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一種甘蔗脫毒組培快繁的方法.pdf

關 鍵 詞:
一種 甘蔗 脫毒 組培快繁 方法
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摘要
申請專利號:

CN200710070957.3

申請日:

20070822

公開號:

CN101138321B

公開日:

20110330

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00,C12N5/04,A01G31/00 主分類號: A01H4/00,C12N5/04,A01G31/00
申請人: 浙江省農業科學院
發明人: 徐剛,汪一婷,牟豪杰,呂永平,陳劍平
地址: 310021 浙江省杭州市石橋路198號
優先權: CN200710070957A
專利代理機構: 杭州豐禾專利事務所有限公司 代理人: 沈伾伾
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200710070957.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種甘蔗脫毒組培快繁的方法,屬植物繁殖技術領域。包括如下步驟:取甘蔗的頂芽或腋芽為外植體,經愈傷組織誘導培養、植株分化培養、增殖培養、生根培養、病毒檢測后,大量繁殖脫毒組培苗。本發明的優點是:采用的外植體體積較大,操作容易;接種成活率高;脫毒簡便、快捷、徹底;月繁殖系數達5~10倍,速度快,適合工廠化育苗,可商品化生產。

權利要求書

1.?一種甘蔗脫毒組培快繁的方法,其特征在于按以下步驟進行:1)培養基的配制,包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為:(1)基本培養基:用MS培養基,白糖20~30g/L,瓊脂7~9g/L,pH5.6~5.8;(2)愈傷組織誘導培養基:MS中添加2,4-D?1~2mg/L和NAA?0.1~0.2mg/L;(3)分化培養基:MS中添加6-BA2.0~3.0mg/L和NAA?0.1~0.3mg/L;(4)增殖培養基:MS中添加6-BA0.5~1.0mg/L和NAA0.1mg/L;(5)生根培養基:1/2MS中添加NAA0.1~0.5mg/L;2)外植體的選取與滅菌:取甘蔗的頂芽或腋芽,經滅菌處理,作為脫毒組培用的外植體;3)愈傷組織誘導培養:將步驟2)滅菌處理后的頂芽或腋芽在無菌條件下,摘取其2~3mm的莖尖組織,接種在愈傷組織誘導培養基上,誘導形成愈傷組織;4)分化培養:將步驟3)誘導形成的愈傷組織移植至分化培養基分化出叢芽;5)增殖培養:將步驟4)分化的叢芽切成單株接種在增殖培養基上,再分化出叢芽;6)生根培養:將步驟5)增殖形成的叢芽切成單株接種在生根培養基中進行生根培養;7)移栽:當步驟6)的生根組培苗生長至3~5cm,根數5根以上時,移栽基質培養至成苗。2.?根據權利要求1所述的甘蔗脫毒組培快繁的方法,其特征在于:所述的培養基,包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為:(1)基本培養基:用MS基本培養基,白糖30g/L,瓊脂7g/L,pH5.8;(2)愈傷組織誘導培養基:MS+2,4-D1.5mg/L+NAA0.15mg/L;(3)分化培養基:MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.15mg/L;(4)增殖培養基:MS+6-BA0.75mg/L+NAA0.1mg/L;(5)生根培養基:1/2MS+NAA0.25mg/L。3.?根據權利要求1所述的甘蔗脫毒組培快繁的方法,其特征在于:所述的滅菌處理是將外植體先經75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用0.1%升汞溶液滅菌10~15min,最后用無菌水沖洗3~5次。4.?根據權利要求1所述的甘蔗脫毒組培快繁的方法,其特征在于:所述的移栽基質由泥炭:珍珠巖:蛭石按體積比3:1:2配制而成。

說明書

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技術領域

本發明涉及植物脫毒組培快繁技術領域,尤其涉及一種甘蔗脫毒組培快繁的方法。

背景技術

甘蔗花葉病害在浙江和福建等省廣泛發生已有多年,新葉呈現淺黃色斑駁或輕微的褪綠條紋,老葉呈現長條褪綠條紋或花葉,發病率很高,造成糖分和產量下降(約18%左右),種性也衰退,影響品質。

獲得無病毒植株的方法有多種,例如熱處理脫毒、莖尖培養脫毒和莖尖微嫁接脫毒以及組合方法。其中普遍采用的較好的方法是莖尖培養脫毒法,具體的步驟是:通過植物頂端分生組織切取莖尖(0.2mm以下分生組織),誘導產生幼芽,長成小植株得到脫毒苗。相關的技術已有許多的專利。例如,CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用莖尖作為外植體,經莖尖培養后得到脫毒苗的方法。但是這種莖尖分生組織脫毒法存在的問題是:要切取很微小的0.2mm以下莖尖分生組織,需在顯微鏡下操作,具有一定難度;而且,切取莖尖組織越小,成活率就越低,而切取莖尖組織偏大,又不能完全脫除病毒,同時容易造成污染;因此,生產上迫切需要一種更好的方法來滿足甘蔗脫毒組培快繁的需要。

發明內容

本發明目的是針對上述莖尖分生組織脫毒法所存在的操作難度大、成活率低等缺陷,提出一種以切取較大的甘蔗植株莖尖(2~3mm)為外植體,先誘導產生愈傷組織,再分化形成植株的方法,達到大量、快速、操作方便、脫毒徹底地繁殖甘蔗脫毒組培苗的目的。

本發明目的通過以下技術方案來實現:

一種甘蔗脫毒組培快繁的方法,按如下步驟進行:

1)培養基的配制,包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為:

(1)基本培養基:用MS培養基,蔗糖或白糖20~30g/L,瓊脂7~9g/L,pH5.6~5.8;

(2)愈傷組織誘導培養基:MS中添加2,4-D1~2mg/L和NAA0.1~0.2mg/L;

(3)分化培養基:MS中添加6-BA2.0~3.0mg/L和NAA0.1~0.3mg/L;

(4)增殖培養基:MS中添加6-BA0.5~1.0mg/L和NAA0.1mg/L;

(5)生根培養基:1/2MS中添加NAA0.1~0.5mg/L;

2)外植體的選取與滅菌:取甘蔗的頂芽或腋芽,經滅菌處理,作為脫毒組培用的外植體;

3)愈傷組織誘導培養:將步驟2)滅菌處理后的頂芽或腋芽在無菌條件下,摘取其2~3mm的莖尖組織,接種在愈傷組織誘導培養基上,誘導形成愈傷組織;

4)分化培養:將步驟3)誘導形成的愈傷組織移植至分化培養基分化出叢芽;

5)增殖培養:將步驟4)分化的叢芽切成單株接種在增殖培養基上,再分化出叢芽;

6)生根培養:將步驟5)增殖形成的叢芽切成單株接種在生根培養基中進行生根培養;

7)移栽:當步驟6)的生根組培苗生長至3~5cm,根數5根以上時,移栽基質培養至成苗;

8)病毒檢測:利用RT-PCR擴增技術,構建其基因組序列克隆,原核表達制備病毒特異性的抗血清,建立ELISA檢測技術進行甘蔗花葉病毒檢測。

所述的培養基進一步可改進為,包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為:

(1)基本培養基:用MS基本培養基,白糖30g/L,瓊脂7g/L,pH5.8;(2)愈傷組織誘導培養基:MS+2,4-D1.5mg/L+NAA0.15mg/L;(3)分化培養基:MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.15mg/L;(4)增殖培養基:MS+6-BA0.75mg/L+NAA0.1mg/L;(5)生根培養基:1/2MS+NAA0.25mg/L。

所述的滅菌處理是將外植體先經75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用0.1%升汞溶液滅菌10~15min,最后用無菌水沖洗3~5次。

所述的移栽基質是泥炭:珍珠巖:蛭石按體積比3:1:2配制而成。本發明的有益效果是:

1)本發明利用甘蔗的頂芽和腋芽為脫毒組培的外植體,由于莖尖培養時摘取其2~3mm長的莖尖組織,體積較大接種操作就較容易;接種成功率高達90%以上,而現有以脫毒為目的僅摘取0.2~0.3mm的莖尖組織,其培養接種成活率一般只有20%~40%;

2)本發明脫毒簡便、快捷,容易從2~3mm長的莖尖中誘導形成愈傷組織并分化出再生植株,解決了以往微型莖尖脫毒不徹底的問題;愈傷組織之所以能達到較好的脫毒效果,可能是因為愈傷組織中病毒的復制過程趕不上細胞增殖速度,將該脫毒組培苗經ELISA病毒檢測后,帶毒率為0(見試驗例),可解決病毒引起甘蔗種質退化問題,恢復其產量和品質;

3)本發明以切取較大的甘蔗植株莖尖(2~3mm)為外植體,先誘導產生愈傷組織,再分化形成植株的方法,可快速獲得大量脫毒組培苗,月繁殖系數達到5~10倍,適合工廠化育苗,可商品化生產。

具體實施方式

通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明,但本發明的內容并不局限于此。

實施例1(甘蔗的頂芽為外植體)

1)外植體的選取與滅菌:于6月~11月,取甘蔗的頂芽,經75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用0.1%升汞溶液滅菌10min,最后用無菌水沖洗3~5次,作為脫毒組培用的外植體;

2)基本培養基:用MS基本培養基,白糖20g/L,瓊脂9g/L,pH5.6;

3)愈傷組織誘導培養:在無菌條件下從步驟(1)滅菌后外植體中摘取2~3mm的莖尖組織,接種在MS+2,4-D1mg/L+NAA0.1mg/L的愈傷組織誘導培養基上,至誘導形成愈傷組織;

4)分化培養:將步驟(3)誘導形成的愈傷組織移植至MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L的分化培養基上誘導出叢芽;

5)增殖培養:將步驟(4)分化的叢芽切成單株接種在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培養基上,再分化出叢芽;

6)生根培養:將步驟(5)增殖形成的叢芽切成單株接種在1/2MS+NAA0.1mg/L的生根培養基中進行生根培養;

7)移栽:當生根組培苗生長至3~5cm,根數5根以上時,移栽入由泥炭:珍珠巖:蛭石按體積比3:1:2配制而成的基質中;

8)病毒檢測:利用RT-PCR擴增技術,構建其基因組序列克隆,原核表達制備病毒特異性的抗血清,建立ELISA檢測技術進行甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒的檢測。

實施例2:(以甘蔗的腋芽為外植體1)

1)外植體的選取與滅菌:于11月份,取甘蔗的腋芽,經75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用0.1%升汞溶液滅菌15min,最后用無菌水沖洗3~5次,作為脫毒組培用的外植體;

2)基本培養基:用MS基本培養基,白糖25g/L,瓊脂8g/L,pH5.7;

3)愈傷組織誘導培養:在無菌條件下從步驟(1)滅菌后外植體中摘取2~3mm的莖尖組織,接種在MS+2,4-D2mg/L+NAA0.2mg/L的愈傷組織誘導培養基上,誘導形成愈傷組織;

4)分化培養:將步驟(3)誘導形成的愈傷組織移植至MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L的分化培養基上誘導出叢芽;

5)增殖培養:將步驟(4)分化的叢芽切成單株接種在MS+6-BAl.0mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培養基上,再分化出叢芽;

6)生根培養:將步驟(5)增殖形成的叢芽切成單株接種在1/2MS+NAA0.5mg/L的生根培養基中進行生根培養;

7)移栽:當生根組培苗生長至3~5cm,根數5根以上時,移栽入由泥炭:珍珠巖:蛭石按體積比3:1:2配制而成的基質中;

8)病毒檢測:利用RT-PCR擴增技術,構建其基因組序列克隆,原核表達制備病毒特異性的抗血清,建立ELISA檢測技術進行甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒的檢測。

實施例3:(以甘蔗的腋芽為外植體2)

1)外植體的選取與滅菌:于11月份,取甘蔗的腋芽,經75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用0.1%升汞溶液滅菌10min,最后用無菌水沖洗3~5次,作為脫毒組培用的外植體;

2)基本培養基:用MS基本培養基,白糖30g/L,瓊脂7g/L,pH5.8;

3)愈傷組織誘導培養:在無菌條件下從步驟(1)滅菌后外植體中摘取2~3mm的莖尖組織,接種在MS+2,4-D1.5mg/L+NAA0.15mg/L的愈傷組織誘導培養基上,誘導形成愈傷組織;

4)分化培養:將步驟(3)誘導形成的愈傷組織移植至MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.15mg/L的分化培養基上誘導出叢芽;

5)增殖培養:將步驟(4)分化的叢芽切成單株接種在MS+6-BA0.75mg/L+NAA0.1mg/L的增殖培養基上,再分化出叢芽;

6)生根培養:將步驟(5)增殖形成的叢芽切成單株接種在1/2MS+NAA0.25mg/L的生根培養基中進行生根培養;

7)移栽:當步驟(6)生根組培苗生長至3~5cm,根數5根以上時,移栽入由泥炭:珍珠巖:蛭石按體積比3:1:2配制而成的基質中;

8)病毒檢測:利用RT-PCR擴增技術,構建其基因組序列克隆,原核表達制備病毒特異性的抗血清,建立ELISA檢測技術進行甘蔗花葉病毒和高粱花葉病毒的檢測。

試驗例:(病毒檢測)

對照材料:從田間采集的甘蔗病葉為材料。

處理材料:以實施例1獲得的組培苗為材料。

1)抗血清制備:

a)根據已報道的甘蔗花葉病毒(sugarcan?mosaic?virus,SCMV)、和高粱花葉病毒(sorghummosaicvirus,SrMV)的檢測已發表的序列設計相關病毒外殼蛋白表達引物;

b)擴增相關病毒外殼蛋白基因并構建原核表達質粒,在大腸桿菌中表達;

c)將目的蛋白與2×SDS上樣緩沖液按1:1(v/v)混合,煮沸變性后用12%的SDS聚丙烯凝膠電泳分離,電泳完畢后用0.25M?KCl溶液染色;

d)切下的目的蛋白條帶用適量1×SDS上樣緩沖液勻漿后,再用5-20%梯度的SDS聚丙烯凝膠電泳分離,電泳完畢后用0.25M?KCl溶液染色;

e)切下目的蛋白條帶免疫小鼠,共免疫4次,前3次間隔7天,第4次免疫3天后斷頭取血。

2)ELISA檢測技術:

a)包被:稱取病樣和健康對照各0.2g,分別加入包被液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液,pH9.6)各1mL研磨,6000rpm離心后包被96孔板,每孔100uL,4℃,12h;

b)封閉:加封閉液,每孔150uL,37℃孵育1h;

c)加一抗:加入適當稀釋的抗血清(ELISA緩沖液稀釋),37℃孵育2h;

d)加酶標二抗:加入1/5000的羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶(Sigma,ELISA緩沖液稀釋),37℃孵育2h;

e)加底物:1mg/mL的p-NPP(Sigma,溶于10%二乙醇胺,pH9.8),37℃黑暗中孵育,分別在40min、1h和2h測OD405值。

3)檢測結果如下表所示:

?處理檢測的結果對照陽性脫毒組培苗陰性

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