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人參皂苷混合物及其在作為植物生長調節劑中的應用.pdf

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人參 皂苷 混合物 及其 作為 植物 生長 調節劑 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201610949558.3

申請日:

20161026

公開號:

CN106538563A

公開日:

20170329

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N45/00,A01P21/00 主分類號: A01N45/00,A01P21/00
申請人: 中國中醫科學院中藥研究所
發明人: 黃璐琦,袁媛,劉娟,紀瑞鋒,張迎春,陳同
地址: 100700 北京市東城區東直門內南小街16號
優先權: CN201610949558A
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 代理人: 關暢;何葉喧
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610949558.3

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種人參皂苷混合物及其在作為植物生長調節劑中的應用。本發明保護的人參皂苷混合物A,由人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)?原人參三醇組成,所述人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)?原人參三醇的質量配比為1?2∶2?4∶3∶1?2。本發明保護的人參皂苷混合物B,由人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)?原人參二醇組成,所述人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)?原人參二醇質量濃度配比為1?3∶1?2∶2?3∶1。人參皂苷混合物作為植物生長調節劑,具有較好的研究潛能和應用前景。

權利要求書

1.一種人參皂苷混合物A,由人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)-原人參三醇組成,所述人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)-原人參三醇的質量配比為1-2∶2-4∶3∶1-2。2.權利要求1所述人參皂苷混合物A的應用,為如下(a1)-(a10)中的至少一種:(a1)調節植物根尖細胞增殖;(a2)促進植物根尖細胞增殖;(a3)調節植物根的生長;(a4)促進植物根的生長;(a5)調節植物對脅迫的抗性;(a6)提高植物對脅迫的抗性;(a7)調節植物對非生物脅迫的抗性;(a8)提高植物對非生物脅迫的抗性;(a9)調節植物對乙醇脅迫的抗性;(a10)提高植物對乙醇脅迫的抗性。3.一種產品,其活性成分為權利要求1所述的人參皂苷混合物A,所述產品的用途為為如下(a1)-(a10)中的至少一種:(a1)調節植物根尖細胞增殖;(a2)促進植物根尖細胞增殖;(a3)調節植物根的生長;(a4)促進植物根的生長;(a5)調節植物對脅迫的抗性;(a6)提高植物對脅迫的抗性;(a7)調節植物對非生物脅迫的抗性;(a8)提高植物對非生物脅迫的抗性;(a9)調節植物對乙醇脅迫的抗性;(a10)提高植物對乙醇脅迫的抗性。4.一種人參皂苷混合物B,由人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)-原人參二醇組成,所述人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)-原人參二醇質量濃度配比為1-3∶1-2∶2-3∶1。5.權利要求4所述人參皂苷混合物B的應用,為如下(b1)-(b4)中的至少一種:(b1)調節植物根尖細胞增殖;(b2)抑制植物根尖細胞增殖;(b3)調節植物根的生長;(b4)抑制植物根的生長。6.一種產品,其活性成分為權利要求4所述的人參皂苷混合物B,所述產品的用途為如下(b1)-(b4)中的至少一種:(b1)調節植物根尖細胞增殖;(b2)抑制植物根尖細胞增殖;(b3)調節植物根的生長;(b4)抑制植物根的生長。7.一種人參皂苷組合物,包括權利要求1所述的人參皂苷混合物A和權利要求4所述的人參皂苷混合物B。8.一種促進植物根生長的方法,包括如下步驟:使用權利要求1所述的人參皂苷混合物A處理植物。9.一種提高植物對乙醇脅迫的抗性的方法,包括如下步驟:使用權利要求1所述的人參皂苷混合物A處理植物。10.一種抑制植物根生長的方法,包括如下步驟:使用權利要求4所述的人參皂苷混合物B處理植物。

說明書

技術領域

本發明涉及生物技術領域,具體涉及一種人參皂苷混合物及其在作為植物生長調節劑中的應用。

背景技術

植物生長調節劑是在植物生長發育的某一時期及一定的環境條件下起到調節和控制植物代謝的作用的一類物種,在增強植物抗性、增產增收,提高品質等方面發揮了重要作用。傳統的植物生長調節劑主要指人工合成的植物激素類物質。近年來,農作物綠色生產、食品安全問題受到越來越多的關注,傳統植物生長調節劑在農藥、化肥、除草劑等方面應用過程中的慢性毒害問題也受到越來越多的關注,天然新型植物生長調節劑的開發利用迫在眉睫。

近年來,很多學者報道了植物次生代謝產物的化感及植物免疫作用,這些成分很可能具有開發為新型植物生長調節劑的潛力,在中藥中含有大量植物次生代謝產物,但相關領域的研究挖掘十分有限。

人參皂苷屬于三萜皂苷類化合物,為人參、西洋參主要活性成分之一。人參皂苷可分為三類:一為原人參二醇型(Panaxadial,PD),如單體皂苷Ra1-3、Rb1-3、Rc、Rd、Rg3、Rh2、20(S)-原人參二醇(Protopanoxadiol,PPD)等;二為原人參三醇型(Panaxatrio,PT),如Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、20(S)-原人參三醇(Protopanaxatriol,PPT)等;三為齊墩果烷型(Oleanane),如Ro、Rh3等。其中二醇型和三醇型皂苷占大多數。

發明內容

本發明的目的是提供一種人參皂苷混合物及其在作為植物生長調節劑中的應用。

本發明提供了一種人參皂苷混合物A,由人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)-原人參三醇組成,所述人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)-原人參三醇的質量配比為1-2∶2-4∶3∶1-2。

所述人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)-原人參三醇的質量配比具體可為1∶2∶3∶2。

所述人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)-原人參三醇的質量配比具體可為2∶4∶3∶1。

所述人參皂苷混合物A的用途為如下(a1)-(a10)中的至少一種:

(a1)調節植物根尖細胞增殖;

(a2)促進植物根尖細胞增殖;

(a3)調節植物根的生長;

(a4)促進植物根的生長;

(a5)調節植物對脅迫的抗性;

(a6)提高植物對脅迫的抗性;

(a7)調節植物對非生物脅迫的抗性;

(a8)提高植物對非生物脅迫的抗性;

(a9)調節植物對乙醇脅迫的抗性;

(a10)提高植物對乙醇脅迫的抗性。

本發明還保護人參皂苷混合物A的應用,為如下(a1)-(a10)中的至少一種:

(a1)調節植物根尖細胞增殖;

(a2)促進植物根尖細胞增殖;

(a3)調節植物根的生長;

(a4)促進植物根的生長;

(a5)調節植物對脅迫的抗性;

(a6)提高植物對脅迫的抗性;

(a7)調節植物對非生物脅迫的抗性;

(a8)提高植物對非生物脅迫的抗性;

(a9)調節植物對乙醇脅迫的抗性;

(a10)提高植物對乙醇脅迫的抗性。

本發明還保護一種產品,其活性成分為人參皂苷混合物A,所述產品的用途為為如下(a1)-(a10)中的至少一種:

(a1)調節植物根尖細胞增殖;

(a2)促進植物根尖細胞增殖;

(a3)調節植物根的生長;

(a4)促進植物根的生長;

(a5)調節植物對脅迫的抗性;

(a6)提高植物對脅迫的抗性;

(a7)調節植物對非生物脅迫的抗性;

(a8)提高植物對非生物脅迫的抗性;

(a9)調節植物對乙醇脅迫的抗性;

(a10)提高植物對乙醇脅迫的抗性。

本發明還保護一種人參皂苷混合物B,由人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)-原人參二醇組成,所述人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)-原人參二醇質量濃度配比為1-3∶1-2∶2-3∶1。

所述所述人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)-原人參二醇質量濃度配比具體可為1∶2∶2∶1。

所述所述人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)-原人參二醇質量濃度配比具體可為3∶1∶3∶1。

所述人參皂苷混合物B的用途為如下(b1)-(b4)中的至少一種:

(b1)調節植物根尖細胞增殖;

(b2)抑制植物根尖細胞增殖;

(b3)調節植物根的生長;

(b4)抑制植物根的生長。

本發明還保護所述人參皂苷混合物B的應用,為如下(b1)-(b4)中的至少一種:

(b1)調節植物根尖細胞增殖;

(b2)抑制植物根尖細胞增殖;

(b3)調節植物根的生長;

(b4)抑制植物根的生長。

本發明還保護一種產品,其活性成分為人參皂苷混合物B,所述產品的用途為如下(b1)-(b4)中的至少一種:

(b1)調節植物根尖細胞增殖;

(b2)抑制植物根尖細胞增殖;

(b3)調節植物根的生長;

(b4)抑制植物根的生長。

本發明還保護一種人參皂苷組合物,包括人參皂苷混合物A和人參皂苷混合物B。

所述人參皂苷組合物的用途為作為植物生長調節劑。

本發明還保護一種促進植物根生長的方法,包括如下步驟:使用人參皂苷混合物A處理植物。

本發明還保護一種提高植物對乙醇脅迫的抗性的方法,包括如下步驟:使用人參皂苷混合物A處理植物。

所述方法中,所述人參皂苷混合物A的使用濃度為10-200μg/mL。

所述人參皂苷混合物A的使用濃度具體可為10μg/mL。

所述人參皂苷混合物A的使用濃度具體可為50μg/mL。

所述人參皂苷混合物A的使用濃度具體可為100μg/mL。

所述人參皂苷混合物A的使用濃度具體可為200μg/mL。

本發明還保護一種抑制植物根生長的方法,包括如下步驟:使用人參皂苷混合物B處理植物。

所述方法中,所述人參皂苷混合物B的使用濃度為10-200μg/mL。

所述人參皂苷混合物B的使用濃度具體可為10μg/mL。

所述人參皂苷混合物B的使用濃度具體可為50μg/mL。

所述人參皂苷混合物B的使用濃度具體可為100μg/mL。

所述人參皂苷混合物B的使用濃度具體可為200μg/mL。

使用時,以上任一所述人參皂苷混合物A或人參皂苷混合物B可采用50%(體積百分比)乙醇水溶液溶解。

以上任一所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物可為傘形目植物。所述傘形目植物可為五加科植物。所述五加科植物可為人參族植物。所述人參族植物可為人參屬植物。所述人參屬植物具體可為人參。

本發明提供了一種人參皂苷混合物及其在作為植物生長調節劑中的應用。人參皂苷混合物通過調控植物不定根根長、分支及細胞增殖過程,從而達到調控植物生長、增強抗性的目的。人參皂苷混合物A可以顯著促進逆境下人參不定根根尖干細胞的分裂,以填補植物干細胞自我修復應用領域的空白,增強逆境下植物受損干細胞的快速恢復。人參皂苷混合物B能夠通過抑制植物不定根根尖分生區的分裂能力來抑制根長。人參皂苷混合物作為植物生長調節劑,具有較好的研究潛能和應用前景。

附圖說明

圖1為加入人參皂苷混合物A1后人參不定根根尖干細胞的增殖情況。

圖2為加入人參皂苷混合物A2第10天乙醇脅迫下人參不定根根長。

圖3為加入人參皂苷混合物A2第20天乙醇脅迫下人參不定根生長情況。

圖4為加入人參皂苷混合物B1后人參不定根生長情況。

圖5為加入人參皂苷混合物B1后人參不定根根尖干細胞的增殖情況。

圖6為加入人參皂苷混合物B2后人參不定根根長增長量。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明,但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結果取平均值。以下實施例中的人參皂苷混合物A、人參皂苷混合物B及人參皂苷單體均采用50%(體積百分比)乙醇水溶液溶解。

人參皂苷Rg1的分子式為C42H72O14,結構式如下:

人參皂苷Re的分子式為C48H82O18,結構式如下:

人參皂苷Rh2的分子式為C36H62O8,結構式如下:

人參皂苷Rb1的分子式為C54H92O23,結構式如下:

人參皂苷Rd的分子式為C48H82O18,結構式如下:

人參皂苷Rb3的分子式為C53H90O22,結構式如下:

20(S)-原人參三醇(PPT)的分子式為C30H52O4,結構式如下:

20(S)-原人參二醇(PPD)的分子式為C30H52O3,結構式如下:

人參皂苷Rg1:上海融禾生物科技有限公司,CAS號:22427-39-0。

人參皂苷Re:上海融禾生物科技有限公司,CAS號:51542-56-4。

人參皂苷Rh2:上海融禾生物科技有限公司,CAS號:78214-33-2。

人參皂苷Rb1:上海融禾生物科技有限公司,CAS號:41753-43-9。

人參皂苷Rd:上海融禾生物科技有限公司,CAS號:52705-93-8。

人參皂苷Rb3:上海融禾生物科技有限公司,CAS號:68406-26-8。

20(S)-原人參三醇(PPT):上海融禾生物科技有限公司,CAS號:34080-08-5。

20(S)-原人參二醇(PPD):上海融禾生物科技有限公司,CAS號:30636-90-9。

液體培養基甲:MS+0.5mg·L-1KT+1.0mg·L-12,4-D。

固體培養基甲:MS+0.5mg·L-1KT+1.0mg·L-12,4-D,7g·L-1瓊脂粉。

Click- EdU Alexa647 Imaging Kit:Life technologies,貨號:C10340)。

人參不定根:參考文獻:張儒,張變玲,謝濤,等.響應面法優化人參不定根中總皂苷的提取工藝[J].天然產物研究與開發,2015(4):726-731.;公眾可以從中國中醫科學院中藥研究所獲得。

實施例1、人參皂苷混合物的制備

一、人參皂苷混合物A的制備

1、將人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)-原人參三醇(PPT)按照1∶2∶3∶2的質量比混合,得到人參皂苷混合物A1。

2、將人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh2和20(S)-原人參三醇(PPT)按照2∶4∶3∶1的質量比混合,得到人參皂苷混合物A2。

二、人參皂苷混合物B的制備

1、將人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)-原人參二醇(PPD)按照1∶2∶2∶1的質量比混合,得到人參皂苷混合物B1。

2、將人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb3和20(S)-原人參二醇(PPD)按照3∶1∶3∶1的質量比混合,得到人參皂苷混合物B2。

實施例2、人參不定根的獲得

1、取人參種子,用70%(體積百分比)乙醇水溶液浸泡3min,然后用1%(體積百分比)次氯酸鈉浸泡30min,滅菌的去離子水洗三遍,將胚狀體從種子中轉移出來,并在含有1%(質量百分比)蔗糖的1/2MS固體培養基丙中25±2℃培養兩周(16h光照/8h黑暗)。

2、將步驟1培養的無菌苗的根切成1.0cm長,作為誘導人參不定根的外植體。將外植體在含3.0mg·L-1IBA的1/2MS(缺NH4NO3)固體培養基乙中25±2℃暗培養,培養4周后在外植體上形成了不定根,將這些不定根分離出來,繼代到含3.0mg·L-1IBA的1/2MS(缺NH4NO3)液體培養基乙中25±2℃暗培養。大約3周左右繼代一次,繼代4次后,不定根生長快速穩定,可作為后續的實驗材料使用。

實施例3、人參皂苷混合物A對人參不定根根尖干細胞增殖的促進作用

1、將實施例2得到的人參不定根接種于含有不同濃度實施例1制備的人參皂苷混合物A1的液體培養基甲中培養(人參皂苷混合物A1在培養體系中的濃度為0、10、50、100、200μg/mL),培養條件為轉速100r·min-1,(25±2)℃,暗培養3天,每個處理濃度3個平行樣品。

2、采用Click- EdU Alexa647 Imaging Kit試劑盒方法檢測步驟1處理的人參不定根根尖干細胞的增殖情況。使用雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察EdU及Hoechst 33342標記的人參不定根。EdU激發光為650nm,發射光為670nm,Hoechst 33342的激發光為350nm,發射光為461nm。增殖細胞的細胞核為紅色,其他細胞的細胞核為藍色。觀察紅色細胞核的發光范圍。結果如圖1所示。結果表明,加入人參皂苷混合物A1,不定根增殖細胞增加,可顯著性的增加不定根根尖干細胞數目。

3、采用等濃度的人參皂苷混合物A2替代人參皂苷混合物A1,按照步驟1、2進行實驗和檢測。結果表明,加入人參皂苷混合物A2,不定根增殖細胞增加,可顯著性的增加不定根根尖干細胞數目。

4、分別采用等濃度的人參皂苷Rg1或人參皂苷Re或人參皂苷Rh2或20(S)-原人參三醇(PPT)替代人參皂苷混合物A1,按照步驟1、2進行實驗和檢測。結果表明,加入等濃度的人參皂苷Rg1或人參皂苷Re或人參皂苷Rh2或20(S)-原人參三醇(PPT),不定根增殖細胞數目與不做任何處理的不定根相比無顯著性差異。

實施例4、人參皂苷混合物A對人參不定根抗性的促進作用

1、將實施例2得到的人參不定根接種于固體培養基甲中,(25±2)℃暗條件下培養20天。檢測第10天時各組人參不定根的根長,檢測第20天時人參不定根的生長及分支情況。每組設置3個平行樣本。

實驗組I:將實施例2得到的人參不定根接種于含有100μg/mL人參皂苷混合物A2和1μM乙醇的固體培養基甲中。

實驗組II:將實施例2得到的人參不定根接種于含有100μg/mL人參皂苷混合物A2和5μM乙醇的固體培養基甲中。

實驗組III:將實施例2得到的人參不定根接種于含有100μg/mL人參皂苷混合物A2和10μM乙醇的固體培養基甲中。

實驗組IV:將實施例2得到的人參不定根接種于含有100μg/mL人參皂苷混合物A2和50μM乙醇的固體培養基甲中。

實驗組V:將實施例2得到的人參不定根接種于含有100μg/mL人參皂苷混合物A2和100μM乙醇的固體培養基甲中。

實驗組VI:將實施例2得到的人參不定根接種于含有100μg/mL人參皂苷混合物A2和200μM乙醇的固體培養基甲中。

每個實驗組添加一組對照,對照組固體培養基甲中不含有人參皂苷混合物A2,含有等濃度的乙醇。

每個實驗組添加一組空白對照:空白對照組固體培養基甲中不含有人參皂苷混合物A2和乙醇。

第10天的檢測結果如圖2所示。第20天的檢測結果如圖3所示。結果表明,加入人參皂苷混合物A2可以增加乙醇脅迫下人參不定根的根長和分支,增加其抗逆性。

2、采用等濃度的人參皂苷混合物A1替代人參皂苷混合物A2,按照步驟1進行實驗和檢測。結果表明,加入人參皂苷混合物A1可以增加乙醇脅迫下人參不定根的根長和分支,增加其抗逆性。

3、分別采用等濃度的人參皂苷Rg1或人參皂苷Re或人參皂苷Rh2或20(S)-原人參三醇(PPT)替代人參皂苷混合物A2,按照步驟1進行實驗和檢測。結果表明,加入等濃度的人參皂苷Rg1或人參皂苷Re或人參皂苷Rh2或20(S)-原人參三醇(PPT),人參不定根的根長和分支與空白對照相比無顯著性差異。

實施例3和實施例4的結果表明,人參皂苷混合物A可以顯著增加植物根尖干細胞數目,提高在乙醇脅迫下根的抗逆性,對植物生長具有正向調控作用。

實施例5、人參皂苷混合物B對人參不定根生長及不定根根尖干細胞的抑制作用。

1、將實施例2得到的人參不定根接種于含有不同濃度實施例1制備的人參皂苷混合物B1的固體培養基甲中培養(人參皂苷混合物B1在培養體系中的濃度為0、10、50、100、200μg/mL),(25±2)℃暗條件下培養20天,每個處理濃度3個平行樣品。檢測第20天時人參不定根的生長及分支情況,結果如圖4所示。

2、采用Click- EdU Alexa647 Imaging Kit試劑盒方法檢測步驟1處理的人參不定根根尖干細胞的增殖情況。使用雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察EdU及Hoechst 33342標記的人參不定根。EdU激發光為650nm,發射光為670nm,Hoechst 33342的激發光為350nm,發射光為461nm。增殖細胞的細胞核為紅色,其他細胞的細胞核為藍色。觀察紅色細胞核的發光范圍。結果如圖5所示。

結果表明,加入人參皂苷混合物B1可以顯著降低不定根的根長和分支,抑制根尖細胞的增殖,顯著性的降低不定根根尖干細胞數目。

3、采用等濃度的人參皂苷混合物B2代替人參皂苷混合物B1,按照步驟1、2進行實驗和檢測。結果表明,加入人參皂苷混合物B2可以顯著降低不定根的根長和分支,抑制根尖細胞的增殖。

4、分別采用等濃度的人參皂苷Rb1或人參皂苷Rd或人參皂苷Rb3或20(S)-原人參二醇(PPD)替代人參皂苷混合物B1,按照步驟1、2進行實驗和檢測。結果表明,加入等濃度的人參皂苷Rb1或人參皂苷Rd或人參皂苷Rb3或20(S)-原人參二醇(PPD),人參不定根的根長及根尖細胞增殖情況與不做處理的人參不定根相比無顯著性差異。

實施例6、人參皂苷混合物B對人參不定根生長的抑制作用。

1、將實施例2得到的人參不定根接種于含有不同濃度實施例1制備的人參皂苷混合物B2固體培養基甲中培養(人參皂苷混合物B2培養體系中的濃度為0、10、50、200μg/mL),(25±2)℃暗條件下培養3天,每個處理濃度3個平行樣品。檢測第3天時人參不定根的增長情況,結果如圖6所示。

結果表明,與不加入人參皂苷混合物B2(CK)相比,加入人參皂苷混合物B2可以抑制人參不定根的生長。

2、采用等濃度的人參皂苷混合物B1替代人參皂苷混合物B2,按照步驟1進行實驗和檢測。結果表明,人參皂苷混合物B1可以抑制人參不定根的生長。

3、分別采用等濃度的人參皂苷Rb1或人參皂苷Rd或人參皂苷Rb3或20(S)-原人參二醇(PPD)替代人參皂苷混合物B2,按照步驟1進行實驗和檢測。結果表明,加入等濃度的人參皂苷Rb1或人參皂苷Rd或人參皂苷Rb3或20(S)-原人參二醇(PPD),人參不定根的根長與不做處理的人參不定根相比無顯著性差異。

實施例5和實施例6的結果表明,人參皂苷混合物B可以顯著抑制植物根尖干細胞的生長,降低根長的生長速度,對植物生長具有負向調控作用,具有開發成為新型除草劑的潛能。

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