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靈芝酸A在制備防治丙型肝炎病毒藥物中的應用.pdf

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靈芝 制備 防治 肝炎 病毒 藥物 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201510141041.7

申請日:

2015.03.27

公開號:

CN104771404A

公開日:

2015.07.15

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/575申請日:20150327|||公開
IPC分類號: A61K31/575; A61P31/14; A23L1/30 主分類號: A61K31/575
申請人: 金華壽仙谷藥業有限公司
發明人: 李振皓; 李明焱; 王瑛; 陳海生; 朱勇喆; 戚中田
地址: 321200浙江省金華市武義縣商城路10號
優先權:
專利代理機構: 杭州天正專利事務所有限公司33201 代理人: 黃美娟; 王兵
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510141041.7

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2015.08.12|||2015.07.15

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種式(I)所示靈芝酸A的新的醫療用途,提供了靈芝酸A在制備治療或預防丙型肝炎病毒疾病的藥物中的應用,以及在制備抗丙型肝炎病毒的食品或保健品中的應用;

權利要求書

1.  一種式(I)所示的靈芝酸A在制備治療或預防丙型肝炎病毒疾病的藥物 中的應用;


2.
  一種式(I)所示的靈芝酸A在制備抗丙型肝炎病毒的食品或保健品中的 應用。

說明書

靈芝酸A在制備防治丙型肝炎病毒藥物中的應用
(一)技術領域
本發明涉及天然藥物化學及醫藥技術領域,具體涉及靈芝酸A(ganoderic acid A)在制備治療或預防丙型肝炎病毒疾病的藥物中的應用。
(二)背景技術
靈芝酸A(ganoderic acid A)是從栽培多孔菌科靈芝屬真菌赤芝子Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst得到的四環三萜類化合物,該化合物的結構已有報道(詳見:李單單,赤芝子實體的化學成分研究,中國化工貿易,2013;5:159-160;陳曼等,赤芝子實體的化學成分研究,時珍國醫國藥,2009;20(7):1771-1773)。
有報道靈芝三萜酸粗提物對急性肝損傷有一定的保護作用,其機制可能與其抗脂質過氧化作用有關(李鵬,靈芝三萜酸對小鼠急性肝損傷的保護作用,中國醫院藥學雜志,2013;33(23):1914-1918);
靈芝三萜對多種腫瘤細胞的生長和轉移都有抑制作用(Francisco Leon,et al.Novel Cytostatic Lanostanoid Triterpenes from Ganodermaaustrale.Helvetica Chimica Acta,2003;86(91):3088-3095);
靈芝三萜對四氯化碳(CCh)所致的小鼠肝損傷有預防和保護作用(李敏,靈芝三萜對小鼠肝損傷的預防和保護作用研究,現代中西醫結合雜志,2009;18(32):3933-3934);
靈芝三萜可明顯抑制CC14引起小鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的升高,試驗結束時,模型組ALT值為9658.5U/L,中、高劑量組分別為5899.2、3773.3U/L;模型組AST值為4962.8U/L,高劑量組為1999.9U/L,并能改善和恢復肝臟組織的病理指標。結論:靈芝三萜對由CC14引起的肝臟損傷有較好的保護作用(黃宗銹,靈芝三萜對化學性肝損傷保護作用研究,預防醫學情報雜志2010;26(11):928-930)。
至今未見靈芝中的四環三萜化合物靈芝酸A有抗丙型肝炎病毒作用的相關報道。
靈芝酸A的化學結構如下:

(三)發明內容
本發明的目的在于提供靈芝酸A的新的醫藥用途。
本發明采用如下技術方案:
本發明提供了式(I)所示的靈芝酸A在制備治療或預防丙型肝炎病毒疾病的藥物中的應用。

本發明還提供了式(I)所示的靈芝酸A在制備抗丙型肝炎病毒的食品或保健品中的應用。
本發明的有益效果在于:
1、本發明發掘了四環三萜類化合物靈芝酸A的新的醫療用途,開拓了一個新的應用領域。
2、經檢測,四環三萜類化合物靈芝酸A藥理作用強,預示著很好的藥用前景。
3、經檢測,四環三萜類化合物靈芝酸A具有顯著的抗丙型肝炎病毒(HCV)活性,可用于制備抗丙肝病毒的藥物,本發明為尋找抗丙型肝炎病毒的藥物提供了新的來源。
(四)具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明進行詳細說明。
實施例1靈芝酸A抗丙肝病毒試驗
1實驗藥物、試劑及材料
1.1化合物:靈芝酸A。
1.2細胞系Huh7,人肝癌細胞株(詳見:Y.M.Tong,Y.Z.Zhu,X.S.Xia et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,J.Virol,2011,85(6):2793-2802;Z.Jin,P.Gastaminza,G.F.Cheng et al,Robust hepatitis C virus infection in vitro,PNAS,2005,102(26):9294-9299.);細胞系293T,人胚腎細胞系(詳見:Y.M.Tong,Y.Z.Zhu,X.S.Xia et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,J.Virol,2011,85(6):2793-2802;F.L.Graham,J.Smiley,V.Russell et al,J.Gen.Virol 1977;36:59-74)。
1.3細胞培養液,配制,其含10%胎牛血清、0.03%谷氨酰胺、非必需氨基酸、氨芐青霉素和鏈霉素100U/ml,調pH至7.4。
1.4.細胞消化液,配制,其含0.25%胰蛋白酶,用磷酸緩沖液配制。
1.5 HCVcc:細胞培養的感染性丙型肝炎病毒(Y.M.Tong,Y.Z.Zhu,X.S.Xia et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,J.Virol,2011,85(6):2793-2802;Z.Jin,P.Gastaminza,G.F.Cheng et al,Robust hepatitis C virus infection in vitro,PNAS,2005,102(26):9294-9299.)。
1.6 HCVpp:HCV假病毒(Y.M.Tong,Y.Z.Zhu,X.S.Xia et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,J.Virol,2011,85(6):2793-2802;Z.Jin,P.Gastaminza,G.F.Cheng et al,Robust hepatitis C virus infection in vitro,PNAS,2005,102(26):9294-9299.)。
2實驗方法
2.1 HCVcc的制備
2.1.1病毒擴增: 
J6、JFH-1嵌合HCVcc(105ffu/ml),取50感染接種于24孔板的Huh 7細胞,次日換液,隨后根據細胞生長密度傳代培養,觀察細胞生長狀態,待病毒快速增殖導致的細胞病變效應(CPE)出現后,收集第7~20天的培養上清,取適量用于病毒滴度測定,其余8000rpm離心5min棄細胞碎片后分裝保存于-70℃備用。
2.1.2病毒滴定
以空白Huh7(1×104cells/孔),12h后,棄培養上清,每孔加入100μL經10倍梯度稀釋的HCVcc上清液,共孵育5h,換新鮮DMEM全培養液繼續培養72h,行免疫熒光法檢測HCV陽性細胞,一抗用1:100稀釋的HCV抗體陽性病人血清,二抗為1:100稀釋的FITC標記羊抗人IgG。在熒光顯微鏡下觀察發光細胞,并記錄最后一個可觀察到綠色熒光陽性細胞的孔內綠色熒光陽性細胞數及相應的稀釋梯度,計算出focus forming unit/ml(ffu/ml)數值,以此代表HCVcc滴度。
2.2 HCVcc感染性的檢測
取處于對數生長期的Huh7細胞,調整細胞濃度為1×105個/ml,取100μL種96孔板;培養24h后加入化合物及HCVcc,化合物按0.0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μg/ml濃度稀釋,37度培養4小時后去除化合物及HCVcc混液,換培養基繼續培養;48h后進行免疫熒光檢測,在熒光顯微鏡下讀取各孔HCVcc陽性克隆數。
2.3結果(見表1)
表1靈芝酸A對丙肝病毒(HCVcc)的抑制活性(%)

濃度(μg/ml) 0 0.1 1.0 10.0 50.0 100.0 抑制率(%) 0.00 1.90 23.45 50.55 91.28 98.26

由表2可見,靈芝酸A具有非常顯著抑制丙肝病毒(HCVcc)作用,說明該化合物具有抗丙型肝炎病毒作用。
3 HCVpp的制備及感染實驗
3.1將處于對數生長期的HEK293T細胞傳代接種于24孔板內,置于37℃5%CO2孵箱內培養過夜。
3.2觀察細胞生長狀況,待細胞50~70%匯合時,進行質粒轉染。將脂質體2μl以及小鼠白血病病毒gag質粒、報告基因—熒光素本科或綠色熒光蛋白表達質粒及HCV全長包膜蛋白表達質粒置于50μL opti-MEM培養液中,混勻,室溫放置20min.,吸除HEK293T細胞培養上清,加入3000μL opti-MEM培養液,再加入脂質體-質粒混合液,將細胞培養板置于孵箱內培養。6小時后吸除細胞培養上清,加入500μL含10%胎牛血清DMEM培養液,置于孵箱內培養48h,收集細胞培養上清,高速離心去除殘余細胞。
3.3將Huh 7.5細胞接種于96孔板內,貼壁后每孔加入50μL含HCVpp的培養上清,6h后換新鮮含10%胎牛血清DMEM培養液,繼續培養72h,裂解細胞檢測熒光素酶活性或于熒光顯微鏡下計數綠色熒光陽性細胞個數。
3.4 HCVpp感染性的檢測
取處于對數生長期的Huh7細胞,調整細胞濃度為1×105個/ml,取100μL種96孔板;培養24h后加入化合物及HCVpp,化合物按0.0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μg/ml濃度稀釋,培養4小時去除化合物及HCVpp混液,換培養基繼續培養;72h后在熒光顯微鏡下讀取各孔綠色熒光陽性細胞數。
3.5結果(見表2)
表2靈芝酸A對丙肝假病毒(HCVpp)的抑制活性(%)
濃度(μg/ml) 0.0 0.1 1.0 10.0 50.0 100.0 抑制率(%) 0.00 4.83 4.14 37.24 88.28 94.48

由表2可見,靈芝酸A具有顯著抑制丙肝假病毒(HCVpp)作用,說明靈芝酸A具有抗丙型肝炎病毒作用。
上述實驗結果表明,靈芝酸A具有顯著的抗丙型肝炎病毒活性,因此,可用于制備抗丙型肝炎病毒的藥物和保肝的藥物。
通過體外建立的細胞培養來源的丙型肝炎病毒(HCVcc)及單周期的假病毒顆粒(HCVpp)模型,利用HCV易感細胞人肝癌Huh7細胞系,對四環三萜類化合物靈芝酸A的抗HCV活性進行了體外實驗。結果發現,它具有顯著的抗HCV活性,尤其能抑制HCV入侵靶細胞。因此,該化合物靈芝酸A可用于制備抗丙肝病毒(HCV)的藥物。本發明為尋找抗丙型肝炎病毒藥物提供了新的來源。

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