轉速150~200r/min,發酵全程調節發酵液pH值為6.0~6.5,當發酵至25~30h時,以每升發酵液25~30mmol的添加量向發酵液中一次性添加L-半胱氨酸,繼續發酵20-30h得到最終發酵液;最終發酵液減壓濃縮至固形物含量為18-26%,冷凍干燥即得酵母培養物;所述釀酒酵母tlj2016保藏編號為CGMCCNo.12789。3.如權利要求2所述的鯰魚飼料復合酶,其特征在于,所述酵母培養物中活菌含量為:7×10-9×10cfu/g。4.如權利要求2所述的鯰魚飼料復合酶,其特征在于,所述最終發酵液中GSH終濃度達到3268-3308mg/L。5.如權利要求2所述的鯰魚飼料復合酶,其特征在于,所述發酵培養基的質量組成為:(NH)SO10g/L,糖蜜150g/L,KHPO·3HO8g/L,KHPO0.5g/L,酵母粉5g/L,玉米漿10g/L,MnSO0.1g/L,KCL0.1g/L,FeSO0.1g/L,MgSO·7HO0.1g/L,余量為水,pH6.0。6.如權利要求1所述的鯰魚飼料復合酶,其特征在于,所述鈣果提取物的制備方法,包括如下步驟:將鈣果莖、鈣果葉和菊粉按質量比5-9:3-6:1-3均勻混合,置于超聲波清洗機中于200W、30KHz清洗3-5min,瀝干,破碎至粒徑0.3-0.7mm,加入破碎物質量0.5-1.5倍的水,調節pH值為5-7,加入混合物質量0.1-0.3%的生物酶,于50-60℃酶解10-15min;酶解液減壓濃縮至固形物含量為40-60%,放入微波干燥機于2000W、130-150℃進行間歇式干燥,使之水分達到4-6%,然后粉碎至粒徑0.4-0.6mm,加入粉碎物質量0.2-0.4%的碳酸氫鈉,均勻混合,調整混合物水分含量為12-14%,室溫、密封靜置2-4h,于螺桿轉速105-115r/min、溫度140-160℃條件擠壓膨化,然后超微粉碎至粒徑0.1-0.3mm即得鈣果提取物;所述生物酶為纖維素酶、漆酶、葡聚糖酶、甘露糖酶、果膠酶按質量比2-4:1-3:1-3:0.5-1.5:0.4-1均勻混合。7.如權利要求1所述的鯰魚飼料復合酶,其特征在于,所述小麥芽粉的制備方法,包括如下步驟:將小麥放在溫度為10-18℃、pH值為6-8的浸泡液中浸泡20-40min,浸泡液含有質量百分比濃度為0.1-0.3%的碳酸氫鈉和0.2-0.4%的復配酶,然后以3-5℃/min的速率升溫至28-32℃,繼續浸泡3-5h,最后以5-7℃/min的速率升溫至50-60℃浸泡5-8min,整個浸泡過程每隔15-20min通風一次,通風壓力0.13-0.15MPa,同時于電場強度3-5kV/cm,脈沖時間100-300μs,脈沖頻率60-80Hz條件進行高壓脈沖電場處理,直至小麥水分含量為40-45%;浸泡后的小麥瀝干,在發芽室內進行暗發芽,暗發芽溫度保持20-24℃,暗發芽時間為20-24h,經發芽后的小麥干燥至水分含量為5-8%,低溫粉碎,過60-80目篩即得小麥芽粉;所述復配酶為纖維素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶按質量比2-4:2-4:1-3:1-2均勻混合。8.如權利要求1所述的鯰魚飼料復合酶,其特征在于,所述適口劑的制備方法,包括如下步驟:按質量比1-3:2-8稱取新鮮羊血和蚯蚓,混勻、絞碎得混合料,加入其質量2-5倍的離子溶液,混勻,調節pH值為6-8,于室溫下在電場強度25-35kV/cm,脈沖時間300-500μs,脈沖頻率200-300Hz條件下進行高壓脈沖電場處理20-30min;然后加入混合料質量0.04-0.08%的復合酶,于50-60℃酶解30-50min,然后降溫至35-45℃酶解40-60min,90℃滅酶10min,降至室溫,除菌過濾得酶解液,酶解液通過1000Da和5000Da的超濾膜過濾,取兩膜之間的透過液,減壓濃縮至固形物含量為18-22%得酶解濃縮液;加入酶解濃縮液質量5-7%的還原糖,依次于112-118℃反應30-50min和135-145℃反應45-65min后;將反應液通過1000Da和5000Da的超濾膜過濾,取兩膜之間的透過液,減壓濃縮至固形物含量為26-30%得反應濃縮液;向反應濃縮液中加入其質量0.2-0.4%的絲膠肽,混勻,冷凍干燥即得適口劑;所述離子溶液為含有鈉離子17-22mg/L、鋅離子15-20mg/L、鉀離子12-14mg/L、鈣離子9-11mg/L和鎂離子6-10mg/L的水溶液;所述復合酶為蚯蚓絲氨酸蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、脂肪酶按質量比4-6:2-4:0.2-0.4:0.1-0.3均勻混合;所述還原糖的質量組成為:木糖:核糖:葡萄糖:果糖:半乳糖=3-5:2-4:1-3:1-3:1-2。9.如權利要求1所述的鯰魚飼料復合酶,其特征在于,所述蒿草籽粉的制備方法,包括如下步驟:將蒿草籽裝盤,首先于電場強度1-3kV/cm高壓靜電處理5-7min;接著在濃度為3-5mg/L的水楊酸溶液中室溫浸泡2-5h,同時在電場強度2-6kV/cm,脈沖時間50-100μs,脈沖頻率100-150Hz條件下進行高壓脈沖電場處理;漂洗、瀝干,于3-5℃靜置18-24h,然后依次在1-3℃冷藏2-4d,-3--5℃冷凍1-3d、-15--18℃冷凍10-15h,立即放在室外自然光照2-4h后立即進行粉碎,凍干,加入凍干粉質量3-8%的小蘇打,均勻混合,過80-100目篩即得蒿草籽粉。10.如權利要求1-9任一所述鯰魚飼料復合酶的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:按照配方,首先依次將蒿草籽粉、適口劑、磷酸酯酶、脂肪酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麥芽粉、酵母培養物、鈣果提取物質量的10-30%加入V型混合罐均勻混合15-25min,攪拌轉速20-40r/min,然后加入剩余鈣果提取物均勻混合20-40min,攪拌轉速40-60r/min,無菌灌裝、密封、包裝即得鯰魚飼料復合酶。

說明書

技術領域

本發明涉及飼料復合酶,具體涉及一種鯰魚飼料復合酶及其制備方法。

背景技術

鯰魚是動物食性魚類,是淡水魚中的優良品種,其營養豐富,每100克魚肉中含水分64.1克、蛋白質14.4克,并含有多種礦物質和微量元素,特別適合體弱虛損、營養不良之人食用。除鯰魚的魚子有雜味不宜食用以外,全身是寶,鯰魚是名貴的營養佳品,早在史書中就有記載,可以和魚翅、野生甲魚相媲美,為魚中珍品。它的食療作用和藥用價值是其它魚類所不具備的,強精壯骨和益壽作用是它獨具的特點。同時鯰魚是催乳的佳品,其味甘性溫,并有滋陰養血、補中氣、開胃、利尿的作用,適合一般人食用,尤其以老、幼、婦女產后及消化功能不佳的人最為適用,具有廣闊的市場前景和發展潛力,成為近幾年養殖戶關注的熱點。

鯰魚和其它魚類一樣,鯰魚作為一種動物食性魚種,不需要維持恒定的體溫,生長所需能量低,可攝食天然餌料,通過鰓、皮膚吸收無機鹽,并不費力地排除廢物,導致人工飼料相對節省礦物質;鯰魚消化器官分化簡單且短,消化道與體長之比要比陸生動物小許多,消化腺不發達能力差,不能分泌纖維素酶,基本不能消化粗纖維;蛋白酶、淀粉酶分泌不足,對蛋白質、碳水化合物利用能力差;雖然對脂肪利用能力強,但主要需要不飽和脂肪酸;對蛋白質要求高,鈣磷比例1:1-1.5,維生素(B族維生素尤其B1,B2、維生素C,維生素A)需要量大等等,相對于畜禽飼料復合酶的復配比較復雜。

在鯰魚飼料中添加功能性飼料復合酶可:1)降解在鯰魚飼料中存在的抗營養因子。這些物質不能被鯰魚內源酶降解,從而干擾鯰魚的正常代謝,導致鯰魚消化不良,生產性能下降。2)提高淀粉、蛋白質和礦物質的利用率。這些物質或者被富含纖維的細胞壁包圍,或者以某些不能被鯰魚消化的結構形式存在(例如在植物飼料原料中,大量的磷以植酸磷的形式存在)。3)在原料中降解某些特定的化學鍵。這些化學鍵不能被鯰魚自身的酶所降解,加入外源酶以后可以釋放更多的營養物。4)由于幼齡鯰魚自身消化系統還不成熟,內源酶不足添加外源酶可以提高飼料消化率,防止出現消化不良癥狀。除了可以提高日糧的利用率以外,加酶還可以減少飼料原料之間的差異,提高飼料配方的精確性,同時還可以提高鯰魚生長的整齊性,減少管理成本,提高經濟效益。使用酶制劑還可以保護環境。由于飼料的利用率提高了,相應的糞便排放量下降了。在效果比較明顯的情況下,糞便的排放量可以減少20%左右。對于植酸磷,可以大幅度減少磷對水體環境的污染。

中國專利CN 106071399 A公開了一種鯰魚飼料,包括:大豆粉、黃豆粉、黑豆粉、小麥粉、小米粉、黃米粉、江米粉、玉米粉、米糠粉、燕麥粉、芝麻粉、亞麻仁粉、蛋殼、蟹殼、雞胸肉、葵花籽、油菜籽、魚油、胡蘿卜、復合微量元素、檸檬酸、乳酸、牡蠣粉、魚粉、谷胱甘肽、磷脂、維生素C、維生素E、維生素A、葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅、乙酸、DHA、植物酶和褐藻膠。該發明公開的魚飼料營養豐富,富含多種氨基酸、蛋白質和微量元素,同時富含多種有機酸和酶,不僅提高了魚的成活率,而且能有效改善的魚的肉質。

中國專利CN 103202408 B公開了一種環保營養型鮻魚復合飼料,旨在提供一種提高鮻魚的生長性能和飼料利用率,降低養殖廢棄物對養殖環境的污染的復合飼料;其技術方案是:該飼料由下述組分構成:魚粉3~10%、大豆粕10~25%、棉仁粕5~15%、菜粕5~15%、面粉15~25%、啤酒酵母5~15%、烏賊膏1~5%、干白酒糟10~25%、洗米糠5~15%、大豆磷脂油2~10%、誘食劑0.4~1%、復合維生素0.2~0.5%、復合礦物質1~3%、磷酸二氫鈣1~3%、食鹽0.05~0.15%、防霉劑0.02~0.06%、氯化膽堿0.1~0.5%、維生素C醋酸酯0.2~0.5%、β-葡聚糖0.01~0.05%、維生素E 0.01~0.05%、耐高溫植酸酶0.01~0.05%;屬于魚飼料技術領域。

中國專利CN 104543450 A公開了一種發酵鯰魚飼料,由下列重量份的原料制成:黃豆面80-90、葵花粕20-25、玉米蛋白粉6-8、紅棗粉10-14、牡蠣肉10-15、魷魚片5-10、豆腐乳13-17、桃仁5-7、玉米莖葉10-12、檸檬13-16、人參花1-2、棕櫚葉2-3、韭菜花2-3、蛋黃粉7-9、黃油3-4、酵母菌2-3、誘食劑3-4、水適量;該發明的發酵鯰魚飼料,添加的牡蠣肉、魷魚片富含蛋白質、鈣等多種礦物質等多種營養成分。添加的檸檬可以起到抗菌、清熱、促食欲的作用。制得的鯰魚飼料富含鯰魚所需各種蛋白質、脂肪、維生素和礦物質,配比合適,加快鯰魚的生長,提高機體免疫力以及組織代謝能力。

上述公開的魚飼料中添加的酶制劑為單酶,并復配了釀酒酵母,但消化率和飼料利用率仍不很理想。

中國專利CN 105581024 A公開了一種魚飼料,包括下述重量份數的原料組成的:麥麩100-200、豆粕50-100、玉米淀粉10-50、酵母3-6、海藻粉20-30、復合維生素1-5、礦物元素1-5、復合酶制劑1-3;各成分功能互補,協同配合,可滿足魚苗飼養和生長的營養需求,其中,利用麥麩和豆粕作為主要原料,成本較低,并利用海藻粉提高飼料蛋白含量,可海藻粉內富集微量元素,與復合維生素、礦物元素、復合酶制劑協同作用,可補充更多蛋白質,提高魚肉品質,提高機質和機體的免疫力,預防疾病的發生,提高魚的生長速度,降低飼養成本,所述復合酶制劑為木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶,按比例1:1:1:1制成。

上述公開的魚飼料中添加的復合酶單酶種類不全面,且酵母菌功能性差,分泌的酶系單一,飼料消化利用率仍不理想。

因此,結合鯰魚消化特性、營養需求和水體環境等因素,制備一種飼料系數低、消化率高、生產性能好的鯰魚飼料復合酶勢在必行。

發明內容

本發明所解決的技術問題是克服現有鯰魚飼料復合酶的缺陷,以鯰魚營養需求、水體環境為基礎,結合其消化特性,優化原料配方,科學復配具有強大營養性、生物活性和抗氧化性等功能特性的釀酒酵母培養物;可有效補充鈣、鐵及可溶性纖維、具有強大包埋作用、延長飼料復合酶保質期的鈣果提取物;可顯著提高飼料復合酶抗凍效果和穩定性,提高鯰魚飼料耐水性和光澤性,降低飼料含粉率的蒿草籽粉;可大幅提高飼料適口性和消化率的適口劑;可提供豐富營養物質、生物活性物質和植物酶源的小麥芽粉;最終提供一種可有效降解鯰魚飼料中的抗營養因子,促進淀粉、蛋白質和礦物質等營養物質的利用率,提高鯰魚的蛋白質水平、機體抗氧化活性和消化吸收率,顯著提高鯰魚消化率和生產性能、降低飼料系數,防止水體污染、維持優良水質的鯰魚飼料復合酶。

為了達到上述目的,本發明采用以下技術方案:

一種鯰魚飼料復合酶,主要由以下重量份數的原料制備:

酵母培養物20-40份,鈣果提取物15-30份,小麥芽粉10-20份,酸性木聚糖酶10-20份,酸性蛋白酶10-20份,植酸酶10-20份,β-葡聚糖酶6-10份,纖維素酶5-9份,淀粉酶5-9份,β-甘露聚糖酶3-7份,果膠酶3-7份,脂肪酶2-6份,磷酸酯酶2-6份,適口劑1-5份,蒿草籽粉1-3份;

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷酸酯酶均為食品級酶制劑;

進一步地,所述酵母培養物是以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)tlj2016為出發菌經逐級擴培、發酵而制備;

優選地,所述酵母培養物的制備方法,包括如下步驟:取1環活化后的釀酒酵母tlj2016斜面菌種,接種至裝有100mL種子培養基的500mL三角瓶中培養,在28~30℃、搖床轉速150~200r/min條件下培養25~30h,得到一級種子液;將一級種子液按5~10%(v/v)的接種量,接種至裝有100mL發酵培養基的500mL三角瓶中進行發酵培養,發酵時間25~30h,溫度28~30℃,搖床轉速150~200r/min,得到二級種子液;將二級種子液以5~10%(v/v)接種量接入到裝3L發酵培養基的5L發酵罐恒溫發酵,溫度28~30℃,通風量4~6L/min,轉速150~200r/min,發酵全程調節發酵液pH值為6.0~6.5,當發酵至25~30h時,以每升發酵液25~30mmol的添加量向發酵液中一次性添加L-半胱氨酸,繼續發酵20-30h得到最終發酵液;最終發酵液減壓濃縮至固形物含量為18-26%,冷凍干燥即得酵母培養物;

所述最終發酵液中GSH終濃度達到3268-3308mg/L;

所述酵母培養物中活菌含量為:7×1012-9×1012cfu/g;

所述種子培養基的質量組成為:(NH4)2SO4 6g/L,葡萄糖35g/L,K2HPO4·3H2O 3g/L,KH2PO4 0.5g/L,酵母粉11g/L,MnSO4 0.1g/L,KCL 0.1g/L,FeSO4 0.1g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,余量為水,pH 6.0;

所述發酵培養基的質量組成為:(NH4)2SO4 10g/L,糖蜜150g/L,K2HPO4·3H2O 8g/L,KH2PO4 0.5g/L,酵母粉5g/L,玉米漿10g/L,MnSO4 0.1g/L,KCL 0.1g/L,FeSO4 0.1g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,余量為水,pH 6.0。

所述釀酒酵母具體為釀酒酵母tlj2016,該菌株已于2016年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No.12789,保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所,郵編100101;

所述釀酒酵母tlj2016具有以下特性:1)對葡萄糖的耐受能力達到300g/L,利于其在高濃度葡萄糖條件下生產GSH;2)在5L發酵罐中發酵生產GSH終濃度達到3308mg/L;3)耐受L-半胱氨酸的能力特強,在5mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能緩慢生長,在40mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能保持GSH大量合成;4)耐鹽能力達到18%,有利于擴展其應用領域。

進一步地,所述鈣果提取物是以鈣、鐵和膳食纖維含量較高的鈣果莖、鈣果葉和菊粉為原料,經超聲清洗、生物酶酶解、微波干燥、擠壓膨化、超微粉碎而制得;其可溶性纖維素含量高、生物活性強、對鯰魚體內益生菌群有重要的、積極作用的纖維,特別是可補充鈣鐵、延長飼料的保質期,與普通膳食纖維相比,其功能性、生物活性更強大;

優選地,所述鈣果提取物的制備方法,包括如下步驟:將鈣果莖、鈣果葉和菊粉按質量比5-9:3-6:1-3均勻混合,置于超聲波清洗機中于200W、30KHz清洗3-5min,瀝干,破碎至粒徑0.3-0.7mm,加入破碎物質量0.5-1.5倍的水,調節pH值為5-7,加入混合物質量0.1-0.3%的生物酶,于50-60℃酶解10-15min;酶解液減壓濃縮至固形物含量為40-60%,放入微波干燥機于2000W、130-150℃進行間歇式干燥,使之水分達到4-6%,然后粉碎至粒徑0.4-0.6mm,加入粉碎物質量0.2-0.4%的碳酸氫鈉,均勻混合,調整混合物水分含量為12-14%,室溫、密封靜置2-4h,于螺桿轉速105-115r/min、溫度140-160℃條件擠壓膨化,然后超微粉碎至粒徑0.1-0.3mm即得鈣果提取物;

所述生物酶為纖維素酶、漆酶、葡聚糖酶、甘露糖酶、果膠酶按質量比2-4:1-3:1-3:0.5-1.5:0.4-1均勻混合。

進一步地,所述小麥芽粉的制備方法,包括如下步驟:將小麥放在溫度為10-18℃、pH值為6-8的浸泡液中浸泡20-40min,浸泡液含有質量百分比濃度為0.1-0.3%的碳酸氫鈉和0.2-0.4%的復配酶,然后以3-5℃/min的速率升溫至28-32℃,繼續浸泡3-5h,最后以5-7℃/min的速率升溫至50-60℃浸泡5-8min,整個浸泡過程每隔15-20min通風一次,通風壓力0.13-0.15MPa,同時于電場強度3-5kV/cm,脈沖時間100-300μs,脈沖頻率60-80Hz條件進行高壓脈沖電場處理,直至小麥水分含量為40-45%;浸泡后的小麥瀝干,在發芽室內進行暗發芽,暗發芽溫度保持20-24℃,暗發芽時間為20-24h,經發芽后的小麥干燥至水分含量為5-8%,低溫粉碎,過60-80目篩即得小麥芽粉;

所述復配酶為纖維素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶按質量比2-4:2-4:1-3:1-2均勻混合。

進一步地,所述適口劑是科學復配羊血和蚯蚓,經高壓脈沖電場、復合酶分段酶解、超濾、分段反應、冷凍干燥等低溫加工技術而制備的兼有羊血和蚯蚓風味的復合風味呈味肽,不僅可大大提高鯰魚飼料的適口性,提高飼料利用率,而且具有較強抗氧化效果,消除自由基;

優選地,所述適口劑的制備方法,包括如下步驟:按質量比1-3:2-8稱取新鮮羊血和蚯蚓,混勻、絞碎得混合料,加入其質量2-5倍的離子溶液,混勻,調節pH值為6-8,于室溫下在電場強度25-35kV/cm,脈沖時間300-500μs,脈沖頻率200-300Hz條件下進行高壓脈沖電場處理20-30min;然后加入混合料質量0.04-0.08%的復合酶,于50-60℃酶解30-50min,然后降溫至35-45℃酶解40-60min,90℃滅酶10min,降至室溫,除菌過濾得酶解液,酶解液通過1000Da和5000Da的超濾膜過濾,取兩膜之間的透過液,減壓濃縮至固形物含量為18-22%得酶解濃縮液;加入酶解濃縮液質量5-7%的還原糖,依次于112-118℃反應30-50min和135-145℃反應45-65min后;將反應液通過1000Da和5000Da的超濾膜過濾,取兩膜之間的透過液,減壓濃縮至固形物含量為26-30%得反應濃縮液;向反應濃縮液中加入其質量0.2-0.4%的絲膠肽,混勻,冷凍干燥即得適口劑。

優選地,所述離子溶液為含有鈉離子17-22mg/L、鋅離子15-20mg/L、鉀離子12-14mg/L、鈣離子9-11mg/L和鎂離子6-10mg/L的水溶液;

優選地,所述復合酶為蚯蚓絲氨酸蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、脂肪酶按質量比4-6:2-4:0.2-0.4:0.1-0.3均勻混合;

優選地,所述還原糖為木糖、核糖、葡萄糖、果糖、半乳糖中的一種或幾種;

更優選地,所述還原糖的質量組成為:木糖:核糖:葡萄糖:果糖:半乳糖=3-5:2-4:1-3:1-3:1-2。

進一步地,所述蒿草籽粉是以蒿草籽為原料,經高壓靜電、高壓脈沖電場輔助水楊酸浸泡、冷藏冷凍處理后粉碎、凍干而制得;

優選地,所述蒿草籽粉的制備方法,包括如下步驟:將蒿草籽裝盤,首先于電場強度1-3kV/cm高壓靜電處理5-7min;接著在濃度為3-5mg/L的水楊酸溶液中室溫浸泡2-5h,同時在電場強度2-6kV/cm,脈沖時間50-100μs,脈沖頻率100-150Hz條件下進行高壓脈沖電場處理;漂洗、瀝干,于3-5℃靜置18-24h,然后依次在1-3℃冷藏2-4d,-3--5℃冷凍1-3d、-15--18℃冷凍10-15h,立即放在室外自然光照2-4h后立即進行粉碎,凍干,加入凍干粉質量3-8%的小蘇打,均勻混合,過80-100目篩即得蒿草籽粉。

本發明另一目的是提供上述鯰魚飼料復合酶的制備方法:包括如下步驟:按照配方,首先依次將蒿草籽粉、適口劑、磷酸酯酶、脂肪酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麥芽粉、酵母培養物、鈣果提取物質量的10-30%加入V型混合罐均勻混合15-25min,攪拌轉速20-40r/min,然后加入剩余鈣果提取物均勻混合20-40min,攪拌轉速40-60r/min,無菌灌裝、密封、包裝即得鯰魚飼料復合酶。

有益效果:

本發明鯰魚飼料復合酶以鯰魚營養需求、水體環境為基礎,結合其消化特性,優化原料配方,科學復配具有強大營養性、生物活性和抗氧化性等功能特性的釀酒酵母培養物;可有效補充鈣、鐵及可溶性纖維、具有強大包埋作用、延長飼料復合酶保質期的鈣果提取物;可顯著提高飼料復合酶抗凍效果和穩定性,提高鯰魚飼料耐水性和光澤性,降低飼料含粉率的蒿草籽粉;可大幅提高飼料適口性和消化率的適口劑;可提供豐富營養物質、生物活性物質和植物酶源的小麥芽粉;最終提供一種可有效降解鯰魚飼料中的抗營養因子,促進淀粉、蛋白質和礦物質等營養物質的利用率,提高鯰魚的蛋白質水平、機體抗氧化活性和消化吸收率,顯著提高鯰魚消化率和生產性能、降低飼料系數,防止水體污染、維持優良水質的飼料復合酶。1)飼喂試驗表明:以同樣的飼喂及馴化方法,同樣的日常管理,同樣的魚塘條件和同樣的土鯰魚魚種及投放量等情況下飼喂鯰魚,以相同的添加量添加本發明制備的鯰魚飼料復合酶的飼料適口性強,成魚規格差距小,整齊,進而鯰魚撕咬、競爭覓食情況輕微,死亡率低僅為3%,比對照組市售飼料復合酶降低75%;抗病性強,發病率僅為3%,比對照組市售飼料復合酶降低66.67%;消化率高,尾均增重強,比對照組市售飼料復合酶提高55.74%;飼料系數低,料肉比低,比對照組市售飼料復合酶降低36.09%;養殖效益顯著,同樣投放量情況下產量提高59.58%,大大降低了養殖成本,具有較好的實用性和先進性。2)穩定性試驗表明:在-12℃和40℃條件下儲存12個月,本發明鯰魚飼料復合酶與市售飼料復合酶相比,其蛋白酶酶活損失分別降低43%和18.9%,具有優良的溫度儲存性,酶活力非常穩定,同時也說明本發明鯰魚飼料復合酶中含有的其它生物活性物質的損失率極低,具有較好的抗凍、抗熱性能,產品質量穩定,保質期長。具體技術效果見實施例7-11;具體技術原理如下:

1.本發明釀酒酵母培養物中的活菌含量高達7×1012-9×1012cfu/g,最終發酵液中GSH終濃度達到3268-3308mg/L,不僅提高了鯰魚飼料的蛋白質水平和酶活性,而且提高了鯰魚飼料的生物活性和抗氧化性,極大地顯現了飼料復合酶的功能特性,釀酒酵母tlj2016除具備普通酵母的益生性外還具有以下功能特性:1)對葡萄糖的耐受能力達到300g/L,利于其在高濃度葡萄糖條件下生產GSH;2)在5L發酵罐中發酵生產GSH終濃度達到3308mg/L;3)耐受L-半胱氨酸的能力特強,在5mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能緩慢生長,在40mmol/L L-半胱氨酸作用下仍能保持GSH大量合成;4)耐鹽能力達到18%;將其科學復配于鯰魚飼料中可進一步:(1)清除自由基、過氧化物、重金屬及黃曲霉毒素等毒物;(2)參與氨基酸(谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸)的轉運;(3)利于鐵的吸收、硒的吸收、鈣的吸收,谷胱甘肽還可以使飼料中的過氧化脂肪酸在吸收時或吸收后恢復為正常的脂肪;(4)保護胃腸道黏膜上皮,防止因炎癥、局部缺血、氧化物質等對腸黏膜的損傷;(5)貯存并提供其組成氨基酸(尤其是半胱氨酸);(6)參與蛋白質和DNA的合成;(7)作為還原物質,利于維生素E、維生素C的還原,維持巰基酶活性。

2.本發明制備的蒿草籽粉在提供豐富營養物質的同時具有較強的粘結性,非常適合制備鯰魚顆粒飼料,將其加入鯰魚飼料中可大大提高顆粒飼料的成粒性和完整性,制備的鯰魚飼料耐水性好,光澤性強,含粉率低,飼料利用率高;同時蒿草耐寒性強,(蒿草籽)蒿草種子富含抗凍蛋白,經高壓靜電處理、高壓脈沖電場輔助水楊酸誘導、低溫分段脅迫處理和自然光照有機結合,使得本身含有抗凍基質的活性種子在外界環境的脅迫和誘導下,抗凍基質成分得到了最全面、最豐富的合成和積累,提高了抗凍蛋白的含量,進而提高了飼料復合酶的抗凍效果和穩定性,延長了飼料復合酶的保質期。與鈣果提取物、適口劑等其它原料科學復配,效果更佳。

3.本發明制備的鈣果提取物是以含鈣、鐵和膳食纖維含量較高的鈣果莖、鈣果葉和菊粉為原料,經超聲清洗、生物酶酶解、微波干燥、擠壓膨化、超微粉碎而制得;其可溶性纖維素含量高、生物活性強、對鯰魚體內益生菌群有重要的、積極作用的纖維,特別是可補充鈣鐵、延長飼料的保質期,與普通膳食纖維相比,其功能性、生物活性更強大;同時經超微粉碎后,加入一定量的碳酸氫鈉,經調整水分后密封靜置,可顯著增強膳食纖維的膨化度和可溶性膳食纖維的含量,提高了膳食纖維的功能性,所得鈣果提取物增稠性更強,比單一方法制備的改性膳食纖維提高40-50%,且不受酸、堿、鹽的影響,顯著提高了飼料的耐水性;可溶性纖維素含量高,比單一方法制備的改性膳食纖維提高20-40%,更容易被乳酸菌利用,提高乳酸菌在動物體腸道的生長及繁殖能力,增加益生菌菌群的種類和數量,降低動物體腸道pH值,改善動物體腸道微生態環境;吸附能力強,經改性后,纖維素的比表面積增大,網格結構豐富,吸附力增強,螯合、吸附膽固醇和膽汁酸類的有機分子能力更強、抑制動物體對他們的吸收;離子交換能力增強,對金屬元素,特別是重金屬元素吸附效果更強,有效防止了動物體重金屬中毒;調節和維持腸道菌群的定植時間,增強腸道的消化和吸收能力,提高機體免疫力;有效促進胃腸蠕動,減緩并消除胃脹、腹脹等不良反應;強大的包埋作用可防止環境(氧氣、溫度、光照、水分活度等)因素對飼料復合酶質量的影響,進一步穩定了飼料復合酶的生物活性和穩定性,延長了飼料復合酶的保質期。

4.本發明制備的適口劑是科學復配羊血和蚯蚓,經高壓脈沖電場、復合酶分段酶解、超濾、分段反應、冷凍干燥等低溫加工技術而制備的兼有羊血和蚯蚓風味的復合風味呈味肽,呈味物質豐富,特別適合鯰魚口味,不僅可以改善鯰魚飼料的適口性,而且還可以全面促進鯰魚飼料營養成分的消化和吸收,提高飼料利用率,從而大大減少排泄物中的有機物、氮磷等營養物質的排出量,減少飼料中未消化物質對水環境的污染。全程采用低溫加工技術,避免了因高溫而造成的蛋白變性和其它生物活性物質及香味物質損失,采用高壓脈沖電場技術,不僅可防止提取過程雜菌污染,而且大大疏松了羊血和蚯蚓蛋白及組織間的結構,增加了組織的通透性,有利于后續復合酶的滲入和接觸,提高了酶解效率和風味肽的收得率,同時也可直接增加可溶性風味肽的溶出,相對于現有高溫預處理更高效、更環保;采用分段酶解和分段美拉德反應,進一步提高了復合風味適口劑的收率;離子溶液和復合酶的科學復配進一步提高了復合酶的活性,提高了酶解效率,降低了酶制劑的使用量,最大限度地提高了復合風味肽的獲取;采用冷凍干燥,特別向反應液科學復配了具有優良抗凍效果的絲膠肽,大大減少了適口劑的氧化損失和冷凍損失,提高了適口劑的抗氧化性,最終制得一種不僅可大大提高鯰魚飼料的適口性,提高飼料利用率,而且具有較強抗氧化效果,消除自由基的適口劑。

5.本發明制備的小麥芽粉對浸泡過程的小麥進行高壓脈沖電場處理有效防止了浸泡液污染雜菌,避免了產生臭味滲透到小麥芽粉產品中,同時,可有效增強谷物種皮細胞壁和細胞膜的相對透性、提高全谷物種子的吸水率,促進種子提前萌發,提高超氧陰離子自由基的產生速率及三磷酸腺苷(ATP)含量,促進發芽前期小麥種子多種生物酶的激活和釋放、胚乳溶解及功能性營養成分、生物活性成分、抗氧化成分的合成,促進了種子的呼吸代謝作用,加快了營養及功能性物質、生物活性成分、抗氧化成分的富集進程,縮短了富集時間,提高了營養及功能性物質、生物活性成分、抗氧化成分的含量,與分段浸泡、急速升溫、生物酶解工藝有機結合,可進一步降解種皮纖維素及半纖維素結構,增加種皮通透性,激活各種生物活性物質(內源酶等)活力最強,富集量更大,可溶性纖維素含量隨之增大,為小麥芽粉中的鯰魚飼料提供了營養因子,效果更佳顯著;將分段浸泡、高壓脈沖電場技術和生物酶解有機結合,縮短了浸泡時間,提高了發芽率和發芽均一度;可最大限度保持小麥芽粉熱敏性物質含量,尤其是抗氧化物質(谷胱甘肽、六磷酸肌醇、維生素C、多酚等),最大限度地保證小麥芽粉的天然色澤、口感和風味,同時還可起到殺菌作用;特別是經高溫短時適度殺胚后,在不影響小麥芽種子的生物活性的情況下,隨著水分的吸收,小麥芽胚被抑制但不影響各項酶及生物活性物質的增長和胚乳的溶解,芽生長很短,呼吸作用弱,發芽損失低,提高了小麥芽粉的產量和質量,顯著提高了飼料復合酶的功能特性、消化特性和適口性。

6.本發明鯰魚飼料復合酶的制備方法工藝簡單,對設備要求低,將具有強大包埋作用的鈣果提取物分兩次添加、混合,可將其它酶制劑及生物活性物質完全包埋其中,最大限度地降低了飼料復合酶在鯰魚飼料制粒、貯藏過程中的損失,提高了飼料復合酶的生物活性和質量穩定性,有效延長了飼料復合酶的保質期。

需要說明的是本發明鯰魚飼料復合酶及其制備方法的技術效果是各組分技術特征和方法特征相互協同、相互作用的結果,并非簡單的技術特征(組分功能)的疊加,各組分技術特征的有機結合和協同產生的效果遠遠超過各單一技術特征功能和效果的疊加,具有較好的先進性和實用性。

具體實施方式

下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明,本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外,實施方案應理解為說明性的,而非限制本發明的范圍,本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言,在不背離本發明實質和范圍的前提下,對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。

實施例1原料制備

1.酵母培養物的制備

所述酵母培養物的制備方法,包括如下步驟:取1環活化后的釀酒酵母tlj2016斜面菌種,接種至裝有100mL種子培養基的500mL三角瓶中培養,在30℃、搖床轉速150r/min條件下培養28h,得到一級種子液;將一級種子液按8%(v/v)的接種量,接種至裝有100mL發酵培養基的500mL三角瓶中進行發酵培養,發酵時間28h,溫度30℃,搖床轉速180r/min,得到二級種子液;將二級種子液以8%(v/v)接種量接入到裝3L發酵培養基的5L發酵罐恒溫發酵,溫度30℃,通風量5L/min,轉速200r/min,發酵全程調節發酵液pH值為6.0~6.5,當發酵至30h時,以每升發酵液28mmol的添加量向發酵液中一次性添加L-半胱氨酸,繼續發酵25h得到最終發酵液;最終發酵液減壓濃縮至固形物含量為22%,冷凍干燥即得酵母培養物;

所述最終發酵液中GSH終濃度達到3308mg/L;

所述酵母培養物中活菌含量為:9×1012cfu/g;

所述種子培養基的質量組成為:(NH4)2SO4 6g/L,葡萄糖35g/L,K2HPO4·3H2O 3g/L,KH2PO4 0.5g/L,酵母粉11g/L,MnSO4 0.1g/L,KCL 0.1g/L,FeSO4 0.1g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,余量為水,pH 6.0;

所述發酵培養基的質量組成為:(NH4)2SO4 10g/L,糖蜜150g/L,K2HPO4·3H2O 8g/L,KH2PO4 0.5g/L,酵母粉5g/L,玉米漿10g/L,MnSO4 0.1g/L,KCL 0.1g/L,FeSO4 0.1g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,余量為水,pH 6.0。

2.小麥芽粉的制備

所述小麥芽粉的制備方法,包括如下步驟:將小麥放在溫度為15℃、pH值為7的浸泡液中浸泡30min,浸泡液含有質量百分比濃度為0.2%的碳酸氫鈉和0.3%的復配酶,然后以4℃/min的速率升溫至30℃,繼續浸泡4h,最后以6℃/min的速率升溫至55℃浸泡7min,整個浸泡過程每隔18min通風一次,通風壓力0.14MPa,同時于電場強度4kV/cm,脈沖時間200μs,脈沖頻率70Hz條件進行高壓脈沖電場處理,直至小麥水分含量為42%;浸泡后的小麥瀝干,在發芽室內進行暗發芽,暗發芽溫度保持22℃,暗發芽時間為22h,經發芽后的小麥干燥至水分含量為6%,低溫粉碎,過80目篩即得小麥芽粉;

所述復配酶為纖維素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶按質量比3:3:2:1.5均勻混合。

3.鈣果提取物的制備

所述鈣果提取物的制備方法,包括如下步驟:將鈣果莖、鈣果葉和菊粉按質量比7:5:2均勻混合,置于超聲波清洗機中于200W、30KHz清洗4min,瀝干,破碎至粒徑0.5mm,加入破碎物質量1倍的水,調節pH值為6,加入混合物質量0.2%的生物酶,于55℃酶解12min;酶解液減壓濃縮至固形物含量為50%,放入微波干燥機于2000W、140℃進行間歇式干燥,使之水分達到5%,然后粉碎至粒徑0.5mm,加入粉碎物質量0.3%的碳酸氫鈉,均勻混合,調整混合物水分含量為13%,室溫、密封靜置3h,于螺桿轉速110r/min、溫度150℃條件擠壓膨化,然后超微粉碎至粒徑0.2mm即得鈣果提取物;

所述生物酶為纖維素酶、漆酶、葡聚糖酶、甘露糖酶、果膠酶按質量比3:2:2:1:0.7均勻混合。

4.適口劑的制備

所述適口劑的制備方法,包括如下步驟:按質量比2:5稱取新鮮羊血和蚯蚓,混勻、絞碎得混合料,加入其質量4倍的離子溶液,混勻,調節pH值為7,于室溫下在電場強度30kV/cm,脈沖時間400μs,脈沖頻率250Hz條件下進行高壓脈沖電場處理25min;然后加入混合料質量0.06%的復合酶,于55℃酶解40min,然后降溫至40℃酶解50min,90℃滅酶10min,降至室溫,除菌過濾得酶解液,酶解液通過1000Da和5000Da的超濾膜過濾,取兩膜之間的透過液,減壓濃縮至固形物含量為20%得酶解濃縮液;加入酶解濃縮液質量6%的還原糖,依次于115℃反應40min和140℃反應55min后;將反應液通過1000Da和5000Da的超濾膜過濾,取兩膜之間的透過液,減壓濃縮至固形物含量為28%得反應濃縮液;向反應濃縮液中加入其質量0.3%的絲膠肽,混勻,冷凍干燥即得適口劑。

所述離子溶液為含有鈉離子20mg/L、鋅離子18mg/L、鉀離子13mg/L、鈣離子10mg/L和鎂離子8mg/L的水溶液;

所述復合酶為蚯蚓絲氨酸蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、脂肪酶按質量比5:3:0.3:0.2均勻混合;

所述還原糖的質量組成為:木糖:核糖:葡萄糖:果糖:半乳糖=4:3:2:2:1.5。

5.蒿草籽粉的制備

所述蒿草籽粉的制備方法,包括如下步驟:將蒿草籽裝盤,首先于電場強度2kV/cm高壓靜電處理6min;接著在濃度為4mg/L的水楊酸溶液中室溫浸泡4h,同時在電場強度4kV/cm,脈沖時間80μs,脈沖頻率120Hz條件下進行高壓脈沖電場處理;漂洗、瀝干,于4℃靜置21h,然后依次在2℃冷藏3d,-4℃冷凍2d、-16℃冷凍12h,立即放在室外自然光照3h后立即進行粉碎,凍干,加入凍干粉質量5%的小蘇打,均勻混合,過80目篩即得蒿草籽粉。

以下實施例2-6所使用的酵母培養物、小麥芽粉、鈣果提取物、適口劑、蒿草籽粉均為實施例1制備,其它原料均為市購。

實施例2

一種鯰魚飼料復合酶,主要由以下重量份數的原料制備:

酵母培養物30份,鈣果提取物22份,小麥芽粉15份,酸性木聚糖酶15份,酸性蛋白酶15份,植酸酶15份,β-葡聚糖酶8份,纖維素酶7份,淀粉酶7份,β-甘露聚糖酶5份,果膠酶5份,脂肪酶4份,磷酸酯酶4份,適口劑3份,蒿草籽粉2份;

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷酸酯酶均為食品級酶制劑;

制備方法:包括如下步驟:按照配方,首先依次將蒿草籽粉、適口劑、磷酸酯酶、脂肪酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麥芽粉、酵母培養物、鈣果提取物質量的20%加入V型混合罐均勻混合20min,攪拌轉速30r/min,然后加入剩余鈣果提取物均勻混合30min,攪拌轉速50r/min,無菌灌裝、密封、包裝即得鯰魚飼料復合酶。

實施例3

一種鯰魚飼料復合酶,主要由以下重量份數的原料制備:

酵母培養物20份,鈣果提取物15份,小麥芽粉10份,酸性木聚糖酶10份,酸性蛋白酶10份,植酸酶10份,β-葡聚糖酶6份,纖維素酶5份,淀粉酶5份,β-甘露聚糖酶3份,果膠酶3份,脂肪酶2份,磷酸酯酶2份,適口劑1份,蒿草籽粉1份;

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷酸酯酶均為食品級酶制劑;

制備方法:包括如下步驟:按照配方,首先依次將蒿草籽粉、適口劑、磷酸酯酶、脂肪酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麥芽粉、酵母培養物、鈣果提取物質量的10%加入V型混合罐均勻混合15min,攪拌轉速20r/min,然后加入剩余鈣果提取物均勻混合20min,攪拌轉速40r/min,無菌灌裝、密封、包裝即得鯰魚飼料復合酶。

實施例4

一種鯰魚飼料復合酶,主要由以下重量份數的原料制備:

酵母培養物40份,鈣果提取物30份,小麥芽粉20份,酸性木聚糖酶20份,酸性蛋白酶20份,植酸酶20份,β-葡聚糖酶10份,纖維素酶9份,淀粉酶9份,β-甘露聚糖酶7份,果膠酶7份,脂肪酶6份,磷酸酯酶6份,適口劑5份,蒿草籽粉3份;

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷酸酯酶均為食品級酶制劑;

制備方法:包括如下步驟:按照配方,首先依次將蒿草籽粉、適口劑、磷酸酯酶、脂肪酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麥芽粉、酵母培養物、鈣果提取物質量的30%加入V型混合罐均勻混合25min,攪拌轉速40r/min,然后加入剩余鈣果提取物均勻混合40min,攪拌轉速60r/min,無菌灌裝、密封、包裝即得鯰魚飼料復合酶。

實施例5

一種鯰魚飼料復合酶,主要由以下重量份數的原料制備:

酵母培養物20份,鈣果提取物30份,小麥芽粉10份,酸性木聚糖酶20份,酸性蛋白酶10份,植酸酶20份,β-葡聚糖酶6份,纖維素酶9份,淀粉酶5份,β-甘露聚糖酶7份,果膠酶3份,脂肪酶6份,磷酸酯酶2份,適口劑5份,蒿草籽粉1份;

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷酸酯酶均為食品級酶制劑;

制備方法:包括如下步驟:按照配方,首先依次將蒿草籽粉、適口劑、磷酸酯酶、脂肪酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麥芽粉、酵母培養物、鈣果提取物質量的30%加入V型混合罐均勻混合15min,攪拌轉速40r/min,然后加入剩余鈣果提取物均勻混合20min,攪拌轉速60r/min,無菌灌裝、密封、包裝即得鯰魚飼料復合酶。

實施例6

一種鯰魚飼料復合酶,主要由以下重量份數的原料制備:

酵母培養物40份,鈣果提取物15份,小麥芽粉20份,酸性木聚糖酶10份,酸性蛋白酶20份,植酸酶10份,β-葡聚糖酶10份,纖維素酶5份,淀粉酶9份,β-甘露聚糖酶3份,果膠酶7份,脂肪酶2份,磷酸酯酶6份,適口劑1份,蒿草籽粉3份;

所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷酸酯酶均為食品級酶制劑;

制備方法:包括如下步驟:按照配方,首先依次將蒿草籽粉、適口劑、磷酸酯酶、脂肪酶、果膠酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、酸性蛋白酶、酸性木聚糖酶、小麥芽粉、酵母培養物、鈣果提取物質量的10%加入V型混合罐均勻混合25min,攪拌轉速20r/min,然后加入剩余鈣果提取物均勻混合40min,攪拌轉速40r/min,無菌灌裝、密封、包裝即得鯰魚飼料復合酶。

實施例7本發明鯰魚飼料復合酶的養殖效果試驗

1.魚種及其來源:購于某水產養殖基地的土鯰魚;

2.試驗魚塘的選擇:在某鯰魚養殖場選了兩口魚塘分別為實驗組和對照組,魚塘面積均為3畝,養殖水深為2.0-2.5米。試驗魚塘的養殖水源豐富,水質清新無污染。魚塘設獨立的進排水系統,進水閘閥室設三道閘槽,外槽安裝粗濾網,內槽安裝錐形網,排水槽安裝防逃網。

3.試驗周期:2015.3.18-2015.11.18

4.養殖方法:試驗組和對照組均采用下列養殖方法:

(1)池塘準備工作

①池塘的清整:包括干塘、清淤和曬池。

②藥物消毒:魚種放養前7日,用生石灰100~130千克/畝化水潑灑清塘消毒,要求潑灑均勻,池塘不留死角。

③池塘注水:魚種放養前5日注水,注水水位在魚種放養前1.2米即可,魚種放養后再逐漸注水至最高水位。

(2)魚種放養:試驗養殖魚種投放日期為2015年3月20日,選擇魚種時,要求魚種體表光滑、無傷殘,魚種入池前用5%的食鹽水浸洗消毒3~5分鐘。隨機投放至試驗組和對照組魚塘,投放情況見表1。

表1土鯰投放情況

魚塘 品種 規格(g/尾) 總尾數 平均畝尾數 畝量(Kg) 總量(Kg) 試驗組 土鯰魚 50-100 9453 3151 236.33 708.98 對照組 土鯰魚 50-100 9450 3150 236.25 708.75

(3)馴化:在魚池中坐北朝南方向,離池岸2.5米距離,距池底60厘米,用石棉瓦搭設3~5個食臺。魚種入池的當天即開始馴化投喂,人在投餌前發出響聲,使魚類產生條件反射,聲音停頓時,在餌料臺附近以小把投喂顆粒餌料。每日2次,每次30~40分鐘,每次投餌間隔10秒鐘左右,這樣堅持馴化7~10天,魚種攝食顆粒餌料數量由少到多,攝食強度由弱到強轉變,直至馴化成功。

(4)飼養:試驗組和對照組飼喂的飼料中分別添加本發明實施例2制備的鯰魚飼料復合酶和市售同類型、同規格、同生產日期的鯰魚飼料復合酶,添加量為飼料質量的0.4%,每天投喂2次,以9:00―10:00、15:00―16:00各投喂一次。待魚類馴化后餌料應投在食臺上。魚類的投餌率為2%~6%,日投餌量應視養殖具體情況靈活掌握,每次以1小時內吃完為度。投喂時還應遵循“四定”原則。

(5)日常管理

①水質調控:魚種放養前池塘水位在1.2米左右,魚種放養后每隔5~7天加注新水一次。每次加水10~15厘米。7―9月的高溫養殖季節池水加至2.0~2.5米,并經常使用EM原露改良水質,水體透明度為30~40厘米。

②巡塘:每日巡塘應遵循早、中、晚巡塘制度。檢查魚的吃食情況、水質變化情況等,發現問題及時采取措施。特別是天氣悶熱或有浮頭預兆的情況要及時開啟增氧機,保持池水溶氧5毫克/升以上。

③魚病防治:魚病防治按照“預防為主、防治結合”的方針。做到無病先防,在養殖期間經常使用二氧化氯或生石灰消毒水體。

5.試驗項目及結果:

整個試驗周期內觀察、檢測鯰魚發病情況、死亡情況并作記錄,統計實驗組及對照組魚塘發病率及死亡率;出塘時統計實驗組及對照組產量(尾數、尾重、總重、尾均增重等);結果如表2:

表2:土鯰魚飼喂試驗結果

以上試驗結果表明:以同樣的飼喂及馴化方法,同樣的日常管理,同樣的魚塘條件和同樣的土鯰魚魚種及投放量等情況下飼喂鯰魚,以相同的添加量添加本發明制備的鯰魚飼料復合酶的飼料適口性強,成魚規格差距小,整齊,進而鯰魚撕咬、競爭覓食情況輕微,死亡率低僅為3%,比對照組市售飼料復合酶降低75%;抗病性強,發病率僅為3%,比對照組市售飼料復合酶降低66.67%;消化率高,尾均增重強,比對照組市售飼料復合酶提高55.74%;飼料系數低,料肉比低,比對照組市售飼料復合酶降低36.09%;養殖效益顯著,同樣投放量情況下產量提高59.58%,大大降低了養殖成本,具有較好的實用性和先進性。

需要說明的是:本發明實施例3-6制備的鯰魚飼料復合酶同樣具有上述實驗效果,各實施例之間及與上述實驗效果差異性不大。

實施例8本發明鯰魚飼料復合酶的生物活性(穩定性)試驗

將本發明實施例2制備的鯰魚飼料復合酶與市售相同生產日期的粉狀飼料復合酶分別于-12℃和40℃條件下儲存12個月,采用《GB/T23527-2009中華人民共和國國家標準蛋白酶制劑》中檢測方法測定蛋白酶的酶活力,計算酶活損失率,酶活損失率是指實際檢測的酶活力與產品標注酶活力的差值占標注酶活力的百分率,結果如表3

表3儲存期酶活力損失率

以上結果表明,在-12℃和40℃條件下儲存12個月,本發明鯰魚飼料復合酶與市售飼料復合酶相比,其蛋白酶酶活損失分別降低43%和18.9%,具有優良的溫度儲存性,酶活力非常穩定,同時也說明本發明鯰魚飼料復合酶中含有的其它生物活性物質的損失率極低,具有較好的抗凍、抗熱性能,產品質量穩定,保質期長。

需要說明的是:本發明實施例3-6制備的鯰魚飼料復合酶同樣具有上述實驗效果,各實施例之間及與上述實驗效果差異性不大。

實施例9高糖條件下釀酒酵母tlj2016發酵產GSH能力實驗

(1)搖瓶培養

取tlj2016斜面菌種一環,接入裝有30mL搖瓶培養基的250mL搖瓶中150rpm,30℃培養30h得種子液;

所述搖瓶培養基質量組成為:(NH4)2SO4 6g/L,葡萄糖35g/L,K2HPO4·3H2O 3g/L,KH2PO4 0.5g/L,酵母粉11g/L,MnSO4 0.1g/L,KCL 0.1g/L,FeSO4 0.1g/L,MgSO4·7H2O0.1g/L,余量為水,pH 6.0;

(2)5L發酵罐培養

將種子液按10%接種量,接入裝有3L發酵培養基的發酵罐中,30℃,通氣量6L/min,罐壓0.03MPa,500rpm,恒pH6.0條件下進行發酵培養,發酵至30h時,一次性添加終濃度為25mmol/L的L-半胱氨酸,總發酵時間為50h;

所述發酵培養基質量組成為:(NH4)2SO4 10g/L,葡萄糖100g/L,K2HPO4·3H2O 8g/L,KH2PO4 0.5g/L,酵母粉11g/L,MnSO4 0.1g/L,KCL 0.1g/L,FeSO4 0.1g/L,MgSO4·7H2O0.1g/L,余量為水,pH6.0;

發酵結束后,測定發酵液中GSH的含量為3308mg/L.

實施例10釀酒酵母tlj2016L-半胱氨酸耐受力實驗

將出發菌株以及tlj2016斜面菌種各一環,分別接入裝有30mL搖瓶培養基的250mL搖瓶中150rpm,30℃培養進行培養,在培養至12h時,向搖瓶中加入不同終濃度的L-半胱氨酸,再培養10h,測定細胞干重,結果表4、5;

搖瓶培養基(g/L):(NH4)2SO4 6、葡萄糖20、K2HPO4·3H2O 3、KH2PO4 0.5、酵母粉11、MnSO4 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO4·7H2O 0.1,pH6.0;

表4:出發菌株L-半胱氨酸耐受力

L-半胱氨酸濃度mmol/L 0 5 10 15 20 40 出發菌株干重g/L 22.6 15.7 10.2 4.3 2.2 0.8 GSH濃度(mg/L) 35.6 46.7 43.2 40.7 37.9 25.3

表5tlj2016L-半胱氨酸耐受力

L-半胱氨酸濃度mmol/L 0 5 10 15 20 40 tlj2016干重g/L 25.7 28.5 23.6 21.2 20.6 18.7 GSH濃度(mg/L) 73.2 98.3 113.5 121.7 127.5 135.8

從表4、5的結果可以看出,對于出發菌株,培養基中添加L-半胱氨酸,細胞停止生長,并且開始自溶,導致GSH增長率隨著L-半胱氨酸濃度的升高而降低;而低濃度L-半胱氨酸下,tlj2016仍能夠緩慢生長,隨著L-半胱氨酸濃度的提高,tlj2016菌株的細胞干重緩慢下降,而GSH濃度持續增長,這一結果將有利于GSH生產過程中通過添加前體氨基酸-L-半胱氨酸提促進GSH的生產。

實施例11釀酒酵母tlj2016耐鹽能力實驗

取tlj2016菌液1mL接種菌種于含有不同NaCl濃度的(含量梯度為0%、2%、5%、10%、15%、18%)的10mL YPD液體培養基(pH=6.5),置于30℃下分別培養24h,每個處理3個重復。各取1ml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻,制備稀釋度溶液,取0.1ml稀釋液于YPD固體平板中涂布,于30℃生化培養箱中倒置培養36小時(每個稀釋度做3個平行)記錄計算平板上的菌數個數。結果見表6,可知該菌的耐鹽濃度為18%,說明釀酒酵母tlj2016不僅可以在常規環境中生存,在高鹽條件下依然具有活力,可應用于醬油、腌制品等高鹽食品加工過程中耗糖產谷胱甘肽。

表6耐鹽能力檢測(×107cfu/ml)

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