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包含共價鍵結合到基底特別是通過SS橋經由間隔分子共價鍵結合到基底的半胱氨酸化合物的抗微生物劑.pdf

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包含 共價鍵 結合 基底 特別是 通過 SS 經由 間隔 分子 半胱氨酸 化合物 抗微生物劑
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摘要
申請專利號:

CN200680007563.7

申請日:

20060321

公開號:

CN101137287B

公開日:

20130410

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01N25/00,A01N31/00,A01P1/00,A23L3/3535,A61L2/16,C09D5/14 主分類號: A01N25/00,A01N31/00,A01P1/00,A23L3/3535,A61L2/16,C09D5/14
申請人: 賽特科特公司
發明人: 安德斯·維爾森,比吉塔·阿格貝特,格門迪爾·格門德松,雅各布·奧德貝格,托爾比約恩·林德伯格
地址: 瑞典斯德哥爾摩
優先權: 0500629-1,0500729-9
專利代理機構: 北京集佳知識產權代理有限公司 代理人: 劉曉東;顧晉偉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200680007563.7

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及抗微生物劑,其中半胱氨酸化合物共價鍵結合到基底,特別是通過S-S橋經由間隔分子結合到基底。所述間隔基包含碳鏈,任選地插入一個或多個雜原子,例如O、S、N、P和Si;所述碳鏈任選地被一個或多個烷基基團取代,優選被具有1~5個碳原子的低級烷基基團、羥基基團或烷氧基基團取代。本發明還涉及涂敷有本發明抗微生物劑的基底。所述試劑具有優良的抗微生物特性,且能用于涂敷各種裝置的表面和基底,以防止或抑制微生物的累積和/或生長和/或增殖和/或生存力和/或生物膜的形成,所述裝置例如為醫療裝置或用于食物處理的裝置。

權利要求書

1.包含具有共價鍵結合的半胱氨酸化合物的基底R的抗微生物劑,所述基底為固體表面或共價鍵結合或吸附在固體基底上的聚合物,其中所述半胱氨酸化合物通過S-S橋經由間隔分子L和連接基團X結合到所述基底;其中所述S-S橋包含一個來自半胱氨酸化合物的硫醇基的S和一個來自所述間隔分子L的S;所述間隔基L包含碳鏈,所述碳鏈任選地插入一個或多個選自O、S、N、P和Si的雜原子;所述碳鏈任選地被一個或多個烷基基團、羥基基團或烷氧基基團取代,所述連接基團X由所述基底和L之間的偶聯反應所得,其中所述抗微生物劑具有式(1):(1)R-X-L-S-(半胱氨酸部分)其中-L-S-(半胱氨酸部分)具有一種以下的結構(2)或(3):其中R、R為氫或者具有1-18個碳原子的烷基,以任意組合,或者式(2)中所述的R或R之一可經由包含所述半胱氨酸部分的氮的酰胺鍵連接;q為1-12;其中R、R、R為具有1-18個碳原于的烷基取代基,以任意組合;q具有1-12范圍內的值;其中L為選自包括(CH)、(CHCHO)(CH)或(CH(CH)CHO)(CH)的組的間隔分子,其中m為1-20;其中n為1-100,且p為1-20;所述(CH)部分與所述二硫橋結合。2.根據權利要求1的抗微生物劑,其中L為(CH)或(CHCHO)(CH),m為1-8,n為3-50且p為1-10。3.根據權利要求1的抗微生物劑,其中所述間隔基L中的所述碳鏈被具有1~6個碳原子的低級烷基基團取代。4.根據權利要求1的抗微生物劑,其中如權利要求1中式(2)所述的R或R之一經由包含所述半胱氨酸部分的氮的酰胺鍵連接。5.根據權利要求1的抗微生物劑,用于防止或抑制革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌的生長和/或增殖。6.根據權利要求1的抗微生物劑,用于防止或抑制革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性大腸桿菌、或革蘭氏陽性巨大芽孢桿菌的生長和/或增殖。7.一種與微生物接觸和/或需要保持沒有微生物累積和/或附著的基底,其特征在于所述表面涂敷有如權利要求1-6中任一項限定的抗微生物劑。8.根據權利要求7的基底,其中所述基底為選自以下的裝置、設備和/或表面的一部分:(a)醫療裝置,(b)食品裝置,和(c)隱形眼鏡、化妝品包裝產品、淡水水箱和水管、用于存儲其中在存儲材料表面上的細菌生長是不希望的產品或材料的裝置。9.根據權利要求8的基底,其中所述醫療裝置選自可應用于人或動物體外部的體外醫療裝置、或可應用于人或動物體內部的體內醫療裝置。10.根據權利要求8的基底,其中所述裝置選自用于燒傷傷口的人造皮膚,透析裝置,耳引流裝置,耳植入物,助聽裝置,心肺機管道,腦水腫引流,注射器,造口,傷口護理裝置,縫合材料,導管,牙科產品,用于液體、溶液、輸注、藥物遞送的胃腸外施用的管道或設備,體內植入物,胰島素泵,神經導向,起搏器,從體內引流,腔內支架。11.生產抗微生物裝置的方法,其包括以下步驟:i)提供裝置ii)使配體-L-S-(半胱氨酸部分)共價鍵結合到所述裝置表面的官能團,其中-L-S-(半胱氨酸部分)如權利要求1中所定義,或共價鍵結合到可溶的基底,所述可溶的基底隨后固定于所述裝置的表面上。

說明書

技術領域

本發明涉及抗微生物劑或與微生物接觸的裝置和/或希望保持沒有微生物累積和/或附著的裝置。基底或裝置表面呈現出本發明的抗微生物劑。

背景技術

在各種情況和應用中,例如在醫療護理、食品處理和食品貯存中,保持所使用的裝置和產品沒有微生物的生長或增殖是非常重要的。這不僅僅是在醫院中與患者接觸的醫療裝置時是極其重要的,在醫療裝置中是極其重要的是因為被污染的裝置可通過可嚴重影響很多患者健康的方式參與疾病和微生物的傳播。

例如,如果與可能有害的微生物接觸的裝置和產品具有抑制或殺滅細菌和/或其它微生物(例如病毒和真菌)的能力以防止疾病的傳播,那么這將是非常有利的。

目標在于防止隨后可發展成生物膜的初始定殖(colonization)。可通過抑制或殺滅微生物來抑制定殖的初始階段。

為得到這樣的保護,已知在裝置中提供具有金屬離子的表面,例如元素Ag和Ni的離子。通常Ag作為合金應用以達到以合適的速率向環境釋放Ag+離子的目的,由此防止微生物的累積。

然而,采用這種解決辦法的一個問題是金屬或合金粘著到所述表面。而且,不易控制抗微生物效應,另外金屬離子涂敷的表面可能具有細胞毒性的作用。

US-A-6475434公開了滲透生物膜的組合物,其用于除去由感染性微生物形成和構成的生物膜和用于涂敷醫用裝置以防止這樣生物膜的形成。該組合物包含半胱氨酸和其類似物或其衍生物以便選擇作為組分之一。半胱氨酸或半胱氨酸相關組分的作用并不清楚,尤其是對于涂敷應用它們以與已知抗微生物劑例如利福霉素、四環素和青霉素的組合使用。特別地,如在US-A-6475434中的實施例2和3中所示,僅測試的半胱氨酸部分(其為N-乙酰基半胱氨酸)沒有效用,除非與測試的抗生素結合。此外,對生物膜保護而言,通過浸漬所述裝置或在生產期間與所述裝置材料混合來應用所有的組分。這些組分然后通過附著和滲透于所述裝置材料而變為物理性結合,這意味著在其向環境釋放時在很大程度上發揮其功能。尤其在醫學應用中,這樣的原理需要嚴格控制在抗微生物、細胞毒性和免疫效應之間的平衡。因為擴散基于時間和溫度,所以涂敷裝置的貯存和耐久性也成為特別關注的問題。

Olofsson等(Applied?and?Environmental?Microbiology,August?2003;69(8),4814-4822)已描述過N-乙酰基半胱氨酸能在溶液中影響細菌生長。N-乙酰基半胱氨酸的其它效應是減少多種類的細菌附著到不銹鋼表面或利于從不銹鋼表面脫離生物膜。

發明內容

本發明的主要目的是提供抗微生物劑,其具有以穩定的和長期的方式防止或至少基本上降低個體微生物在裝置表面上累積和/或附著的能力。

該目的由發明人在本發明的第一個方面實現,即關于包含共價鍵結合半胱氨酸化合物的基底的抗微生物劑。

具體地,本發明提供抗微生物劑,其中所述半胱氨酸化合物通過S-S橋經由間隔分子結合到所述基底。所述間隔基包含碳鏈,任選地插入一個或多個雜原子,例如O、S、N、P或Si,且該鏈任選地被一個或多個烷基基團取代,優選被具有1-6個碳原子的低級烷基基團、羥基基團或烷氧基基團取代。在以下給出的實施例中該半胱氨酸化合物經由S-S橋結合在該間隔基的末端位置,這是本發明的一個優選實施方案。然而,間隔鏈上的其它位置也是可能的,只要該半胱氨酸官能團暴露于環境中。

根據本發明一個優選實施方案,與基底結合的含半胱氨酸的配體具有通式:

(1)R1-X-L-S-S-(半胱氨酸部分),

其中

-R1為可溶的或不溶的基底;例如固體表面或可溶的有機分子或聚合物。

-X為來自基底和L之間的偶聯反應的連接基團。

-L為間隔分子,選自包括(CH2)m、(CH2CH2O)n(CH2)P或(CH(CH3)CH2O)n(CH2)p的組,其中m為1-20,優選1-12、1-8或1-6;其中n為1-1000,優選1-100或3-50;且p為1-20,優選1-12、1-10或1-6。所述(CH2)p部分與二硫橋結合,但也可任選地出現在嵌段共聚物中的(CH2CH2O)n和/或(CH(CH3)CH2O)n鏈段之間;

-本文中半胱氨酸化合物是指半胱氨酸化合物的殘基,包括半胱氨酸、半胱氨酸類似物或半胱氨酸衍生物的殘基,所述半胱氨酸類似物或半胱氨酸衍生物具有與半胱氨酸賦予的抗微生物活性基本上相同或處于相當水平的抗微生物活性。已注意到由于其優良的抗微生物活性,至少在某些應用中,本發明如下的一個實施方案特別重要:其中半胱氨酸化合物經由S-S橋結合,所述S-S橋包含一個來自半胱氨酸化合物的硫醇基的S和一個來自所述間隔分子的S。

因此,提供了共價鍵結合到所述裝置表面的抗微生物劑,其由于共價鍵結合半胱氨酸的令人驚奇的有利作用而對個體微生物具有強的和長期的效果,參見以下關于的實施例,從而防止或基本上抑制了個體微生物的附著和累積。因此,本發明提供了用于需要表面或基底會表現出抗微生物/抗菌性質的所有應用的巨大潛力。本發明另外的和重要的優點在于已由發明入表明本發明的試劑表現出無細胞毒性作用,這使得其可用于多種不同的應用中。

在本發明的一個方面,使用根據本發明的抗微生物劑完全或部分涂敷所需保持沒有微生物累積和/或附著的各種裝置。

在另一方面,本發明涉及本發明的抗微生物劑用于防止微生物在基底和/或裝置表面上生長和/或增殖的用途。

與US-A-6475434相比,本發明提供了使半胱氨酸或半胱氨酸相關組分共價鍵結合到基底的方法。本發明的主要用途是為固體裝置提供抗微生物涂層。根據此原理所述抗微生物劑永久地結合到所述表面,與表面接觸時發生所述抗微生物效應而非來自釋放試劑的反應,這將大大降低在生物環境中不良影響的風險。與作為如此釋放試劑提供半胱氨酸的現有技術方法相比,這是主要的區別。就表面濃度和化學結構而言,也可以通過共價連接更特定地制備所述表面。因此不僅表面結合的半胱氨酸或半胱氨酸相關組分本身,而且至少在某些應用中借以將半胱氨酸或半胱氨酸相關組分連接到所述表面的二硫鍵也是關于抗微生物效果的本發明原理的發明性特征之一。此外,此共價連接提供了表面,與主要涉及活性劑的擴散和滲漏的表面相比,該表面在一致性和耐久性方面是原位和貯存優越的。

“抗微生物劑”包含基底,所述基底已被修飾以呈現出共價鍵結合的半胱氨酸部分,并具有防止或至少基本上防止至少一種特定微生物的累積、生長和/或增殖的作用。此作用可例如通過現有技術中已知的方法觀察到,如通過本公開實施例部分中使用的方法。

“半胱氨酸部分”包括具有抗微生物作用的半胱氨酸、半胱氨酸類似物或半胱氨酸衍生物的殘基,例如高半胱氨酸或N-取代的半胱氨酸比如N-乙酰基-L-半胱氨酸和N-烷基化的半胱氨酸。

“基底”(R1)包括任何可溶的或不溶的制品、裝置、分子或聚合物,其可通過結合半胱氨酸部分而被官能化以獲得抗微生物性質。特別感興趣的是固體制品,比如待在人或動物身體尤其是敏感組織和體液的內部或與之接觸使用的醫用裝置。此可能應用的列表是廣泛的,進一步參見下面,并包括待用于例如以下應用中的植入物、管道引流導管(tubings?drainagecatheters)等,所述應用例如為體外應用、引流(例如耳或腦積水)、透析、隱形眼鏡、眼內透鏡、人造皮膚、透析裝置、心肺機、縫合材料、傷口護理裝置、牙科產品、胃腸外施用、藥物遞送、支架、泵(例如用于胰島素)、助聽裝置、注射器、縫合材料、起搏器等。

“防止”或“抑制”包括在存在本發明試劑的位置停止或基本上降低微生物的生長和/或增殖和/或累積和/或基本上降低微生物生存力的能力。

本發明的主要潛力是為固體裝置提供抗微生物表面的可能性,所述固體裝置可能與微生物接觸,且需要保持沒有微生物的累積和/或增殖和/或作為有生存力的微生物的貯庫。待用于微生物的存在可或多或少是危險的醫療和食品處理應用中的大量裝置,說明了本發明的潛力。為使這成為可能,發明人已成功地使用了半胱氨酸物質,發明人已展示了當如本文中描述和要求保護的那樣共價鍵結合后其具有出乎意料強的抗微生物作用。對于半胱氨酸類似物和其衍生物如N-乙酰基半胱氨酸和高半胱氨酸,已顯示了具有抗微生物作用。

環氧乙烷和環氧丙烷的聚合物或低聚物,即聚(環氧乙烷)或聚(乙二醇)是可易溶于水的,另外聚(環氧乙烷)具有蛋白質排斥性質,其可增加本發明的抗微生物功能特別是當用于與表面接觸時。根據半胱氨酸部分,以下結構是待使用的合適配體的實例:

在式(2)中,在R2和R3的任意組合中,取代基R2、R3可為氫或具有1~20個碳原子,優選1~12個碳原子,更優選1~6個碳原子的烷基;q可具有與如前所述的L部分的亞甲基組分的m和p相同的變化,即1~20,優選1~12,更優選1~6。當q=1且R2=R3=H時,該半胱氨酸部分變為半胱氨酸殘基,其如同半胱氨酸類似物和衍生物一樣經由其硫醇基團偶聯,該硫醇基團為該二硫鍵貢獻一個硫。除了半胱氨酸氨基基團的直接烷基化以外,R2和R3烷基還可通過包含該半胱氨酸部分氮原子的酰胺鍵結合,例如當R2為氫且R3為甲基時,該半胱氨酸部分變為乙酰基半胱氨酸。

在式(3)中R2、R3、R4為烷基取代基,其給出帶正電的季銨基團。在此情況下,所述R2、R3、R4取代基的烷基鏈中碳原子數目可在1~25間變化,優選在1~18間變化,以任意組合。此外,q可具有與如前所述的L部分的亞甲基組分的m和p相同的變化,即1~20,優選1~12,更優選1~6。

根據pH,也可出現帶電的離子基團,如(2)中質子化的氨基基團和(2)與(3)中的羧酸鹽基團。

取代基R1和所述配體之間的偶聯-X-通過R1上的官能團和相應配體間的化學反應而得到。如果R1具有化學官能團Y且配體具有官能團Z,其通過反應得到X,忽略副產物,則主要的偶聯反應可寫成:

(4)R1-Y+Z-L-S-S-(半胱氨酸部分)---------------->

----------------->R1-X-L-S-S-(半胱氨酸部分)

根據Y和Z的選擇以及反應條件,得到的X基團可為酰胺、仲胺、酯、醚、肼、尿烷、脲、碳酸酯等。有大量特定有效的已在有機化學中充分確定的反應可供使用。因此,本文中給出的Y、Z和X基團以及反應是示例性的而非對本發明的限制。

(a)當Y=COOH????????且Z=NH2?????????????則X=CONH

(b)″Y=COCl????????″Z=NH2?????????????″X=CONH

(c)″Y=COOH????????″Z=OH??????????????″X=COO

(d)″Y=COCl????????″Z=OH??????????????″X=COO

(e)″Y=NH2?????????″Z=CHO?????????????″X=NH

(f)″Y=NHNH2???????″Z=CHO?????????????″X=NHNH

(g)″Y=NH2?????????″Z=NCO?????????????″X=NHCONH

(h)″Y=NH2″″X=NHCOO

(i)″Y=NH2?????????″Z=琥珀酰亞胺基????″X=NHCO

(j)″Y=NH2?????????″Z=環氧-???????????″X=NHCH2CH(OH)

(k)″Y=OH??????????″Z=NCO?????????????″X=OCONH

(l)″Y=OH??????????″Z=環氧????????????″X=OCH2CH(OH)

(m)″Y=OSO2CH2CF3??″Z=NH2?????????????″X=CH2NH

(n)″Y=OSO2CH2CF3??″Z=SH??????????????″X=CH2S

(o)″Y=SS??????????″Z=SH??????????????″X=SS

(p)″Y=(烷基)3COK??″Z=(烷基)Br????????″X=O

(q)″R1=Au,Ag?????″Z=SH??????????????″X=S

(r)″R1=Au,Ag?????″Z=SS??????????????″X=S

(s)″R1=R1·???????″Z=CH2=C-?????????″X=CH-C-

實例(a)到(p)中的Y和Z基團可在R1和所述配體之間互換以給出同樣的X連接,盡管其在R1和該配體之間是顛倒的。例如當(a)中的所述官能團被換成Y=NH2和Z=COOH時,X連接變為HNOC。在實例(e)和(f)中,初始得到的通常被稱為Schiff堿的亞胺被用NaCNBH3還原成仲胺連接。常使用中間步驟以提高選擇性和產率。所熟知的實例是在與氨基基團(Z)形成酰胺之前,用碳二亞胺和/或N-羥基琥珀酰亞胺活化(a)中羧基基團(Y)。可用二琥珀酰亞胺基碳酸酯活化胺基團以與另一個胺基團形成脲連接。

除了羧基和氨基基團外,也可在大量的偶聯反應中使用羥基:

-在衍生化為碳酸酯后得到(h)中的Z基團(其中表示苯環)、或衍生化為如在(m)和(n)中的三氟乙磺酰化的(tresylated)基團

-在通過衍生化為甲苯磺酰基或琥珀酰亞胺基碳酸酯基團來活化羥基后,用Br2或CNBr處理以用于與親核物質如胺和/或硫醇進行偶聯反應。

-可使用光氣將兩個羥基連接在一起以形成碳酸酯連接。

關于本文中提及反應和其它偶聯反應的偶聯化學的全面綜述見于文獻(參考Herman?S.等的J.Bioact.Compat.Pol.1995,10,145-187)。

在表1的實例(s)中,R1·表示具有自由基的固體基底,所述自由基可與不飽和基團反應,所述不飽和基團例如但不限于:乙烯、丙烯酸或甲基丙烯酸的雙鍵。通過使用具有與反應性的碳-碳鍵連接的配體-L-S-S-(半胱氨酸部分)的單體,可得到共價連接到所述基底且其具有配體作為側基的低聚物鏈或聚合物鏈。可通過與合適單體的共聚合控制低聚物鏈和聚合物鏈中這些側基的濃度,所述合適的單體例如但不限于:丙烯酸或甲基丙烯酸或酯或丙烯酰胺。其它路線將使用單體如馬來酸、馬來酸酐、惕各酸或烯丙基胺,其易于與提供表面的自由基結合但具有大幅降低的鏈增長。由這些單體提供的官能團,即酸酐、羧基或胺將因此被限制在基底上非常薄的表面層上。通過此路線,配體的各個偶聯將基本上通過直接與所述表面上的官能團的末端連接而發生,因此與當所述配體參與接枝聚合時得到的結構相比提供了不同的結構。

如果Y基團選擇性地與所述配體的Z基團反應且不與所述半胱氨酸部分中的氨基或羧基基團反應,則可根據(4)與R1-Y進行偶聯反應。

在Y基團可能不排它性地與下式配體的Z基團反應而且還可與該半胱氨酸部分的氨基和/或羧基基團反應的情況下:

(5)Z-L-S-S-(半胱氨酸部分)

如果需要,可分別通過取代和酯化保護這些基團。可通過取代基保護氨基基團,例如通過叔丁氧羰基(t-BuO)。當然這只有當所述氨基未被烷基化成如式(2)和(3)中所定義的叔胺或季銨時才是必需的。可通過甲基化保護該半胱氨酸部分的羧基基團。在如式(4)所示的R1-Y與Z-配體之間的偶聯反應以獲得X連接的配體之后,t-BuO和酯甲基基團可分別通過酸和堿水解脫除,并因此恢復所述Z-配體的原始結構。通過如式(2)-(4)和式(5)中定義的Z-配體以及另外可得到的各種Z官能團的這些選擇,是本發明待用作官能化表面的單步修飾的試劑盒(kit)組件的單獨的項目。本發明的這一方面還覆蓋了以前所述的其中基底的官能團Y是自由基和配體的官能團Z是不飽和的反應性碳-碳鍵的實例。

當所述官能團Y結合到固體基底時,可在所述基底表面原位合成配體。此具有優點:在中間步驟除去未反應的Y基團和副產物。

通過此方法,第一步驟將是使R1-Y表面與具有如下一般組成的化合物反應:

(6)Z-L-S-S-R5

其中L具有與如前相同的定義,且當取代基R5與硫醇反應時其易于被取代以與硫醇化合物得到新的二硫鍵。

第一偶聯步驟可表示為:

(7)R1-Y+Z-L-S-S-R5------------------>

----------------->R1-X-L-S-S-R5

以及隨后的步驟:

(8)R1-X-L-S-S-R5+HS-半胱氨酸部分------------->

--------------->R1-X-L-S-S-半胱氨酸部分(+R5HS)

R5的一個常見實例是吡啶基,但也使用丹酰基。作為替代,(6)中的二硫鍵可屬于硫代硫酸酯基團,通過與硫醇反應所述硫代硫酸酯基團也會得到二硫鍵。

此外還有可替代的方式用于獲得如前所述的基本相同的化學結構,這也在本發明的范圍之內。在此情況下,硫醇部分或基團-L-SH經由偶聯基團X與R1結合,其中L和X如前所定義的且-SH為末端硫醇基團。這可在氧化劑存在下排它性地與所述半胱氨酸部分的硫醇基團反應,以形成與該半胱氨酸部分的二硫化物連接:

(9)R1-X-L-SH+HS-(半胱氨酸部分)--------------->

-------->R1-X-L-S-S-(半胱氨酸部分)

+(H2或含氫副產物)

當最后根據式(9)偶聯所述半胱氨酸部分時,得到了抗微生物配體,其與R1共價鍵結合,如式(9)中所示的。

聚合物材料例如塑料、橡膠、纖維素塑料等的表面官能化可通過接枝或吸附具有官能團的化合物而實現,所述官能團例如羧基或胺。給出與所述基底共價連接的接枝需要表面的官能化。在用UV、電子束或γ輻照或氣體等離子活化的期間或之后,接枝能與自由基反應的化合物。通過這些方法,可在聚合物基底中產生自由基,這可引發這樣基底上的接枝聚合。這些用于固體聚合物基底的表面修飾方法由表1中的實例(q)所代表。在此方法中,接枝通常包括稱為接枝聚合的從所述基底表面的鏈增長。

常用于自由基接枝聚合的單體為丙烯酸化合物如丙烯酸、甲基丙烯酸和其酯或丙烯酰胺以及乙烯基吡咯烷酮。通過含有如羧基、氨基、鹵素等官能團的這些單體的接枝聚合,可以提供具有共價鍵結合官能團的固體表面,所述共價鍵結合官能團用于共價鍵結合抗微生物配體。以前描述的接枝聚合的特定應用也包含在本發明中,其中當Z為包含反應性不飽和碳-碳鍵的自由基反應性基團時,如式(6)所示的抗微生物配體能接枝聚合。這將給出在接枝聚合鏈中作為側基的抗微生物配體,其濃度和位置可通過與適合乙烯或丙烯酸單體的接枝共聚進行控制。然而,也如以前所述的,該抗微生物配體可在末端與基底直接結合。在此情況下在第一步驟中通過與具有可忽略鏈增長的不飽和化合物的單分子接枝而實現所述基底的官能化,所述不飽和化合物例如為馬來酸酐、馬來酸和三氟甲磺酸或自終止單體如烯丙基胺。通過此過程可在所述表面上產生官能團,以便通過化學偶聯直接末端結合所述抗微生物配體。同樣在當式(6)中的乙烯或丙烯酸配體不聚合的情況下,例如由于空間位阻原因,其將通過與所述基底上自由基的末端反應直接結合。

在所述基底為可水解的塑料材料如聚酯(PET)、聚酰胺(NylonTM,NomexTM,KevlarTM)或聚丙烯酸酯(PMMA)的情況下,可通過在堿性或酸性溶液中水解得到表面官能化。聚酯將給出羧基和羥基,聚酰胺將給出羧基和胺基,其可通過偶聯或吸附用于隨后的修飾中。

可通過輻照和等離子體處理使用羧基基團表面官能化金屬基底如不銹鋼。醫療制品如支架通過暴露于硅烷和丙烯酸的氣體等離子體而羧基化。金和銀表面可通過利用其與硫醇和二硫化物化合物的反應性而接枝,所述硫醇和二硫化物化合物也會具有其它基團如羧基和胺。同樣對于金屬基底而言,可通過在暴露于一旦與自由基反應能形成共價連接的單體期間該導電基底的陰極極化,而實現表面的自由基接枝。該表面接枝在引發、增長和單體方面類似于固體聚合物基底,同樣也由表1中的實例所代表。

當通過吸附進行聚合物基底的表面修飾時,所述基底的底漆往往通過化學氧化、電暈處理或氧化性氣體等離子體實現,以在表面層中獲得親水基團和離子基團。一個實例是將聚亞乙烯亞胺吸附到已被高錳酸鹽或過硫酸鹽氧化過的聚合物基底上。所得氨基表面可用于化學偶聯反應和在合適的pH下吸附帶負電聚合物如聚丙烯酸、右旋糖酐硫酸酯或肝素。往往在其離子帶電狀態下以交替的層吸附這些聚電解質,感興趣的性質在最外層。特別是往往通過聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的吸附而實現金屬表面的羧基化。如上所述,然后可通過化學偶聯或通過離子吸附例如聚乙烯亞胺或聚烯丙基胺,來胺化它們。

另一個不需要基底的任何初步官能化的獲得吸附的方法是使用既有疏水性又有親水性的嵌段或部分的嵌段共聚物,其將選擇性地吸附到所述基底表面或使所述基底表面官能化。典型地,這樣的嵌段共聚物為聚乙二醇-聚丙烯(Pluronics)和聚丙烯酸酯-聚苯乙烯、聚丙烯酸酯-聚乙烯、聚丁二烯-聚苯乙烯等,其也可包含氨基或羧基官能團。

本發明定義的抗菌配體-L-S-S-(半胱氨酸部分)總是與基底R1共價鍵結合。

然而,由于R1的定義包含有機和聚合物化合物,R1也將覆蓋隨后能通過共價鍵結合或吸附而結合到固體基底的聚合物。

本發明的抗菌劑對固體基底的共價鍵結合的選擇通過R1的定義而被強調,其包括通過吸附將所述抗微生物劑連接到固體基底。在此情況下,R1為可溶性的基底,例如可電離的聚合物如聚乙烯亞胺或聚丙烯酸或具有疏水性/親水性嵌段的嵌段聚合物,如聚乙二醇-聚丙二醇或在與聚苯乙烯、聚乙烯等的嵌段共聚物中的聚丙烯酸酯。半胱氨酸部分共價鍵結合到可溶性基底上,所述可溶性基底在另外的步驟中固定于固體基底上,如本文所述。

因此,可通過許多不同途徑實現用于連接抗菌劑的表面修飾和隨后的化學偶聯或吸附。此外所述基底可為有機或無機材料,其包括合成的或天然的聚合物以及金屬和礦物。因此,在此處和下面實施例中提出的方法、化學反應和基底僅僅是說明性的,并非限制本發明覆蓋的所得抗菌劑和表面。本發明試劑的表面濃度,例如L-半胱氨酸為10-11~10-4摩爾/cm2,優選10-9~10-5摩爾/cm2。

為獲得臨床上或技術上重要的微生物抑制,對于附著的活細菌,優選根據本發明達到100倍的抑制,所述附著的活細菌能用以起始于大幅暴露(在起始培養中滴度為400000cfu/ml)的方法進行釋放。這可部分取決于特定生物體和暴露的程度/滴度。所述測試條件大大超過在實際臨床條件下可預期的條件。

可用本發明防止其生長和/或增殖的微生物的實例為厭氧菌和需氧菌,其包含選自但不限于以下的不同革蘭氏陽性菌:不同種的葡萄球菌(Staphylococci)例如金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermides)以及其它的凝固酶陰性葡萄球菌,腐生葡萄球菌(S.saphrophyticus),腸球菌種(Enterococcus?spp),奈瑟氏菌屬(Nesseria)(腦膜炎球菌(Meningococci)、淋球菌(Gonococci)),鏈球菌屬(Streptococci)(綠色鏈球菌(Viridans)、溶血性和非溶血性鏈球菌(hemolytic?andnon-hemolytic)、B組和D組鏈球菌(group?B?and?D)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)),Chlostridia(產氣莢膜梭菌(perfringens)、肉毒梭菌(botulinum)),巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium),以及選自但不限于以下的不同革蘭氏陰性菌:不同的腸桿菌種(Enterobacter?spp),大腸桿菌(Escherichia?coli),克雷伯氏菌種(Klebsiella?spp),變形桿菌屬(Proteus),彎曲桿菌屬(Campylobacter),耶爾森氏菌屬(Yersinia),志賀氏菌屬(Shigella),沙門氏菌屬(Salmonella),嗜血桿菌屬(hemophilus)(流感嗜血桿菌(influenza)),擬桿菌屬(Bacteroides)(脆弱擬桿菌(fragilis)、雙道擬桿菌(bivius)),假單胞菌屬(Pseudomonas)(銅綠假單胞菌(aeruginosa)、洋蔥假單胞菌(cepacia)),軍團菌屬(Legionella)(嗜肺軍團菌(pneumophilia))。還包括不同的支原體種(mycoplasma)和假絲酵母種(Candida)以及不同的真菌。優選細菌的實例是革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性大腸桿菌、或革蘭氏陽性巨大芽孢桿菌。

本發明可用于在不同應用表面上防止或抑制由于定殖或感染而可引起問題的微生物生長。已表明對抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌(革蘭氏陰性大腸桿菌、或革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和巨大芽孢桿菌)是有效的。已描述了幾種與衛生保健部門和醫院環境中的導管定殖和感染有關的不同的微生物。這些微生物包括但不限于以下列出的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。還有不同的真菌也是常見的問題,特別是對于免疫抑制患者(經歷移植或其它的免疫抑制治療等)。在人工裝置(導管、trachiostomi管等)的感染、定殖或生物膜形成能在衛生保健中導致問題的情況下,可使用本發明。已知的或描述過的由導管具有的微生物和能用本發明對抗的微生物的實例為(但不限于):葡萄球菌(例如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和其它的凝固酶陰性葡萄球菌如腐生葡萄球菌);鏈球菌(例如綠色鏈球菌、溶血性和非溶血性鏈球菌、B組和D組鏈球菌、肺炎鏈球菌);腸球菌(Enterococcus?spp),糞鏈球菌(S.facealis);Chlostridia(產氣莢膜梭菌、肉毒桿菌);不同的腸桿菌,如大腸桿菌、克雷伯氏菌(肺炎)、陰溝腸桿菌(Enterobacter?cloace)、產氣菌、變形桿菌屬、(奇異變形桿菌(mirabilis))、彎曲桿菌屬、耶爾森氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、嗜血桿菌屬(流感嗜血桿菌)、奈瑟氏菌屬(腦膜炎球菌、淋球菌)、擬桿菌屬(擬桿菌和梭桿菌(fusobacterium))、假單胞菌屬(綠膿桿菌、洋蔥假單胞菌)、軍團菌屬(嗜肺軍團菌)、粘質沙雷氏菌(Serratiamarcenens)、不動桿菌(Acinetobacter?spp)、摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)、檸檬酸桿菌(Citrobacterspp)、棒狀桿菌(Corynebacterium?spp)、Burkholder?Cepafia、不動桿菌(Acinetobacter?spp);不同的支原體(雞毒支原體(M.avian)等);還有真菌例如假絲酵母、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)、新型隱球菌(Cryptococcus?neoformans)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、Tricosporun、芽裂霉屬(Blastoschizomyces)、嗜麥芽窄食假單胞菌(Stenotrophomonas?maltophilia)、馬拉色菌屬(Malassezia)、Bukholderia?cepafia、曲霉屬(Aspergillus)。

在本發明的很多應用中,所述基底為選自以下的裝置、設備和/或表面的一部分:(a)醫療裝置,所述醫療裝置例如為可用于人或動物體的外部的體外醫療裝置、或可用于人或動物體內部的體內醫療裝置,(b)食品裝置,和(c)其它裝置。以下列出的應用實例僅意在表明本發明的潛力而不是以任何方式的限制。

醫療裝置(a)包括選自以下的應用:

-人工皮膚或燒傷傷口覆蓋物(covering?for?burning?wounds)

-透析(往來透析裝置的管道)

-耳引流(從空腔、傷口或膿腫或在耳內部的引流)

-耳植入物(在耳內部的植入物)

-助聽裝置(內部放置的聽覺裝置)

-心肺機管道(往來心肺機裝置的管道)

-腦水腫引流(從腦區域/腦室的引流)

-注射器(一次性注射器)

-造口術(stomis)(造口裝置((stomi?devices))

-縫合材料(縫合裝置)

-傷口護理(傷口護理裝置,如硬膏)

-導管(一次性和永久導管裝置,例如中心靜脈導管(CVC)、外周靜脈導管(PVC)、經外周插入中心的導管(peripherally?insertedcentral?catheters)、導尿管、和腹膜導管)

-牙科產品(植入口腔區域的產品)

-體內植入物(骨、pro?paradontit(植入口腔區域的產品))

-胰島素泵(進出胰島素泵的管道)

-神經導向(神經的導向裝置)

-起搏器(起搏器及其周圍裝置)

-術后引流(手術后的引流裝置)

-從人體內的區域和/或器官和空腔引流(膿腫、腎造口(nephrostomi)或類似的)

-體內/腔內支架(用于保持不同腔開放的支架,例如在血管系統和脈管內、在器官和組織內、在腸系統、膽道等內部)

-用于液體、溶液、輸注、藥物遞送的胃腸外給藥的管道或設備。食品裝置(b)包括選自以下的應用:

-新鮮食品的接觸表面或用于食品處理的基底或裝置(可能與細菌源接觸的表面)

-藥品包裝(以保持開口無菌)(敏感藥品的包裝)

-擠奶裝置(在擠奶操作中遭受細菌源的裝置)

-噴灑器裝置(可定殖微生物的噴灑器裝置及其它水傳送裝置,例如食品店中的嘴(mouthpiece))

-漁業中的軋輥鋼(用于漁業中以增強魚產品生產的軋輥)。包含選自以下應用的各種裝置:

-隱形眼鏡(普通隱形眼鏡)

-眼內透鏡

-化妝品包裝品(不同化妝品產品的包裝)

-水箱(容納自來水或再循環水的水箱)

-水管(運輸自來水或再循環水的管道)

-空調、空氣和水冷卻裝置,

-其它用于儲藏產品或材料的裝置,其中儲藏材料表面上的細菌生長是不希望的。

在所有這些應用中,如上所討論的,本發明的抗微生物劑偶聯到所述裝置表面上,以賦予抗微生物作用。

在一個優選的實施方案中,所述抗微生物劑偶聯到導管表面,由此提供能防止微生物生長和/或增殖的導管。通常所述導管的內表面和外表面涂敷有本發明的試劑。可進一步在導管的擠出期間或其后、或者在組裝該特定的導管之前或之后作為單獨的步驟引入所述涂層處理的導管表面。對于處理過的導管樣品而言,在環境條件下存放數年之后仍保留該微生物效應。導管通道的供應商提供可用于本發明的導管,例如Rehau、Habia、Vygon、Teknofluor、Optinova、Baxter等。

在另一方面,本發明涉及用于使用抗微生物劑處理表面的部分的試劑盒,其包括:(a)權利要求1的抗微生物劑的前體,該前體具有下式:

Z-L-S-S-(半胱氨酸部分)

其中L、m和半胱氨酸部分如上定義,Z為如上定義的配體官能團并其能與如上定義的化學化合物Y?反應給出化學化合物X,如上定義的;(b)用于將所述前體共價鍵結合到表面的必需試劑,其中所述試劑盒還包括使用該試劑盒的說明。必需試劑可包含進行Y和Z的偶聯反應以得到X所必需的任何試劑(如上所概述),并將取決于Y和Z的特定種類。本領域技術人員會知道在每種情況下何種試劑會是必需的。

因此,提供了試劑盒,其能與本發明的抗微生物劑一起用于處理任何所需表面,以給予所述表面抗微生物性質。

具體實施方式

現將通過實施例的方式對本發明做進一步闡述。這些實施例僅是說明性目的,不應以任何方式看作是對本發明范圍的限制。

實施例部分

方法

對修飾表面上微生物生長的抑制分析

菌株

采用三種不同的菌株進行以下的分析(但應用不限于這些):革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(臨床分離物B5381)、革蘭氏陽性巨大芽孢桿菌(菌株Bm?11)、革蘭氏陰性大腸桿菌(菌株D21)的臨床分離物(來自患有膿毒癥的患者)。選擇的細菌既含有革蘭氏陽性菌又含有革蘭氏陰性菌,其包含了那些引起明顯臨床問題的細菌。

制備細菌培養物以測定滴度

以下描述目的在于(但不限于)測定不同細菌培養物的約400000-800000cfu/ml的滴度,所述細菌培養物用作暴露源以評價對功能性表面上細菌生長的抑制。將特定的菌株接種到LB培養基(Luria?Bertani肉湯)上,但不限于此培養基。一天前將選擇的菌株接種到選擇的培養基的瓊脂板上并允許在37℃生長過夜。從所述板上刮取幾個菌落并用于接種該培養基,隨后允許其生長到0.4的光密度。用同樣的LB培養基將該培養物稀釋到約400000-800000cfu/ml的初始滴度。通過平板連續稀釋和在合適的稀釋中計數菌落測定細菌數。(作為一般參考,在平板上計數的合適細菌數為30-300)

片的預處理

在選擇的情況下通過在以下材料中培養片來預處理片:

a)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)

b)胎牛血清(FCS)

c)無菌LB培養基

在不同的時間段進行所述培養:1h、1.5h、2.5h、過夜、2天或7天,如在以下實施例中所述的。通過在37℃于無菌eppendorf管中旋轉(200rpm)進行培養。

功能性表面暴露于不同菌株

將處于片狀的表面修飾的基底放置在無菌eppendorf管中。將每個片(直徑5或9mm)放入特定體積(分別為500或1000μl)的起始培養物中。將這些管以“管1”表示。通過旋轉(200rpm)在37℃培養在起始培養物中的片2.5小時。

平行地培養同樣體積的起始培養物作為參比樣品(以“培養后的培養物”表示)。使用此方法以確定當不暴露于所述片時,該起始培養物的滴度(將培養片的培養物)將生長至何種水平。用無菌LB培養基培養對照樣品(用于比較抑制水平的同樣的片),隨后以同樣方式處理,作為排除污染的陰性對照。

在功能性表面上活細菌附著分析的測定

培養(在現在描述的情形下:2.5小時)之后,使用無菌鑷子將片從每個管中取出。將在其中培養片的培養物平行地轉移入分離的無菌eppendorf管,如所述的測定其滴度。將鑷子和片浸入約4ml無菌PBS溶液的管中,然后將該片投入第二個具有PBS的管中,以“管2”表示。其后用無菌鑷子將此片從管2中取出。進行此操作以便排除源自在其中培養該片的細菌培養物的多余的細菌懸液滴,并因此除去任何不直接附著于所述片表面的細菌。

將清洗的片置于具有1ml?PBS的eppendorf管中(以“管3”表示),在渦旋振蕩器上強烈振搖10分鐘。附著的活細菌(其未在以前的步驟中除去)現將其從所述表面脫離進入該PBS溶液中。

將該溶液以“洗1”表示,并測定其滴度。

然后用無菌鑷子通過浸入具有約4ml無菌PBS的管中將該片取出,然后以如上所述的同樣方式將其投入另一個具有約2ml無菌PBS的管中。用無菌鑷子將該片迅速取出并轉移至一個新的eppendorf管,向其中加入1ml無菌PBS,并重復已描述過的渦旋步驟。

將此PBS溶液轉移到無菌eppendorf管(以“洗2”表示)并測定其滴度。

將此片暫時置于無菌Kleenex擦上以除去多余的洗2的滴,隨后將其置于LB培養基的無菌瓊脂板上,在37℃培養過夜。監測細菌菌落的外觀、圍繞所述片邊緣的細菌生長。

測定不同培養物和清洗溶液中的細菌滴度

在LB培養基和選擇的稀釋劑中進行稀釋(參見下文),其中分析菌落并計數。

鋪展以下懸浮液的100μl體積的系列稀釋物:

1.在稀釋到培養培養物(OD約0.4)之前的初始培養物:

2.初始培養培養物(估計400000-800000cfu/ml);1∶100,1∶1000和1∶10000。

3.培養后的培養物(參比的和培養片的)1∶1000,1∶10000,1∶100000。

4.陰性對照(無初始細菌培養物的培養基)

5.洗1∶1∶10和1∶100。

6.洗2∶1∶1。

實施例1

將直徑為5mm的1mm厚的平坦試樣形狀的聚己內酯(PCL;UC?787)用脈沖發生器(6.5MeV/75Hz/4微秒/60mA)以1Mrad的劑量預輻照。然后如下所述可將此樣品按直接接枝或在接枝前保存于液氮中。

在輻照之后,可替代地在中間存儲于液氮中之后,將所述PCL樣品引入恒溫在30℃的丙烯酸(20重量%)和0.1重量%Mohr’s鹽的水溶液中。將所述溶液通過惰性氣體吹掃以除去氧,所述吹洗也起到攪拌作用。在丙烯酸溶液中2分鐘以后,用大量約30℃的自來水清洗所述樣品,并在隨后的表面修飾前保存于去離子水中。在室溫下,用特定量的0.01M的NaOH將大量具有總面積5cm2的樣品和未接枝的參比樣品沉積6小時。電位滴定后測得(1.8±0.2)×10-5摩爾COOH/cm2的表面濃度。

實施例2

在0℃混合各自的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(etylkarbodiimid)(EDC)和N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)(Sigma)在去離子水中的溶液,形成濃度分別為0.3M?EDC和0.075M?NHS的溶液。

在HEPES緩沖液(pH?7.4)中清洗根據實施例1的丙烯酸接枝的PCL樣品,并浸入20ml?EDC/NHS溶液中。通過振搖攪拌10分鐘后,在去離子水中漂洗樣品,并加入0.04M的2-(2-吡啶基二硫)-乙胺鹽酸鹽(hydroklorid)(PDEA)在0.1M硼酸鹽(borat)緩沖液(pH?8.5)中的溶液。攪拌15分鐘后將樣品在去離子水中漂洗并加入0.5M?L-半胱氨酸(Sigma)在0.1M甲酸鹽(format)緩沖液(pH?4.3)與1M?NaCl中的溶液。在用1MNaCl和去離子水清洗后,將樣品置于空氣中干燥并保存在干燥器中。用ESCA(XPS)進行的表面分析測定得到6.8原子%氮的值。

實施例3

根據實施例1,以2.5Mrad的劑量預輻照低密度聚乙烯(LDPE)的樣品。在50℃用丙烯酸接枝4分鐘之后,所有其他條件與實施例1的相同,檢測到(2.7±0.2)×10-5摩爾COOH/cm2的羧酸化值。以如實施例2中對PCL相同的方式,進行PDEA和L-半胱氨酸對丙烯酸接枝的LDPE的偶聯反應,并根據ESCA的表面分析,得到6.0原子%的氮的值。

實施例4

將外徑為2mm的聚氨酯導管切成20mm的長度,并根據實施例1以1Mrad的劑量預輻照。根據實施例2進行接枝。

實施例5

對胺功能性表面的偶聯將與實施例2的步驟相似。不同點在于PDEA中的胺基團被羧基基團代替,以得到2-(2-吡啶基二硫)-乙基羧酸(PDEC)。當使此化合物與表面上的胺基團反應時,在與所述胺表面反應之前分別用EDC/NHS活化所述羧基。然后將如實施例2進行隨后的與L-半胱氨酸的偶聯。

實施例6

根據實施例1和2制備參比表面,區別在于用EDC/NHS活化后,,L-半胱氨酸經由半胱氨酸內的胺基基團直接與羧基化的PCL表面偶聯,即排除了與PDEA的偶聯步驟,從而消除了當與PDEA偶聯時得到的二硫鍵,如在實施例2中所述的。

實施例7

根據實施例1至3制備參比表面,不同點在于根據實施例2中描述的步驟,偶聯乙酰基半胱氨酸而不是L-半胱氨酸。

實施例8

根據實施例1至3制備參比表面,不同點在于根據實施例2中描述的過程,偶聯高半胱氨酸而不是L-半胱氨酸。

實施例9

對于偶聯有:

a)如實施例1和2中所述,與丙烯酸接枝的PCL偶聯的L-半胱氨酸(以“Cys-片”表示)

b)如實施例1中所述的,丙烯酸接枝的PCL的PCL片,在500μl?LB培養基中用片檢測對革蘭氏陰性細菌大腸桿菌(菌株D21)培養物的細菌生長的抑制。

所述培養物的初始滴度為513000cfu/ml,培養物(參比,無片)的培養后滴度為28000000cfu/ml。

與培養后的培養物(無片存在)相比,在培養期間培養Cys-片的培養物在培養基中顯示出125倍的生長抑制。與培養后的培養物(無片存在)相比,在培養丙烯酸片的培養物中未觀察到抑制。

對于附著細菌的測試,通過分析活細菌對片的附著性,與僅有丙烯酸的片相比,Cys-片顯示出對活細菌數目的100倍的抑制。

對于僅有丙烯酸的片,觀察到置于LB瓊脂上的環繞片邊緣的細菌生長;對于Cys-片則未觀察到。

實施例10

在1000μl細菌培養物中用PE片測試了對在金黃色葡萄球菌(B5381,臨床分離物)培養物中細菌生長的抑制。

片的功能性表面為:

a)根據實施例3,偶聯到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(在PBS中預清洗/預培養1.5小時)

b)根據實施例3,偶聯到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(在PBS中預清洗/預培養2天)

c)根據實施例3,偶聯到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(在PBS中預清洗/預培養7天)

d)根據實施例3,丙烯酸接枝的片。

培養培養物的初始滴度為400000cfu/ml,培養后的滴度為10000000cfu/ml。

用預清洗1.5小時的Cys-片培養的培養物表現出25倍的細菌生長抑制;用預清洗7天的Cys-片培養的培養物表現出17倍的細菌生長抑制。

當測試細菌附著性時,預清洗2天和7天的Cys-片表現出為丙烯酸片約1/50的活細菌。

總之,認為由于cys-偶聯的抑制在至少7天時間是持續存在的。

實施例11

在1000μl?LB培養基中用聚乙烯(PE)片測試對在革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(B5381,臨床分離物)培養物中細菌生長的抑制。功能性表面為:

a)根據實施例3,偶聯到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(以″Cys-片″表示)

b)根據實施例3,丙烯酸接枝的片(以丙烯酸片表示)

c)根據實施例3,僅電子束輻照的片(以“EB片”表示)

分析了兩個平行的對照實驗,其中在培養基中溶解的L-半胱氨酸為50μg/ml和5μg/ml。

將起始培養物設定為所述測定方法中的10倍(超過4百萬cfu/ml),其允許以暴露給細菌的極值評價活細菌的附著效應。

與培養后的培養物相比,Cys-片培養物表現出1/8的生長。與培養后的培養物相比,EB片未表現出明顯的降低。

對于溶解的L-半胱氨酸的培養物,未發現抑制。

在細菌附著的分析中,與丙烯酸片相比,Cys-片顯示了1/25到1/40的附著活細菌,與EB片相比顯示了1/21到1/27的附著活細菌。

環繞所述片邊緣的細菌生長只在丙烯酸和EB片上見到。

Cys-偶聯對活金黃色葡萄球菌對所述片的附著的作用仍是明顯和顯著的,盡管系統被淬滅。

實施例12

在1000μl細菌LB培養基中用PE片檢測了對在大腸桿菌(菌株D21)培養物中細菌生長的抑制。測試的表面為:

a)根據實施例3,偶聯到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(以“Cys-片”表示)

b)根據實施例3和7,偶聯到丙烯酸接枝的片的N-乙酰基-半胱氨酸(以“乙酰基-Cys-片”表示)

c)根據實施例3,丙烯酸接枝的片(以“丙烯酸”片表示)

所有的片在PBS中預培養過夜。

培養物的起始滴度為1000000cfu/ml,培養物的培養后滴度(無片)為50000000cfu/ml。

在培養期間,與培養后的培養物(無片存在)相比,Cys-片在培養基中顯示出45倍的生長抑制。乙酰基-Cys-片在培養基中顯示出10倍的抑制。在存在丙烯酸片的培養物中,未檢測到抑制。

當研究細菌附著性時,Cys-片顯示出丙烯酸片1/70的活細菌而乙酰基半胱氨酸片顯示出丙烯酸片1/7的活細菌。

在所有丙烯酸片周圍均檢測到環繞所述片邊緣的細菌生長,在乙酰基-Cys-片周圍部分地檢測到環繞所述片邊緣的細菌生長,而在Cys-片周圍則未觀察到細菌。

實施例13

對于偶聯有:

a)根據實施例3,偶聯到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(以“Cys-片”表示)

b)根據實施例3和6,經由氨基基團偶聯到丙烯酸接枝的PE片上的L-半胱氨酸(以“氨基偶聯的Cys-片”表示)

c)根據實施例3,丙烯酸接枝的片(以“丙烯酸片”表示)的片,在1000μl細菌培養物中用PE片測試對在大腸桿菌(菌株D21)培養物中細菌生長的抑制。

所有的片在無菌LB培養基中預培養過夜。

培養物的起始滴度為680000cfu/ml,培養物的培養后滴度(無片)為32000000cfu/ml。

在培養期間,與培養后的培養物(無片存在)相比,Cys-片在培養基中顯示出26倍的細菌生長抑制。氨基偶聯的Cys-片和丙烯酸片在培養基中均未顯示出抑制。

當測試細菌附著性時,Cys-片顯示出丙烯酸片的1/100到1/140的附著活細菌,而氨基偶聯的Cys-片與丙烯酸片相比,未顯示出附著活細菌數目的減少。

對于所有氨基偶聯的片和丙烯酸片,在清洗程序后在LB瓊脂板上的分析,均檢測到環繞所述片邊緣的明顯的細菌生長,而對于Cys-片則未檢測到。

實施例14

通過極端細菌濃度,在1000μl?LB培養基細菌培養物中用PE片測試對在金黃色葡萄球菌(B5381,臨床分離物)培養物中細菌生長的抑制。

片上的功能性表面為:

a)根據實施例3,偶聯到丙烯酸接枝的片上的L-半胱氨酸(以“Cys-片”表示)

b)根據實施例3,偶聯到丙烯酸接枝的片上的高半胱氨酸(以“高半胱氨酸片”表示)

c)根據實施例3,丙烯酸接枝的片(以“丙烯酸片”表示)

培養物的起始滴度為4000000cfu/ml,培養物的培養后滴度(無片)為80000000cfu/ml。

與無片存在的培養后的培養物相比,Cys-片在培養基中顯示出13倍的生長抑制。高半胱氨酸片在培養基中顯示出20倍的抑制。

當在極端暴露條件下測試活細菌的附著性時,與丙烯酸片相比Cys-片顯示出約1/4到1/10的附著活細菌,而高半胱氨酸片與丙烯酸片相比顯示出1/2到1/4的活細菌。對于半胱氨酸和高半胱氨酸片而言均獲得了可檢測的效果,盡管在淬滅條件下。

實施例15

通過使用存放3年的表面修飾的導管,測試抗菌作用的長期持久性和穩定性。

用在1000μl?LB培養基細菌培養物中的聚氨酯導管Vygon(實施例4)測試了對在大腸桿菌D21培養物中細菌生長的抑制。這些半胱氨酸修飾的導管樣品與參比表面(根據實施例4,EB輻照的和丙烯酸接枝的)在環境條件下已存放3年。在進行該實驗之前,將這些導管(20mm長)切成兩半,得到10mm長的兩段。片上的功能性表面為:

d)根據實施例4,偶聯到丙烯酸接枝的Vygon導管上的L-半胱氨酸,以Cys-導管表示(在PBS中預清洗/預培養2小時)

e)EB輻照的Vygon導管(部分實施例1和實施例4)(在PBS中預清洗/預培養2小時)

當無導管樣品存在時,培養培養物的起始滴度為264000cfu/ml,培養后的滴度為52000000cfu/ml。

與無片的后-培養物相比,培養Cys-導管的培養物(預清洗2小時)顯示出34倍的細菌生長抑制。

與無導管的培養后的培養物相比,培養EB輻照的Vygon導管的培養物(預清洗2小時)(對照材料)不顯示出抑制。

當測試細菌附著性時,與EB輻照的Vygon導管相比,Cys-導管顯示出1/130的活細菌。

總之,延長產品的存放時間不決定性地影響表面修飾的抗菌性質。

實施例16

在800μl?LB培養基細菌培養物中,用聚氨酯導管表面測試了對在金黃色葡萄球菌(B5381,臨床分離物)培養物中的細菌生長的抑制。將片在PBS中預清洗1-5小時。將這些導管切成5×4mm的段,并根據實施例1以1Mrad的劑量進行預輻照。根據實施例2進行接枝。

片上的功能性表面為:

a)基本上按照在實施例1和2中描述的步驟制備PDEA-偶聯的丙烯酸接枝的樣品,并作以下改變:5分鐘的接枝時間和接枝后超聲浴清洗15分鐘。

b)按照在實施例2中描述的步驟,將在(a)中得到的PDEA樣品用于偶聯L-半胱氨酸。

對樣品(a)和(b)的抗菌作用進行比較以考察在偶聯所述半胱氨酸之前PDEA組分的可能的顯著影響。培養物的起始滴度為800000cfu/ml,培養物的培養后滴度(無片)為19000000cfu/ml。在樣品類型(a)和(b)之間沒有觀察到培養后滴度的不同。當測試活細菌附著性時,與PDEA-偶聯的丙烯酸樣品(a)相比,Cys-丙烯酸樣品(b)顯示出約1/35的附著活細菌。本實驗證明Cys-組分對于抗菌作用是必需的。

實施例17

在500μl?LB培養基細菌培養物中用聚氨酯(PUR)片測試了對在金黃色葡萄球菌(B5381)培養物中細菌生長的抑制。將這些樣品切成5×5mm的方片。

片上的功能性表面為:

(a)以1Mrad?EB輻照PUR樣品,并在35℃用丙烯酸接枝3分鐘,以溫的自來水和MilliQ水大量地清洗,其中包括超聲洗浴15分鐘,隨后根據在實施例1和2中描述的步驟,與PDEA偶聯最后與L-半胱氨酸偶聯。這些樣品以“PDEA-Cys”表示。

(b)按以下制備表面:使PDEA和等摩爾量的三乙胺與等摩爾量的丙烯酰氯(acryloylcloride)在干燥溶劑中反應。通過在乙醚(diethyleter)中沉淀而純化產品2-(2-吡啶基二硫)-乙基丙烯酰胺,此處以“PDEAm”表示,重復此步驟直到獲得無色澄清的濾液。真空下干燥此淺黃色產物。通過以氬氣吹掃10分鐘,將含有2.2mmol(0.5g)PDEAm和16.1mmol(1g)丙烯酸的5ml?MilliQ水中的溶液脫氣,并恒溫于35℃。將EB輻照的PUR樣品(a)從液氮儲器中取出并浸入該溶液中,其中所述氬氣流也用作攪拌裝置。在8分鐘后中斷所述接枝反應,以溫的自來水和MilliQ水充分地清洗樣品,所述清洗包括超聲洗浴15分鐘。根據在實施例1和2中描述的步驟偶聯L-半胱氨酸。在真空下干燥樣品。這些樣品以“PDEAm-Cys”表示。

在PDEA-Cys(a)和PDEAm-Cys(b)之間做比較。培養物的起始滴度為500000cfu/ml,培養后的培養物滴度(無片)為20000000cfu/ml。

與無片存在的培養物相比,PDEA-Cys(a)顯示出45倍的培養后滴度抑制。

與無片存在的培養物相比,PDEAm-Cys(b)顯示出50倍的培養后滴度抑制。

當使用上述方法測試活細菌附著性時,PDEA-Cys(a)和PDEAm-Cys(b)顯示出對活細菌菌落形成單位相等的抑制。在所述清洗程序結束后如在LB瓊脂板上分析的,對于任何所述樣品,都未檢測到環繞所述片邊緣的細菌生長。

實施例18

在LB培養基中的500μl細菌培養物中用PCL片測試了對在革蘭氏陽性巨大芽孢桿菌(菌株Bm?11)培養物中細菌生長的抑制。功能性表面為:

a)如在實施例1和2中,偶聯到丙烯酸接枝的PCL的L-半胱氨酸(以“Cys-片”表示)

b)如在實施例1中,丙烯酸接枝的PCL

培養物的起始滴度為292000cfu/ml,培養物的培養后滴度(無片)為9850000cfu/ml。

在培養期間,與對比的培養后的培養物(無片存在)相比,對于有Cys-片的管,在培養片的培養物中具有13.5倍的細菌生長抑制。與無片存在的對照相比,僅有丙烯酸的片在培養物中不顯示對細菌生長的抑制。

與丙烯酸片相比,Cys-片對活細菌附著性的測試顯示出1/10到1/13的活細菌。

在所述清洗程序結束并培養過夜后,當把所述片置于LB板上時,僅對于偶聯有丙烯酸的片發現環繞所述片邊緣的細菌生長。

實施例19

通過在來自健康血液提供者的外周血單核細胞(PBMC)中培養不同的功能性片測定了細胞毒性。

測試的樣品為:

a)Cys-片(實施例2)

b)丙烯酸片(實施例1)

c)電子束輻照的片(部分實施例1)

(以“EB片”表示)

d)對照細胞(在無任何片存在下培養)

分別在24、48和69小時后進行測定。

對所有的片類型和對照,在PBMC中培養18小時后,死亡細胞的數量為4%~7%,表明在Cys-片、丙烯酸片、EB片或在無任何片存在下培養的對照細胞之間沒有顯著的差別。不論片是否已在PBS中預洗過,都可看到此結果。

培養48小時以后,在未清洗的Cys-片和丙烯酸片中的死細胞部分為10%~15%。與無任何片存在的對照細胞相比,在清洗過的Cys-片、丙烯酸片、EB片之間,在死細胞數量上沒有明顯差別(5-6%)。

通過以促細胞分裂劑植物血球凝集素(PHA)刺激,研究了T細胞的增殖。將來自健康血液提供者的PBMC分離,以PHA(Sigma,St?Louise,MO,美國)刺激細胞,分三份進行。在刺激后2天將1μCi甲基-3H-thymedine(Amersham,LIFE?SCIENCE)以脈沖方式加入(pulsedwith)培養物。根據生產商的說明書,在第二天利用平板收割機(Harvester996,Tomtec,Hamden,Connecticut,USA)在過濾器上收獲細胞,并在自動計數器(1450MicroBeta?Trilux,WALLAC,Sweden?AB)上計數。結果以每分鐘計數表示(cpm)。在任何片類型和對照之間,在T細胞增殖上均未發現差別。

為考察源于PBMC的單細胞分化為巨噬細胞的能力是否受到暴露于不同類型片的負面影響,進行了以下測試。

將來自健康血液提供者的PBMC:s以在含有2mM?L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(Gibco?BRL,Grand?Island,NY)、10%AB血清的Iscove′s修飾的培養基中10-18×106細胞/ml的濃度涂布于petri皿(Primaria,Falcon,Becton?Dickinson)上,并在37℃培養過夜。在第二天除去未附著的細胞。大量地清洗培養物,通過加入24小時的分上清液(allo-supernatant)刺激富集單核細胞的細胞。如下制備分上清液(allosupernatant):混合來自不同血液提供者的PBMC:s并在Iscove′s完全培養基中培養24小時。其后,收集上清液,通過離心澄清并用于刺激單獨的單核細胞培養物。在刺激后2~3天,用Iscove′s培養基清洗該培養物,隨后在60%AIM-V培養基、30%Iscove′s修飾的培養基和10%AB血清中培養,并加入L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素(完全60/30培養基)。每3-4天將培養基更換為新鮮的完全60/30培養基。

在對照細胞或暴露于不同類型片的細胞之間,未發現顯著的差別,即在所有的Petri皿中均可見完好的或健康的巨噬細胞培養物。

實施例20

另外也通過將片放置于血瓊脂上或者恰在其頂部或者通過將所述片推入所述血瓊脂中測量不同片類型的溶血效應,而分析了細胞毒性。

測試的樣品為:

a)未清洗的Cys-片(實施例3)

b)以LB培養基預處理的Cys-片(實施例3)

c)以胎牛血清(FCS)預處理的Cys-片(實施例3)

d)Cys-導管Vygon(實施例4)

在37℃培養過夜后測量細胞溶解區的直徑。陽性對照位于每個血瓊脂板的中心。在檢查時,移開片并分析所述片位置的下面區域和周圍區域。

對于分析的片類型,根本不可檢測到沒有細胞溶解。

對于未清洗的Cys-片,從所述片邊緣的約4~5mm處可見黃色。對于預處理的片(或者用LB培養基或者用胎牛血清(FCS)),在所述片最接近邊緣處可注意到非常弱的顏色變化。

結論是Cys-片對于人血細胞沒有明顯的細胞毒性作用。

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