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誘導植物胚囊染色體加倍選育三倍體的方法.pdf

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誘導 植物 胚囊 染色體 加倍 選育 三倍 方法
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摘要
申請專利號:

CN200710064712.X

申請日:

20070323

公開號:

CN101147465A

公開日:

20080326

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H1/06,A01H1/02 主分類號: A01H1/06,A01H1/02
申請人: 北京林業大學
發明人: 康向陽,王君,李艷華,張平冬
地址: 100083北京市海淀區清華東路35號北京林業大學118信箱
優先權: CN200710064712A
專利代理機構: 北京元本知識產權代理事務所 代理人: 李斌
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200710064712.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種誘導植物胚囊染色體加倍選育植物三倍體的方法,包括對植物雌花序授粉,用秋水仙堿進行處理,解除處理,果序管理,收獲種子,播種育苗,染色體檢測等步驟,其中,所述的授粉是當植物雌花序處于最佳授粉時期進行授粉;所述的處理是植物雌配子的胚囊發育處于由單核向八核發育的時期內,施加秋水仙堿處理雌花。本發明方法明確設置以最佳授粉時期為實施誘導胚囊染色體加倍處理的起始參照點,在柱頭發育到最佳授粉時期時適時授粉,并進一步確定雌花發育至四核胚囊距最佳授粉時期的時間差,可以精確的控制胚囊染色體加倍的處理時間,從而增加胚囊染色體加倍的準確性和穩定性,提高三倍體的誘導效率,節約化學試劑和實驗材料。

權利要求書

1.一種誘導植物胚囊染色體加倍選育植物三倍體的方法,包括對發育至適宜時期的植物雌花序進行授粉,對授粉后一定時期的雌花施加秋水仙堿溶液進行處理,用清水沖洗解除處理,果序管理,收獲種子,播種育苗,染色體檢測等步驟,其特征在于:所述的授粉是指當植物雌花序處于最佳授粉時期進行授粉;所述的處理是指當植物雌配子發育處于二核與四核胚囊占多數的時期內,施加0.1~0.6%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時。2.按照權利要求1的方法,其特征在于:所述的處理是指當植物雌配子的發育處于四核胚囊占多數的時期內,施加0.3~0.5%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時。3.按照權利要求1的方法,其特征在于:所述的植物是楊屬(Populus)植物。4.一種誘導楊樹胚囊染色體加倍選育三倍體的方法,包括對發育至適宜時期的楊樹雌花序進行授粉,對授粉后一定時期的雌花施加秋水仙堿溶液進行處理,用清水沖洗解除處理,果序管理,收獲種子,播種育苗,染色體檢測等步驟,其特征在于:所述的授粉是當楊樹雌花序符合下述條件時進行授粉:在體視顯微鏡下觀察雌蕊柱頭表面充分展開,乳突細胞發達;用聯苯胺-過氧化氫染色后柱頭變藍并有大量氣泡產生;所述的處理是指楊樹雌配子的胚囊發育處于二核與四核胚囊占多數的時期內,施加0.1~0.6%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時。5.按照權利要求4的方法,其特征在于:所述的處理是指當楊樹雌配子發育處于四核胚囊占多數的時期內,施加0.3~0.5%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時。6.按照權利要求4的方法,其特征在于:所述的楊樹母本選自毛新楊(Populustomentosa×P.balleana)、銀腺楊(P.alla×P.glandulosa)、銀毛楊(P.alba×P.tomentosa)、響葉楊(P.adenlpodn?Mazim)、小青楊(P.pseudo-simonii?Kitag.)或哲引3號楊;所述的楊樹父本選自毛白楊(P.tomentosa)、響葉楊(P.adenlpodn?Mazim)、北京楊(P.pyramidalis×P.cathayana?cv.Beijingensis’)或小青楊(P.pseudo-simonii?Kitag.)。7.按照權利要求6的方法,其特征在于:所述的楊樹母本為哲引3號楊(P.pseudo-simonii×P.nigra?var.lica),楊樹父本是北京楊(P.pyramidalis×P.cathayanacv.Beijingensis’)。

說明書

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技術領域

本發明涉及一種選育植物多倍體的方法,尤其涉及一種誘導植物胚囊(雌配子 體)染色體加倍選育三倍體的方法,屬于植物遺傳育種領域。

背景技術

自然界植物多倍體的發生均來自于細胞核內染色體組的倍數變異,即體細胞分 裂過程中偶然發生的染色體加倍以及減數分裂過程中產生未減數配子。人工誘導染 色體加倍可采取秋水仙堿溶液等化學誘導方法以及異常溫度等物理誘導方法。而人 工獲得多倍體的途徑包括體細胞染色體加倍、不同倍性體間雜交、天然或人工未減 數配子雜交、胚乳培養與細胞融合等。

康向陽等(2004)對授粉一定時期的銀腺楊(Populus?alba×P.glandnlosa)等雌花 序進行秋水仙堿溶液處理,獲得了一批白楊雜種三倍體植株,三倍體誘導最高得率達 57.1%(康向陽`,張平冬,高鵬,等.秋水仙堿誘導白楊三倍體新途徑的發現.北京 林業大學學報,2004,26(1):1-4),為三倍體誘導找到了一條新的途徑。但是,該 研究僅僅指出在當時的時空條件下,銀腺楊授粉后24-36h施加秋水仙堿溶液持續 處理24h可以獲得三倍體,但其中存在諸多關鍵技術問題值得進一步研究。如白楊 授粉后24-36h的雌配子形成與發育時期究竟處于什么階段?在雌配子形成與發育 的哪一個時期處理是三倍體的最佳誘導時期?如何在實際操作中,針對不同植物生 物學特點判別誘導三倍體的有效處理時期?此外,因大多植物雌蕊柱頭的可授期比 較長,不同操作人員對雌蕊柱頭是否具有可授性的判斷標準不同,導致授粉有早有 遲,包括銀腺楊在內的一些植物在具體雜交授粉時甚至可以相差1-2d,這種沒有一 個明確的處理起始參照點,而僅單純以授粉后24-36h等作為有效處理時期確定的標 準也是不符合實際的,存在失敗的風險,也需要從技術層面上有針對性地加以解決。

由于上述技術問題未能得到有效解決,使該方法的應用受到限制。同樣是對銀 腺楊施加同樣的技術處理流程,具體操作人員不同、材料的取樣時間不同或培養的 環境條件不同時,其處理結果存在顯著差異,表明僅僅通過時間控制的風險性較大, 更不可能拓展到楊屬植物及其以外的植物種。因此,解決授粉后施加秋水仙堿溶液 處理誘導植物三倍體的細胞學時期以及相關技術問題,形成有效的三倍體誘導技術 支撐體系,對于實現授粉后施加秋水仙堿處理誘導銀腺楊三倍體的穩定性和高效 率,以及將該方法引入其它楊樹或其它植物的三倍體誘導等具有重要的實際價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足,提供一種準確性、穩定性 和效率更高的選育植物三倍體的方法。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的:

一種誘導植物胚囊染色體加倍選育植物三倍體的方法,包括對發育至適宜時期 的植物雌花序進行授粉,對授粉后一定時期的雌花施加秋水仙堿溶液進行處理,用 清水沖洗解除處理,果序管理,收獲種子,播種育苗,染色體檢測等步驟,其中, 所述的授粉是指當植物雌花序處于最佳授粉時期進行授粉;所述的處理是指當植物 雌配子處于二核與四核胚囊占多數的時期內(更優選為四核胚囊占多數的時期內), 施加0.1~0.6%的秋水仙堿溶液處理雌花6-30小時。

上述選育植物三倍體的方法,所述的植物優選為楊屬(Populus)植物。

作為本發明一種優選的實施方案,具體如下:

一種誘導楊樹胚囊染色體加倍選育三倍體的方法,包括對發育至適宜時期的楊 樹雌花序進行授粉,對授粉后一定時期的雌花施加秋水仙堿溶液進行處理,用清水 沖洗解除處理,果序管理,收獲種子,播種育苗,染色體檢測等步驟,其中,所述 的授粉是當楊樹雌花序符合下述條件時進行授粉:在體視顯微鏡下觀察雌蕊柱頭表 面充分展開,乳突細胞發達;用聯苯胺-過氧化氫染色后柱頭變藍并有大量氣泡產生; 所述的處理是指當楊樹雌配子的胚囊發育處于二核與四核胚囊占多數的時期(即: 距最佳授粉時期時授粉后12~96h)內,施加0.1~0.6%的秋水仙堿溶液處理雌花 6-30小時。

上述方法中,優選的,所述的處理是指當楊樹雌配子的胚囊發育處于四核胚囊 為主的時期(即:距最佳授粉時期時授粉后54~66h)內,施加0.3~0.5%的秋水仙 堿溶液處理雌花6-30小時。其中,所述的四核胚囊為主是指四核胚囊的數量高于 單核、二核或八核胚囊的數量。

所述的楊樹母本優選為毛新楊(Populus?tomentosa×P.balleana)、銀腺楊 (P.alla×P.glandulosa)、銀毛楊(P.alba×P.tomentosa)、響葉楊(P.adenlpodn?Mazim)、 小青楊(P.pseudo-simonii?Kitag.)或哲引3號楊(P.pseudo-simonii×P.nigra?var.lica), 更優選是哲引3號楊(P.pseudo-simonii×P.nigra?var.lica)為楊樹母本;所述的楊樹 父本優選以毛白楊(P.tomentosa)、響葉楊(P.adenlpodn?Mazim)、北京楊(P.pyramidalis ×P.cathayana?cv.Beijingensis’)、小青楊(P.pseudo-simonii?Kitag.)等為父本,更優選 為北京楊(P.pyramidalis×P.cathayana?cv.Beijingensis’)為楊樹父本。

對于如何確定植物雌花序是否處于最佳授粉時期,本領域普通技術人員可通 過觀察柱頭的形態再結合一些本領域的常規方法從而可以判定目標植物的雌花序 是否處于最佳授粉時期。

至于如何確定植物雌配子的胚囊發育是否處于單核胚囊向八核成熟胚囊發育 的時期或四核胚囊占多數的時期內,可通過常規切片等方法進行判定或確認,這些 方法或技術均為本領域人員所習知或熟練掌握。

本發明選育植物三倍體的方法明確設置以最佳授粉時期為實施誘導胚囊染色 體加倍處理的起始參照點,在柱頭發育到最佳授粉時期時,適時授粉,并進一步確 定雌花發育至四核胚囊距最佳授粉時期的時間差,更為精確的控制胚囊染色體加倍 的處理時間,可增加授粉后施加秋水仙堿處理誘導植物胚囊染色體加倍的準確性和 穩定性,提高三倍體的誘導效率,并且還可以節約處理用的化學試劑和實驗材料等。

下面通過實施例對本發明作進一步說明。應當指出,這些實施例僅僅是本發明 的例證,不應理解為對本發明的限制。

具體實施方式

實施例

用毛新楊(Populus?tomentosa×P.balleana)、銀腺楊(P.alla×P.glandulosa)、銀 毛楊(P.alba×P.tomentosa)、響葉楊(P.adenlpodn?Mazim)、小青楊(P.pseudo-simonii Kitag.)、哲引3號楊(P.pseudo-simonii×P.nigra?var.lica)等為母本,以毛白楊 (P.tomentosa)、響葉楊(P.adenlpodn?Mazim)、(北京楊(P.pyramidalis×P.cathayana cv.Beijingensis’)、小青楊(P.pseudo-simonii?Kitag.)等為父本,采用對處于最佳授粉 時期的雌花序進行授粉后,通過常規切片觀察雌配子的胚囊發育,雌配子的胚囊為 二核胚囊與四核胚囊占多數的時期內(距最佳授粉時期時授粉后12~96h)用0.3~ 0.5%秋水仙堿溶液浸泡處理雌花序6~30h,三倍體得率介于30%~70%之間。

以哲引3號楊×北京楊為例(表1),哲引3號楊雌花序的最佳授粉時期為體視 顯微鏡下觀察雌蕊柱頭表面充分展開,乳突細胞發達,用聯苯胺-過氧化氫染色后柱 頭變藍并有大量氣泡產生等;在哲引3號楊達到最佳授粉時期時授粉,授粉后通過 常規切片觀察雌配子的胚囊發育,當雌配子的胚囊位于二核胚囊與四核胚囊的時期 內(24~96h)施加0.3~0.5%秋水仙堿溶液浸泡處理雌花序6~30h;由于哲引3 號楊胚囊發育的不同步性,實驗各處理均能得到了一定數量的三倍體植株,其中尤 以距最佳授粉時期授粉后四核胚囊時期為主(距最佳授粉時期時授粉之后54~66h) 時施加處理誘導三倍體的效果最好,約占獲得的三倍體總數的2/3,三倍體得率最 高達66.7%。

表1授粉后施加秋水仙堿處理誘導哲引3號楊×北京楊三倍體及其與胚囊發育 關系統計表

??雜交組合 ??秋水仙堿 ??濃度(%) ??授粉后處理 ??時間(h) ??胚囊發育進程 ??三倍體得 ??率(%) ??四分體 ??單核 ??二核 ??四核 ??八核 ??合子 ??哲引3號楊 ??×北京楊 ??0.3 ??24 ??6.38 ??44.68 ??31.91 ??17.02 ??0 ??0 ??4.1 ??0.5 ??54 ??0 ??7.58 ??15.15 ??40.91 ??36.36 ??0 ??9.5 ??0.5 ??60 ??0 ??7.94 ??12.70 ??46.03 ??33.33 ??0 ??66.7 ??0.5 ??66 ??0 ??3.57 ??8.93 ??41.07 ??46.43 ??0 ??20.0 ??0.5 ??72 ??0 ??2.22 ??13.33 ??28.89 ??55.56 ??0 ??14.3 ??0.5 ??96 ??0 ??0 ??1.45 ??17.39 ??59.42 ??21.74 ??7.1

注:授粉后一定時期施加秋水仙堿持續處理6-30h。

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